ניתוח ספציפי לתת-סוג תא של פרוטאזום ממברנה עצבית בנוירונים סומטוסנסוריים

אנו חוקרים את המנגנונים של האופן שבו נוירונים סומטוסנסוריים מתקשרים דרך הממברנה העצבית שהתגלתה לאחרונה פרוטאזום (NNP) כדי לווסת את האופן שבו אנו חשים מגע, גירוד וכאב. לאחרונה גילינו את פרוטאזום הממברנה העצבית, קומפלקס פירוק חלבונים מיוחד שנמצא בחלק מהנוירונים החושיים, שתפקידם לווסת את הרגישות למגע, גירוד וכאב. בעזרת פרוטוקול זה, נוכל לחקור את דינמיקת הביטוי והאפנון של ה-NMP באופן ספציפי לסוג התא במצבי בריאות וחולי.

הפרוטוקול שלנו מאפשר בידוד של נוירונים המבטאים NMP מהנוירונים המבטאים שאינם NMP כדי להיות מסוגלים לחקור את תפקודם עם ספציפיות סוג התא. חשוב לציין, אוכלוסיות עצביות מבודדות אלה נשארות ברות קיימא לניתוחים במורד הזרם. בעזרת הפרוטוקולים האלה, נתחיל לחקור כיצד מצבים נוירופתיים שונים משפיעים על הביטוי והתפקוד של NMP, וכיצד זה תורם לשינוי בתחושת המגע, הגירוד והכאב.

כדי להתחיל, העבירו את גרעיני שורש הגב שנקטפו לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. בעזרת פיפטה, הוסיפו שבעה מיליליטר של תערובת אנזימים לדיסוציאציה של רקמות לצינור ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה למשך 20 דקות. הכניסו את הצינור לצנטריפוגה וסובבו את הגרעינים בחום של 120 גרם למשך שתי דקות.

שאפו בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לגלולה. השעו מחדש את הגרעינים בשבעה מיליליטר של תערובת אנזימים לדיסוציאציה של רקמות טריטורציה נמוכה עם פפאין. לאחר צנטריפוגה נוספת של הצינור, שאפו והשליכו את הסופרנטנט.

לאחר מכן השעו מחדש את הגרעינים ב-500 מיקרוליטר של תמיסת BSA, TI ו-DEM. בעזרת פיפטת מרעה מזכוכית מלוטשת אש של מיליליטר אחד, משולשת את הגרעינים 12 עד 16 פעמים. העבירו את מתלה התא דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר כדי לסנן פסולת סלולרית.

שטפו את המסננת עם מיליליטר אחד של תמיסת BSA, TI ו-DMEM כדי לאסוף את תאי העצב הנותרים של גרעיני השורש הגביים. העבירו את מתלה התאים המסונן לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. הכן מגש צביעה אימונופלואורסצנטי על ידי ריפוד בחתיכת פרפילם גדולה.

באמצעות מלקחיים סטריליים של 5-45, העבירו את החלקות הכיסוי מצלחת תרבית הרקמה אל הפרפילם, וודאו שהצד המכיל נוירונים של גרעיני שורש הגב פונה כלפי מעלה. פיפטה לאט 100 מיקרוליטר של גרעיני שורש גב על כל החלקת כיסוי כדי למנוע מהתאים להתייבש. לאחר מכן יש לדלל את הנוגדן העיקרי נגד PSM אלפא 2 במדיה חמה של גרעיני שורש הגב כדי להשיג דילול של 1 עד 20.

בעזרת שואב המצויד בקצה לא מסונן, הסר לאט את המדיה מקצה כל החלקת כיסוי. הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת הנוגדנים go anti PSM alpha two לכל החלקת כיסוי ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 40 דקות. לאחר מכן, שאפו בזהירות את תמיסת הנוגדנים העיקרית מכל החלקת כיסוי.

הוסף לתאים 100 מיקרוליטר PBS בטמפרטורת החדר ודגר בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות לשטיפה. כעת, כדי להכין את הנוגדן המשני נגד גו, יש לדלל אותו במדיה חמה של גרעיני שורש גב בדילול של 1 עד 250. לאחר השלמת הכביסה השלישית, הוסף 100 מיקרוליטר מתמיסת הנוגדנים המשנית המדוללת לכל החלקת כיסוי.

דגרו את החלקות הכיסוי בטמפרטורת החדר למשך 40 דקות תוך הגנה על התאים מפני אור. לאחר מכן שאפו את תמיסת הנוגדנים המשנית מהחלקות הכיסוי ושטפו את התאים שלוש פעמים, תוך שימוש ב-PBS כפי שתואר קודם לכן. לאחר שטיפת ה-PBS הסופית, הוסיפו 100 מיקרוליטר של תמיסה מקבעת המכילה 4%para formaldehyde, ו-4% סוכרוז ב-PBS.

לאחר הדגירה של התאים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, שאפו את הקיבוע מכל החלקת כיסוי. לאחר מכן שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS כפי שתואר קודם לכן. כדי לחדור את התאים, הוסף 100 מיקרוליטר של חומר ניקוי לא יוני 0.1% ב- PBS.

דגרו את החלקות הכיסוי בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן שאפו את התמיסה החדירה מהכיסוי ושטפו את התאים שלוש פעמים, באמצעות PBS כפי שתואר קודם לכן. הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת חסימה המורכבת מסרום בקר עוברי 5%, וסרום חמור 5% ב-PBS לכל החלקת כיסוי.

לאחר מכן, יש לדלל ארנב אנטי CGRP, A סלקטין B ארבע מצומד ביוטין ועוף אנטי NFH בתמיסת החסימה להכנת תערובת הנוגדנים הראשונית הספציפית לסוג תאי הגנגליון של שורש הגב. שאפו את תמיסת החסימה מהחלקות הכיסוי, ולאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטר מתערובת הנוגדנים הראשונית המוכנה לכל החלקת כיסוי. דגרו את החלקות הכיסוי בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות תוך הגנה עליהם מפני אור.

לאחר מכן, הסר את תמיסת הנוגדנים העיקרית מהחלקות הכיסוי ושטוף את התאים שלוש פעמים, באמצעות PBS כפי שתואר קודם לכן. כעת הכינו את תערובת הנוגדנים המשנית על ידי דילול סטרפטווידין, אנטי ארנב חמור ואנטי תרנגולת חמור לאחד עד 500 כל אחד בתמיסת חסימה. שאפו את שטיפת ה-PBS הסופית מכל החלקת כיסוי, ולאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטר מתמיסת הנוגדנים המשנית המוכנה.

דגרו את החלקות הכיסוי בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות בחושך. שאפו את הכביסה הסופית מהחלקת הכיסוי. בעזרת מלקחיים עדינים, הרם כל החלקה של הכיסוי מהפרפילם ונקה בעדינות את עודפי הנוזל על ידי נגיעה בקצה החלקה של הכיסוי לרקמה נטולת מוך.

הנח טיפה של שבעה מיקרוליטר של מדיום הרכבה על שקופית מיקרוסקופ. הורד בזהירות את החלקת הכיסוי על מדיום ההרכבה כשצד התא פונה כלפי מטה, והבטיח מגע מלא עם המדיום. הנח את השקופיות המוכנות במגירה יבשה כהה או בקופסה לייבוש למשך שעה לפחות.

אטמו את קצה החלקת הכיסוי עם לק ייבוש מהיר והמתינו 10 עד 15 דקות לפני ההדמיה. נוגדנים הניזונים מתאי עצב חיים של גנגליון שורש גבי חשפו תת-אוכלוסייה של נוירונים עם פרוטאזומים נגישים על פני השטח, בעוד שדגימות ביקורת חסרות נוגדנים ראשוניים לא הראו תיוג פני השטח. ציטומטריית זרימה זיהתה שתי אוכלוסיות נפרדות של נוירונים של גנגליון שורש גבי, בהתבסס על עוצמת הקרינה, המפרידות בין תאים חיוביים ל-NMP שליליים עם אזורי שער ברורים שהוקמו, באמצעות בקרות.

כימות האוכלוסיות הממוינות בזרימה הראה כי כ-4% מהנוירונים של גנגליון השורש הגבי היו חיוביים ל-NMP, בעוד שהרוב הנותר היו שליליים ל-NMP. נוירונים חיוביים ושליליים NMP ממוינים שמרו על כדאיות והביעו סמנים ספציפיים לסוג התא NFH, IB four ו-CGRP, המאשרים את התאמת זרימת העבודה לניתוח מולקולרי במורד הזרם.