שיטה מפושטת לטרנספורמציה בתיווך אגרובקטריום של Phytophthora palmivora

פרוטוקול זה מציע מערכת פשוטה, יעילה וניתנת לשחזור לטרנספורמציית פיטופתורה פאלמיבורה ופיטופתורה קפסיס. כדי להתחיל, קח לוחית LB אוגר חדשה עם אנטיביוטיקה. הוסיפו 20 מיקרוליטר של מדיום נוזלי LB למרכז הפלטה ואספו תאי אגרובקטריה מצלחת שגדלה בעבר באמצעות צינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי בנפח 1.5 מיליליטר.

באמצעות הבסיס התחתון והשטוח של הצינור, פזר את התאים באופן שווה על פני הצלחת. דגרו את הצלחת למשך הלילה בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך כ-16 עד 18 שעות. לאחר מכן, סורקים את תאי האגרובקטריה שגדלו במהלך הלילה באמצעות קצה פיפטה בנפח מיליליטר אחד.

החזירו את התאים למיליליטר אחד של מדיום השראה לאגרובקטרים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. כעת, העבר את התאים התלויים לצינור סטרילי בנפח 50 מיליליטר מכוסה בנייר אלומיניום והוסף מדיום השראה לאגרובקטריום. למדוד את הצפיפות האופטית של הדגימה ב-600 ננומטר ולדלל אותה עם מדיום השראה של אגרובקטרים כדי להגיע לצפיפות אופטית של 0.4.

לאחר מכן שחררו את מכסה הצינור המכוסה בנייר אלומיניום המכיל את המתלה החיידקי. הנח אותו על שייקר פלטפורמה עם ערבוב עדין במהירות של כ-70 סיבובים לדקה. הציפו לוח פיטופתורה פאלמיבורה בן שבעה עד שמונה ימים ב-10 מיליליטר מים מקוררים מראש ל-4 מעלות צלזיוס.

השתמש בקצה פיפטה כדי להקיש בעדינות על המשטח ולהסיר בועות אוויר מהמדיה. דגרו את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. ואז העבר לטמפרטורת החדר באור לעוד 15 דקות.

באמצעות פיפטה, העבירו בעדינות כ-7 עד 8 מיליליטר של זואוספורות משוחררות לצינור צנטריפוגה סטרילי בנפח 15 מיליטר, מבלי להפריע למיציליה ולספורנגיה. לאחר מכן העבירו 20 מיקרוליטר של מתלי הזוספור לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר, ומוסיפים 180 מיקרוליטר מים כדי לדלל את המתלים פי עשרה. מערבל את הצינור לדקה אחת כדי להתעקש על הזואוספורות והשתמש בהמוציטומטר תחת מיקרוסקופ כדי לספור את הזואוספורות.

הוסיפו חמישה מיליליטר של מתלה האגרובקטריה המוכנה לחמישה מיליליטר של מתלי הזוספור בצינור סטרילי מכוסה בנייר אלומיניום בנפח 50 מיליליטר. ערבבו בעדינות את התכולה, שחררו את מכסה הצינור, ותנו לה לעמוד בטמפרטורת החדר במשך שעתיים. במהלך הדגירה, הכינו את לוחות ה-AZCA.

לאחר שהמדיום מתמצק, מניחים חתיכה אחת של Hybond-N+ממברנה מעוטא על הלוח ושמרו על הפלטה בחושך. לאחר שעתיים של קו-אינקובציה, יש להשתמש בקצה פיפטה כדי לפזר 300 מיקרוליטר של התערובת על ממברנת Hybond-N+, כדי להבטיח שהשוליים יהיו חופשיים מהנוזל. השאירו את צלחות פטרי חשופות במכסה המנוע במשך כ-10 דקות כדי לאפשר לתערובת להתייבש באוויר.

ברגע שהנוזל מפסיק לזוז על הממברנה, כסה את הלוחות. דגרו את הלוחות המכוסים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בחושך למשך יומיים. לאחר 48 שעות של דגירה, השתמשו במלקחיים סטריליים כדי להעביר את ממברנת ההיבונד-N+הפוכה אל לוחית המקדח Plich מבלי לגרור אותה על פני פני המקדח.

השתמש בבסיס השטוח של צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר כדי ללחוץ ולהחליק בעדינות על פני הממברנה כדי להבטיח מגע מלא עם המדיום. בדוק את תחתית הצלחת אם יש בועות אוויר ולחץ בעדינות החוצה עם אותו בסיס שטוח. דגור את הצלחת בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס במחזור אור של 12 שעות ומחזור חושך של 12 שעות למשך יומיים עד שלושה.

לבסוף, לאחר יומיים-שלושה של דגירה, הסר את הממברנה באמצעות מלקחיים סטריליים והמשך דגירה של הפלטה בתנאי אור וטמפרטורה דומים. הדגירה המשותפת של Phytophthora palmivora zoospores עם agrobacterium tumefaciens EHA 105 המבטא pCB301TOR-GFP הניבה מושבות עמידות ל-G418 על מקדח Plich שהושלמו עם 30 מיקרוגרם למיליליטר G418, בעוד שלא הופיעו מושבות על לוחות ביקורת ללא זיהום אגרובקטריום. מספר הטרנספורמנטים העמידים ל-G418 לכל 10 להספק של שבעה זואוספורים היה 55 בניסוי הראשון ו-50 בניסוי השני.

מיקרוסקופ פלואורסצנציה אישר אות חלבון פלואורסצנטי ירוק ברור בטרנספורמנטים של פיטופטורה פאלמיבורה. בנוסף, פרוטוקול זה יושם על קפסיסי פיטופטורה כדי ליצור בהצלחה טרנספורמנטים המבטאים GFP. הפרוטוקול שלנו מאפשר לחוקרים לחקור את תפקודי הגנים, לקבוע מיקום תאי חלבונים ולעקוב אחר דינמיקת זיהום פתוגנים.

פרוטוקולים אלו עשויים לייצר אחוז נמוך של חיובים שגויים ולכן דורשים גישות נוספות לאישור הטרנספורמנטים האמיתיים. יישום מערכת הטרנספורמציה הזו יכול להיות מורחב גם לאומיצטים ופטריות אחרות. ננסה גם לפשט את הפרוטוקול הזה בעתיד.