ויזואליזציה וניתוח כמותי של הפעלת PARP1/PARP2 המושרת על ידי גנוטוקסין בתאים באמצעות מדווח מבוסס חלבון פיוז'ן פלואורסצנטי

המעבדה שלנו חוקרת מסלולי תיקון DNA ותגובת נזק תלויי PARP1 ו-PARP2 בתאים תקינים ושעברו טרנספורמציה. אתגר בתחום הוא ניתוח כמותי של הפעלת PARP1 ו-PARP2 בתאים תוך הימנעות מניתוק תאים. דבר זה מאפשר מחקרי לוקליזציה תת-תאית.

כדי להתחיל, הוסיפו 375 מיקרוליטר של סרום בקר עוברי ו-DMEM חופשי מפניצילין-סטרפטומיצין לצינור מיקרוצנטריפוגציה סטרילי בנפח 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, הוסיפו 10 מיקרוליטרים של תגובת טרנספקציה מבוסס שומנים וכל הפלסמידים הנדרשים לצינור. הקישו בעדינות את צינור המיקרוצנטריפוגציה כדי לערבב את המדיום, תגובת הטרנספקציה ו-DNA הפלסמיד.

דגרו בטמפרטורת החדר למשך 15 עד 30 דקות כדי לאפשר יצירת קומפלקס DNA ומגיב טרנספקציה. לאחר מכן, הוסף את תערובת הפלסמיד והמגיב לטרנפקציה בדרמטית לצלחת 60 מ"מ המכילה את תאי ה-293FT המתורבתים מבלי להסיר את המדיום ולהחזיר את התאים לאינקובטור למשך 48 שעות. לאחר מכן, לאסוף את מדיום התרבית מהתאים שעברו 293 רגל.

כדי לבודד את חלקיקי הלנטי-וירוס, סננו את המדיום שנאסף דרך מסנן סטרילי של 0.45 מיקרומטר כדי להפריד את שברי התאים מהחלקיקים הלנטיויראליים. לצורך טרנסדוקציה, יש לקבל את התאים הרצויים שמתרבים ל-24 שעות ולוודא שהמפגש בין התאים ל-20% עד 40%. לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של וירוס, מיליליטר אחד של מדיום גדילה ושני מיקרוליטרים של פוליברן לצינור קוני של 15 מיליטר, מעורבבים בעדינות באמצעות היפוך. עכשיו, הסר את מדיום הגידול מהצלחת בעלת שש הבאות.

הוסיפו את תערובת הווירוס, המדיום והפוליברן לכל באר. הניחו את התאים עם תערובת ההעברה באינקובטור המכיל אטמוספירה לחה בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך 16 עד 18 שעות. כדי לאמת את הביטוי של חומצות האמינו RNF146, 100 עד 182 EGFP, זרעים 200,000 תאים המבטאים LivePAR בכל צלחת תרבית המכילה כיסוי מחסה.

אפשר לתאים 24 עד 36 שעות להיצמד לכיסוי, לחדש את המדיום ולהתחיל לשכפל. לאחר מכן חשפו את התאים המבטאים את LivePAR למגבים הנתונים. הוסף את התרכובות ישירות למדיום המכיל את התאים שעל הכיסוי וסובב בעדינות את המדיום בכלי תרבית התאים כדי לחלק את התרכובות.

דגרו את הצלחות בגודל 60 מ"מ בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 עד 90 דקות. כדי לתקן את התאים, הסר את המדיום ושטוף אותם עם PBS. מקדים את התאים ב-4% פורמלדהיד ב-PBS למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר הסרת הפורמלדהיד, שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS. לאחר מכן, הוסיפו שלושה מיליליטר של מתנול קר ואצטון לתאים ביחס של 7:3 כדי לתקן אותם. הנח את הכלים בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס לתשע דקות.

לאחר מכן, הסר את תמיסת המתנול אצטון. לאחר שטיפת התאים שלוש פעמים עם PBS, פיפטה של 15 מיקרוליטר של מדיום אנטי-פייד המכיל DAPI על סלייד זכוכית. התקן בעדינות את הכיסוי על מדיום ההרכבה כשהתאים פונים פנימה, תוך מזעור בועות.

מרכז וקבע את הכיסוי על סלייד הזכוכית ואטום את הצדדים על ידי מריחת מעט אמייל ציפורניים שקוף על הקצוות. הנח את המחסניות בחושך כדי לאפשר לאמייל הציפורן להתייבש. לאחר ההורדה וההתקנה של Image J, פתח את Image J והתקן את קובץ הטקסט המקרו LivePAR_Macro על ידי לחיצה על Plugins, בחירת Macros ובחירת התקנה.

פתח את כל קבצי הקונפוקל בתמונה J ושמור אותם כקבצי TIFF כדי לשמור על הקבצים המקוריים. לאחר מכן, פתח מסמך גיליון אלקטרוני ושמור אותו כ-Date_CellLineFociAnalysis. נתח קובץ TIFF אחד בכל פעם.

לחץ 1 כדי למצוא את הגרעינים. כאשר חלון מנהל ה-ROI נפתח, בחר את כל הערכים ולחץ על Add כדי לשכב את אזור הגרעינים מעל התמונה המקורית. מחק גרעינים שזוהו בטעות והוציא גרעינים שאינם נמצאים במלואם במסגרת.

לאחר מכן, צייר את הגרעין באמצעות כלי Freehand Selection ולחץ על 2 כדי לכמת את מוקדי PAR. בחרו כל גרעין במנהל התשואה וספרו את מספר המוקדים לכל גרעין. העתק והדבק את הנתונים הכמותיים למסמך הגיליון הפתוח לאחר ציון כל הגרעינים בקובץ.

באופן דומה, חזור על הניתוח עבור כל קבצי TIFF. בסיום, יש לשרטט את מוקדי ה-PAR לכל גרעין בתוכנה המועדפת. תאי בקרת הרכב הראו כתמי EGFP פאן-תאיים.

תאים שטופלו בגנוטוקסין הראו הצטברות של מוקדי גרעין המייצגים מיקום בתוך הגרעין. טיפול מוקדם במעכב PARP1 וב-PARP2 וליפאריב הוביל לאובדן מוקדי PAR. כימות מספר מוקדי PAR לכל גרעין כפונקציה של זמן ותנאי טיפול הראה תוצאות דומות.

פרוטוקול זה מאפשר לנו לכמת את הפעלת ציר האיתות של PARP1 ו-PARP2 בתגובה לגנטוקסינים ולשינויים גנטיים שלאחר מכן. השתמשנו בטכניקות אימונופלואורסצנציה מסורתיות עם מבחן זה כדי לאמת קולוקליזציה של חלבונים עם פולי ADP-ריבוז. בהמשך, אנו משתמשים במבחן זה לבדיקות גנוטוקסיות לניתוח מהיר של מעכבי PARP1, PARP2 או PARP, ולזיהוי גורמים חדשים המעורבים באיתות PARP1 ו-PARP2.