שיטת האינטראקציה של כרומטין DNA-DNA המקושר ל-RNA

פיתחנו את שיטת האינטראקציה בין כרומטין ל-DNA-DNA, או שיטת RDD, למיפוי מגע כרומטין המאורגן על ידי מולקולות RNA ספציפיות. RDD ממפה באופן יציב את רצועות הכרומטין הספציפיות ל-RNA ואת האינטראקציה ארוכת הטווח בין RNA אנדוגני וחיצוני. כדי להתחיל, החזירו את כדור הגרעינים החדיר שמקורו בתאי Drosophila S2 הדו-מקושרים ב-15 מיליליטר של בופר פירוק 0.1% FA המכיל טריטון X-100.

אליקווט 1.5 מיליליטר של המתלה הגרעיני למבחנה עגולה תחתית בנפח 14 מיליטר, תוך הימנעות מהיווצרות בועות. סוניק את המתלה בעוצמה של 38% למשך 4.5 דקות באמצעות מחזורי הפעלה של 30 שניות ו-30 שניות כבוי. אסוף את הכרומטין הסוניקלי לצינור וצנטריפוגה של 15 מיליליטר ב-3,200 גרם למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.

העבר כ-13 מיליליטר של הסופרנטנט לצינור חדש בנפח 15 מיליליטר. כעת, הוסף 100 מיקרוליטר של חרוזי סטרפטווידין C1 מוכנים לצינור המכיל כרומטין סוניקייטד וסובב במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, מניחים את הצינור על מתקן מגנטי לדקה והעבירו את הסופרנטנט המכיל את הכרומטין הנקי מראש לצינור חדש בנפח 50 מיליליטר.

אחסן אליקו של 10 מיקרוליטר בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס לניתוח. דגרו 26 מיליליטר של בופר היברידיזציה טרי עם 13 מיליליטר כרומטין נקי מראש על סיבוב למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, מחלקים את תערובת ההיברידיזציה לשלושה צינורות של 15 מיליליטרים, ומוסיפים שישה מיקרוליטרים של גלאי ביוטינילציה של 100 מיקרומולר לכל דגימה.

לאחר איטום פקקי הצינורות עם סרט, סובבו את הצינורות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במהלך הלילה. לאחר חסימת חרוזי הסטרפטווידין C1, הסר את בופר החוסם ותשהה מחדש את החרוזים ב-400 מיקרוליטר של בופר היברידיזציה. כעת, הוסיפו את חרוזי סטרפטווידין C1 שטופלו בבופר לחסימה לכרומטין ההיברידי המתאים שהוכן קודם.

סובבו את התערובת במשך 2.5 שעות בטמפרטורת החדר. לאחר השלכת הסופרנטנט והעברת החרוזים לצינור של 1.5 מיליליטר, שטפו את החרוזים חמש פעמים עם 800 מיקרוליטר של בופר שטיפה ואז פעמיים עם בופר TE. לאחר השטיפה הסופית, השליכו את הסופרנטנט ותחזירו את החרוזים ל-1,000 מיקרוליטר של בופר TE המכיל מעכב פרוטאז פי 1 בטמפרטורת החדר.

לחסימת אתרים פנויים בחרוזי הסטרפטווידין C1 הקשורים לקומפלקס הפרוב-כרומטין, הוסיפו 220 מיקרוליטר של IPB מנוטר לחרוזים וסובבו את הצינור בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר הדגירה, שטפו את חרוזי הסטרפטווידין C1 חמש פעמים באמצעות בופר TE. לאחר מכן, הוסיפו 693 מיקרוליטר של תערובת תיקון קצה לכרומטין על חרוזי סטרפטווידין C1 וערבבו היטב.

לאחר מכן, הוסיפו שבעה מיקרוליטרים של פולימראז DNA של T4. דגרו את התערובת על תרמומיקסר במהירות של 800 סיבובים לדקה ו-12 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן דגרו את הדגימה במיקסר בטמפרטורה של 16 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

שטוף את החרוזים שלוש פעמים עם 800 מיקרוליטר של בופר ChIA-PET קרח ואז פעם אחת עם בופר TE. לאחר מכן, הוסיפו 693 מיקרוליטר של תערובת A-tailing לכרומטין על חרוזי סטרפטווידין C1 וערבבו היטב. לאחר מכן, הוסיפו שבעה מיקרוליטרים של קטע קלנוב, שלושה ראשוניים עד חמישה אקסונוקלאז ראשוני מינוס.

דגרו את הצינור במיקסר במהירות של 12 סיבובים לדקה ו-37 מעלות צלזיוס למשך 50 דקות. שטפו את החרוזים שלוש פעמים עם 800 מיקרוליטר של בופר ChIA-PET קר ופעם אחת עם בופר שחרור על ידי פיפטינג עדין. עכשיו, הוסיפו 1,390 מיקרוליטר של תערובת קשירת קרבה לכרומטין על חרוזי סטרפטווידין C1, ודגרו על מערבל בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

הוסיפו 10 מיקרוליטר של ליגז DNA T4 לתערובת ודגרו בסיבוב ב-20 סיבובים לדקה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות, ואז עברו ל-12 סיבובים לדקה בטמפרטורת החדר למשך 50 דקות והמשיכו את הדגירה בטמפרטורה של 16 מעלות צלזיוס במהלך הלילה. לאחר מכן, שטפו את החרוזים שלוש פעמים עם 800 מיקרוליטר של בופר ChIA-PET קר ואז פעמיים עם בופר TE. לשחרור כרומטין, הוסף 480 מיקרוליטר של בופר שחרור LC ChIP לכרומטין על חרוזי סטרפטווידין C1 וערבב היטב.

הוסיפו 20 מיקרוליטר של 20 מיליגרם למיליליטר פרוטינאז K לצורך דה-קרוס-קישור. דגרו את הצינור על תרמומיקסר במהירות של 950 סיבובים לדקה ו-65 מעלות צלזיוס במהלך הלילה, ואז טיהורו את ה-DNA הקשור לקרבה באמצעות תגובת אלכוהול פנול:כלורופורם:איזואמיל. הוסיפו את כל הרכיבים הנדרשים לבדיקת התיוג Tn5 בנפח תגובה כולל של 50 מיקרוליטר בצינור PCR על קרח.

דגרו את תגובת התייג בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בתרמוסיקלר עם המכסה מכוון ל-70 מעלות צלזיוס, ואז החזקו על ארבע מעלות צלזיוס. הוסיפו 50 מיקרוליטר של בופר שחרור ChIP ומיקרוליטר אחד של פרוטאנאז K ל-DNA המסומן. ערבבו את התמיסה ודגרו על תרמומיקסר בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס ו-900 סיבובים לדקה למשך 30 דקות.

לטהר את ה-DNA באמצעות ערכת טיהור DNA, ולכמת את ה-DNA באמצעות מערכת אלקטרופורזה קפילרית אוטומטית. הוסף את כל ה-DNA הקשור המקוטע לחרוזי M280 שנחסמו מראש עם בופר חוסם ו-DNA גנומי ומערבבים את התלוי. סובב את הצינור במיקסר בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות.

לאחר סיבוב קצר, מניחים את הצינור על מתקן מגנטי והשליכו את הסופרנטנט. לאחר שלבי הכביסה, הוסיפו 30 מיקרוליטר של בופר שחרור לחרוזים בלי לערבב. הכינו את תערובת ה-PCR לפי ערכת ההכנה של ספריית ה-DNA.

העבר את שפופרות ה-PCR למכונת PCR והגדר את תוכנית ההגברה. לבסוף, לאחר טיהור מוצר ה-PCR באמצעות חרוזים מגנטיים, יש למדוד 10 עד 30 ננוגרם של DNA ספרייה באמצעות כמת חומצה גרעין להכנת הדגימה לריצוף. קטעי כרומטין סוניקטוריים נעו בין כ-1,000 ל-3,000 זוגות בסיסים, מה שמעיד על פיצול מוצלח.

כרומטין מקושר ל-RNA הציג טווח גודל שבבים שנע בין כ-1,000 ל-3,000 זוגות בסיסים. כרומטין שסומן עם Tn5 הראה התפלגות קטעים המעידה על יעילות תיוג הכרומטין. ספריית הריצוף לאחר ההגברה הציגה התפלגות גודל מקטעים שנעה בין כ-180 ל-1,000 זוגות בסיסים.

לאחר בחירת הגודל, קטעי ספריית הרצף הועשרו בעיקר בטווח של כ-250 עד 600 זוגות בסיסים. אינטראקציה של DNA-DNA כרומטין הקשור ל-RNA, או שיטת RDD, זיהתה את מיקומי הגנום של קישור NC RNA roX2 ו-7SK, יחד עם לולאות האינטראקציה הכרומטיניות המרוחקות המתאימות. נתונים מ-RNA פולימראז II ChIA-PET מגלים קשר רגולטורי ברור בין RNA ה-NC הללו לביטוי גנים, כאשר שיאים מצביעים על עוצמת האינטראקציה.

ניתוח רב-ממדי הושג על ידי שילוב אינטראקציות מעוגנות RDD עם מפות קונפורמציה כרומטינית של הגנום High-C וסימנים אפיגנומיים, שעתוק ראשוני, ונתוני RNA פולימראז II ChIA-PET. באזורים אלו, דומיינים טופולוגיים הוצגו בבירור, כאשר לולאות כרומטין מונחות RNA ממוקמות לעיתים בגבולותיהם או חוצות מספר תחומים כאלה. בנוסף, נקבעו מרכזי רגולציה ממוקדי RNA.

שיטת RDD ואינטראקציות כרומטין מעוגנות חושפות אתרי קישור RNA ואינטראקציות קשורות ל-DNA-DNA בארגון הגנום התלת-ממדי. ההוראות המרכזיות הן שמירה על יחס תקין בין פרוב, לינקר וכרומטין וחסימת אתרי סטרפטווידין בלתי מוגבלים עם הביוטין הטבעי לפני קשירת פולימראז. מחקרים עתידיים יוכלו לחקור כיצד RNA מפעיל אינטראקציות כרומטין בין התפתחות, הפרעות וזיהומים.