תהליך עבודה מודולרי לניתוח כמותי, מבני ופונקציונלי של ביופילמים של לפטוספירה

אנו חוקרים ביופילמים כמבנים מגנים המאפשרים התמדה סביבתית ומאכסנת, ובוחנים את דינמיקת ההיווצרות, הרכב המולקולרי, תכונות הסתגלות ותרומתם לזיהום. שילוב של בדיקות ביולוגיות קריסטליות, הדמיית טקסט בזמן, מיקרוסקופיה קונפוקלית, מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת וטרנסקריפטומיקה במעבדות שלנו, מקדם את מחקר הביופילם באמצעות ניתוח משולב רב-ממדי. כדי להתחיל, גדלו תאי לפטוספירה בתווך EMJH בצינורות זכוכית עם קפיצה שטוחה עם קפה.

דגרו את התרביות בתנאים אירוביים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס מבלי לרעוד עד שהן מגיעות לשלב לוגריתמי אמצע. ודאו שהתרביות מגיעות לצפיפות אופטית בין 0.2 ל-0.4 ב-405 ננומטר, שזה שווה לשניים עד חמש פעמים עשר בעוצמה של שמונה תאים למיליליטר. באמצעות מיקרוסקופ שדה כהה בהגדלה של פי 20, ודאו שהתאים מודאליים ואינם מגושים.

מדלל את תרבית הפאזה הלא ריתמית המיומנת בטווח של 1 ל-100 במדיום EMJH טרי כדי לקבל בערך פי 10 לעוצמה של שישה תאים למיליליטר ולערבב בעדינות על ידי היפוך ללא מערבולת. כעת השתמש במלקחיים סטריליים כדי להניח ממברנת פוליקרבונט הידרופילית סטרילית בגודל 0.1 מיקרומטר שטוחה בתחתית כל באר בלוח באר סטרילי בגודל 24 בארות עם מכסה. הוסיפו מיליליטר אחד של מדיום EMJH סטרילי לכל באר והשרו את הממברנה לשעתיים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, הסר את תמיסת ההשריה מכל באר מבלי להזיז את הממברנה ומוסיפים 1.5 מיליליטר של תלייה חיידקית מדוללת, כדי להבטיח שהממברנה נשארת יציבה בתחתית. לאחר מכן, הניחו מגש מלא מים בתוך האינקובטור לשמירת הלחות. דגרו את הלוח בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס בתנאים סטטיים כדי לאפשר יצירת ביופילם.

להשאיר את הצלחת עד שלושה שבועות לזנים שגדלים לאט. בנקודת הזמן הרצויה, שאפו בזהירות כמה שיותר מדיום תרבית מבלי להפריע לביופילם. שטוף כל קרום בעדינות עם מיליליטר אחד של PBS סטרילי תוך שמירה על הממברנה שטוחה על התחתית.

הוסיפו מיליליטר אחד של אלדהיד 4% פרפורם ב-PBS לכל באר ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לקיבע את דגימות הביופילם. לאחר הדגירה, הסר את המקבע ושטוף בעדינות פעמיים עם מיליליטר PBS. הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת קריסטל סגול במשקל 0.1% בנפח לכל באר ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות, תוך כדי שמירה שהכיסוי שקוע לחלוטין.

לאחר מכן זרקו את צבע הסגול הקריסטלי מכל באר ושוטפים פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS. הטה את הצלחת ורוקן את כל הנוזלים שנותר. השאירו את הצלחת בטמפרטורת החדר לייבוש באוויר עד שהמצע נראה יבש לחלוטין, רצוי ללילה.

לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר של בופר אלוציאני, המורכב מ-50% אתנול ו-50% חומצה אצטית קרחונית בנפח לכל באר. פיפט למעלה ולמטה כדי להמיס לחלוטין את הכתם הקשור לביופילם. כעת, העבר 200 מיקרוליטר מכל דגימה למיקרופלטה אופטית שקופה של 96 באר.

מדדו את הספיגה ב-570 ננומטר והחסרו ערכי רקע מבקרות לא מחוסנות שעובדו בכל השלבים. רשום את הממוצע והסטיית התקן לפחות לשלושה שכפולים טכניים. השגת הביופילמים בלוחות באר כפי שהודגם קודם.

מוסיפים תמיסה של 4% אלדהיד פרפורם ו-1% גלוטראלדהיד בבופר נתרן מולרי של 0.2 ב-pH 7.4 לבארות. דגרו את הדגימות הקבועות למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הסר את הקיבסטיב ושוטף את הדגימה פעמיים עם PBS כדי לשמור על הביופילם המחובר על פני השטח תוך מזעור ההיפרדות.

כעת טבלו את הכיסוי ב-1% אוסמיום טטרוקסיד מדולל ב-PBS ודגרו במשך שעה כדי לשפר את הניגודיות במיקרוסקופ אלקטרוני סורק. לאחר מכן שטוף את המצע פעמיים עם PBS. ייבוש הדגימות על ידי הטבלה רציפה במשך 10 דקות כל אחת בסדרת אתנול מדורגת.

לאחר מכן, הוסיפו 500 מיקרוליטר של הקסמתילידיזילאזן ודגרו במשך חמש דקות. לאחר מכן החליפו ב-hexamethyldisilazane טרי ודגרו עוד חמש דקות. לאחר מכן, הסר את התמיסה העודפת ותן לדגימה להתייבש באוויר לחלוטין מתחת למכסה אדים.

כעת התקן את הדגימות היבשות על חלקי מיקרוסקופ אלקטרונים סורק באמצעות סרט פחמן מוליך דו-צדדי. מצפים את הדגימות בשכבה דקה, כ-10 ננומטרים של זהב או פלטינה, כדי לשפר את ניגודיות האלקטרונים להדמיה. לבסוף, טעינו את הקטעים המוכנים למיקרוסקופ האלקטרונים הסורק באמצעות מחזיק הדגימה המתאים.

פנו את התא ללילה אם אפשר כדי לשפר את איכות ההדמיה. לאחר מכן לצלם תמונות אלקטרונים משניות בעוצמה של חמישה עד 15 קילווולט באמצעות הגדלות מתאימות להמחשת מבנה האולטרה של הביופילם. לאחר 21 ימי דגירה, צביעת סגולת קריסטלית חשפה דפוסי ביופילם נראים לעין הן על מסנני פוליקרבונט והן על כיסויי זכוכית עבור לפטוספירה אינטרוגנים ולפטוספירה ביפלקסה.

כל מין מציג טביעות רגל אדריכליות מובחנות, כגון צורות נקודתיות, מסועפות או רשתיות. מדידות הספיגה ב-570 ננומטר אישרו שמירה גבוהה יותר של סגול גבישי בביופילמים של לפטוספירה בייפלקסה בהשוואה לאינטרווגנים של לפטוספירה בכל נקודות הזמן, מה שמעיד על הצטברות ביומסה גבוהה יותר בזן. מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת של ביופילמים של לפטוספירה אינטרווגנס תפסה משקעים מקדימים של מטריצות חוץ-תאיות בביופילמים בני שלושה ימים, פנים בסיסיות בוגרות ומתעלות עם מבנה תלת-ממדי ב-14 ימים ואיחוד מטריצות מפותח לחלוטין עם ארכיטקטורה צפופה במשך 21 ימים.

הפרוטוקול האופטימלי שלנו מסנכרן קריאות משלימות מתרבויות זהות, מעלה עמידות, מפחית שונות וחושף מידע דינמי ומבני הזמין בשיטות חד-פעמיות. על ידי שילוב ניתוח משלים, ממצאינו סטנדרטים את הערכת הביופילם, הבהירו את הדינמיקה והארכיטקטורה של לפטוספירה. הם מקשרים את המבנה לאלימות ומחזקים מחקר השוואתי שניתן לשחזר.

מוטנטים עתידיים שיקשרו את הרגולציה למורפולוגיה ודינמיקה של ביופילם, יבהירו את ההתמדה הסביבתית ויערכו אסטרטגיות שמפריעות למידע ביופילם או מקדמות פיזור.