ויזואליזציה וניתוח כמותי של הפעלת PARP1/PARP2 המושרת על ידי גנוטוקסין בתאים באמצעות מדווח מבוסס חלבון פיוז'ן פלואורסצנטי
17 באפריל 2026
כאן, אנו מתארים שיטה לוויזואליזציה מבוססת תאים, לוקאליזציה תת-תאית וניתוח כמותי של מוקדים מועשרים בפולי(ADP-ריבוז) (PAR) בתאי יונקים קבועים. מבחן זה מאפשר לכימות אתרים של הפעלת PARP הנגרמת מנזק DNA, כולל זה הקשור לתיקון כריתת בסיס או תיקון שבירה חד-גדילית, בגרעינים של תאים שנחשפו לגנוטוקסין.
המעבדה שלנו חוקרת מסלולי תיקון DNA ותגובת נזק תלויי PARP1 ו-PARP2 בתאים תקינים ושעברו טרנספורמציה. אתגר בתחום הוא ניתוח כמותי של הפעלת PARP1 ו-PARP2 בתאים תוך הימנעות מניתוק תאים. דבר זה מאפשר מחקרי לוקליזציה תת-תאית.
כדי להתחיל, הוסיפו 375 מיקרוליטר של סרום בקר עוברי ו-DMEM חופשי מפניצילין-סטרפטומיצין לצינור מיקרוצנטריפוגציה סטרילי בנפח 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, הוסיפו 10 מיקרוליטרים של תגובת טרנספקציה מבוסס שומנים וכל הפלסמידים הנדרשים לצינור. הקישו בעדינות את צינור המיקרוצנטריפוגציה כדי לערבב את המדיום, תגובת הטרנספקציה ו-DNA הפלסמיד.
דגרו בטמפרטורת החדר למשך 15 עד 30 דקות כדי לאפשר יצירת קומפלקס DNA ומגיב טרנספקציה. לאחר מכן, הוסף את תערובת הפלסמיד והמגיב לטרנפקציה בדרמטית לצלחת 60 מ"מ המכילה את תאי ה-293FT המתורבתים מבלי להסיר את המדיום ולהחזיר את התאים לאינקובטור למשך 48 שעות. לאחר מכן, לאסוף את מדיום התרבית מהתאים שעברו 293 רגל.
כדי לבודד את חלקיקי הלנטי-וירוס, סננו את המדיום שנאסף דרך מסנן סטרילי של 0.45 מיקרומטר כדי להפריד את שברי התאים מהחלקיקים הלנטיויראליים. לצורך טרנסדוקציה, יש לקבל את התאים הרצויים שמתרבים ל-24 שעות ולוודא שהמפגש בין התאים ל-20% עד 40%. לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של וירוס, מיליליטר אחד של מדיום גדילה ושני מיקרוליטרים של פוליברן לצינור קוני של 15 מיליטר, מעורבבים בעדינות באמצעות היפוך. עכשיו, הסר את מדיום הגידול מהצלחת בעלת שש הבאות.
הוסיפו את תערובת הווירוס, המדיום והפוליברן לכל באר. הניחו את התאים עם תערובת ההעברה באינקובטור המכיל אטמוספירה לחה בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך 16 עד 18 שעות. כדי לאמת את הביטוי של חומצות האמינו RNF146, 100 עד 182 EGFP, זרעים 200,000 תאים המבטאים LivePAR בכל צלחת תרבית המכילה כיסוי מחסה.
אפשר לתאים 24 עד 36 שעות להיצמד לכיסוי, לחדש את המדיום ולהתחיל לשכפל. לאחר מכן חשפו את התאים המבטאים את LivePAR למגבים הנתונים. הוסף את התרכובות ישירות למדיום המכיל את התאים שעל הכיסוי וסובב בעדינות את המדיום בכלי תרבית התאים כדי לחלק את התרכובות.
דגרו את הצלחות בגודל 60 מ"מ בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 עד 90 דקות. כדי לתקן את התאים, הסר את המדיום ושטוף אותם עם PBS. מקדים את התאים ב-4% פורמלדהיד ב-PBS למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר הסרת הפורמלדהיד, שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS. לאחר מכן, הוסיפו שלושה מיליליטר של מתנול קר ואצטון לתאים ביחס של 7:3 כדי לתקן אותם. הנח את הכלים בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס לתשע דקות.
לאחר מכן, הסר את תמיסת המתנול אצטון. לאחר שטיפת התאים שלוש פעמים עם PBS, פיפטה של 15 מיקרוליטר של מדיום אנטי-פייד המכיל DAPI על סלייד זכוכית. התקן בעדינות את הכיסוי על מדיום ההרכבה כשהתאים פונים פנימה, תוך מזעור בועות.
מרכז וקבע את הכיסוי על סלייד הזכוכית ואטום את הצדדים על ידי מריחת מעט אמייל ציפורניים שקוף על הקצוות. הנח את המחסניות בחושך כדי לאפשר לאמייל הציפורן להתייבש. לאחר ההורדה וההתקנה של Image J, פתח את Image J והתקן את קובץ הטקסט המקרו LivePAR_Macro על ידי לחיצה על Plugins, בחירת Macros ובחירת התקנה.
פתח את כל קבצי הקונפוקל בתמונה J ושמור אותם כקבצי TIFF כדי לשמור על הקבצים המקוריים. לאחר מכן, פתח מסמך גיליון אלקטרוני ושמור אותו כ-Date_CellLineFociAnalysis. נתח קובץ TIFF אחד בכל פעם.
לחץ 1 כדי למצוא את הגרעינים. כאשר חלון מנהל ה-ROI נפתח, בחר את כל הערכים ולחץ על Add כדי לשכב את אזור הגרעינים מעל התמונה המקורית. מחק גרעינים שזוהו בטעות והוציא גרעינים שאינם נמצאים במלואם במסגרת.
לאחר מכן, צייר את הגרעין באמצעות כלי Freehand Selection ולחץ על 2 כדי לכמת את מוקדי PAR. בחרו כל גרעין במנהל התשואה וספרו את מספר המוקדים לכל גרעין. העתק והדבק את הנתונים הכמותיים למסמך הגיליון הפתוח לאחר ציון כל הגרעינים בקובץ.
באופן דומה, חזור על הניתוח עבור כל קבצי TIFF. בסיום, יש לשרטט את מוקדי ה-PAR לכל גרעין בתוכנה המועדפת. תאי בקרת הרכב הראו כתמי EGFP פאן-תאיים.
תאים שטופלו בגנוטוקסין הראו הצטברות של מוקדי גרעין המייצגים מיקום בתוך הגרעין. טיפול מוקדם במעכב PARP1 וב-PARP2 וליפאריב הוביל לאובדן מוקדי PAR. כימות מספר מוקדי PAR לכל גרעין כפונקציה של זמן ותנאי טיפול הראה תוצאות דומות.
פרוטוקול זה מאפשר לנו לכמת את הפעלת ציר האיתות של PARP1 ו-PARP2 בתגובה לגנטוקסינים ולשינויים גנטיים שלאחר מכן. השתמשנו בטכניקות אימונופלואורסצנציה מסורתיות עם מבחן זה כדי לאמת קולוקליזציה של חלבונים עם פולי ADP-ריבוז. בהמשך, אנו משתמשים במבחן זה לבדיקות גנוטוקסיות לניתוח מהיר של מעכבי PARP1, PARP2 או PARP, ולזיהוי גורמים חדשים המעורבים באיתות PARP1 ו-PARP2.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג בדיקה כמותית מבוססת תאים להדמיה ומדידה של הצטברות poly(ADP-ribose) (PAR) בתגובה לנזק ל-DNA. באמצעות שימוש בדומיין קושר PAR (PBD) מ-RNF146 המהושר לחלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP), הפרוטוקול מאפשר ניתוח בזמן אמת של הפעלת PARP1 ו-PARP2 ויצירת מוקדי PAR בתאי יונקים ללא ליזיס של התאים. השיטה משלבת טרנסדוקציה לנטיווירלית, מיקרוסקופיה קונפוקאלית וניתוח תמונות חצי-אוטומטי להערכת הדינמיקה של תיקון ה-DNA.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- תיקון DNA
- דימוי תאי
- ביולוגיה מולקולרית
רקע
- PAR הוא מודיפיקציה לאחר-תרגומית המסונתזת בעיקר על ידי PARP1 ו-PARP2 בתגובה לשברים ב-DNA.
- רמות ה-PAR מווסתות הן על ידי סינתזה (PARP1/PARP2) והן על ידי פירוק (PARG).
- שרשראות PAR מגייסות גורמי תיקון DNA ותגובת נזקי DNA (DDR) באמצעות דומיינים ספציפיים לקשירת PAR (PBDs).
- ניתוח כמותי של דינמיקת PAR בתאים חיים הוא מאתגר, אך חיוני להבנת תהליכי תיקון DNA.
מטרת המחקר
- פיתוח בדיקה בתאים חיים לכימות הצטברות PAR והפעלת PARP1/PARP2.
- מתן אפשרות למחקרי לוקליזציה סוב-סלולרית של מוקדי PAR בתגובה לנזקי DNA.
- סיוע בבדיקות גנו-טוקסיות בקיבולת גבוהה ובזיהוי של גורמים חדשים במסלול ה-PARP.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ייצור חלקיקים לנטיביריאליים המקודדים לחלבון היתוך RNF146 (PBD/WWE domain)-EGFP.
- טרנסדוקציה של תאי יונקים ותיקוף של ביטוי LivePAR-EGFP.
- טיפול בתאים בגנוטוקסינים ובמעכבי PARP להשראה או עיכוב של היווצרות PAR.
- קיבוע, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית וכימות חצי-אוטומטי של מוקדי PAR באמצעות מאקרוס של ImageJ.
תוצאות עיקריות
- תאי ביקורת (Vehicle control) הראו צביעת EGFP דיפוזית, בעוד שתאים שטופלו בגנוטוקסין הראו מוקדי PAR גרעיניים.
- טיפול מקדים ב-veliparib, מעכב של PARP1/PARP2, ביטל את היווצרות מוקדי ה-PAR.
- כימות גילה שינויים דינמיים במספר מוקדי ה-PAR לגרעין, בהתאם לטיפול ולזמן.
- הבדיקה תוקפה באמצעות קולוקליזציה עם טכניקות מסורתיות של אימונופלואורסצנציה.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר ניתוח כמותי של תאים חיים לבדיקת הפעלת PARP1/PARP2 והצטברות PAR.
- הוא מתאים לבדיקות גנוטוקסיות בעומס גבוה ולסריקה של מעכבי PARP.
- השיטה יכולה לזהות גורמים חדשים המעורבים באותיות PARP ובנתיבי תיקון DNA.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ויזואליזציה כמותית של הפעלת PARP1/PARP2 בתאים חיים נותנת מענה לצורך קריטי בהפחתת סיכונים מכניסטיים במהלך תיקוף של מטרות לתיקון DNA. רפורטר זה, המבוסס על חלבון היתוך פלואורסצנטי, מאפשר ניתוח תת-תאי בעל תוכן גבוה של דינמיקת התגובה לנזקי DNA, ובכך תומך בביטחון חיזוי בשלבים המוקדמים של הגילוי וזיהוי המולקולות המובילות. גישה זו משפרת את קבלת ההחלטות בניהול הפורטפוליו על ידי אספקת תוצאות כמותיות חסונות לבדיקת גנוטוקסיות וסינון מעכבים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשרה כימות ישיר של הפעלת PARP1/PARP2 בתגובה לגנוטוקסינים או לשינויים גנטיים.
- תומכת בהסרת סיכונים מכניסטית על ידי מיקום הצטברות PAR באתרי נזק ל-DNA בתאים חיים.
- מקלה על תיקוף תפקודי של מטרות במסלול תיקון DNA באמצעות דימות כמותי.
- מספקת ביטחון ניבוי להעמדת מודולטורים של תיקון DNA בשלבי הפיתוח (pipeline).
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק בדיקה מבוססת תאיםי מאושרת לסריקה של גנוטוקסיות ומעכבי PARP בסריקה רחבה.
- מסטנדרט את הכמות של מוקדי PAR באמצעות ניתוח תמונות חצי-אוטומטי להבטחת הדירות.
- מאפשר הערכה רב-ערוצית (multiplexed) וניתנת להרחבה של השפעות תרכובות על איתות תיקון DNA.
- מכין מערכות ביולוגיות חסונות עבור זרימות עבודה של סריקות המשך.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מקשר את בחינת נתיבי תיקון ה-DNA עם מודלים תאיים הרלוונטיים למחלה.
- תומך ברצף מהשלב של הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של מודולטורים של נתיב PARP.
- מספק נקודות סוף כמותיות לצורך קבלת החלטות מבוססות סיכון לקידום מחקרים תרגומיים.
- מאפשר זיהוי של גורמים חדשים המעורבים באיתות PARP הרלוונטי ליציבות גנומית.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
בדיקה זו משתלבת ברצף שבין השלב הגילוי לשלב הפרה-קליני, בכך שהיא מאפשרת ניתוח כמותי של תהליכי תיקון DNA ושל ויסות מסלול ה-PARP בתאי חיים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבחינת השערות ובבירור מסלולים עבור מטרות של תיקון DNA.
- סריקה: מספק פלטים כמותיים וניתנים לשחזור להערכת תרכובות ואפיון מעכבים.
- אנליטיקה: מספק מדידות מבוססות תמונה של מוקדי PAR לגרעין לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מגשר בין ממצאי גילוי מוקדמים לבין תיקוף במודלים פרה-קליניים עבור תרופות לתיקון DNA.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה ניתנת לשחזור וניתנת להרחבה עבור ניתוח מתמשך של גנוטוקסיות ומסלולים על פני תוכניות שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזיוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות לתיקון DNA.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של כימות בתאים חיים ותומך בזרימות עבודה הניתנות להרחבה ובעלות תפוקה גבוהה.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקת תהליך (go/no-go) ויעילות הון באמצעות אספקת נתונים כמותיים חסונים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעודוף מותאם סיכונים וקידום של מודולטורים לתיקון DNA.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטרנסדוקציה לנטיויראלית, מיקרוסקופיה קונפוקלית ואנליזה כמותית של תמונות.
- נדרשת גישה לתרביות תאים, דימות פלואורסצנטי ותשתית חישובית לעיבוד נתונים.
- נדרש סטנדרטיזציה בין-צוותית של הגדרת הבדיקה ופרוטוקולי האנליזה כדי להבטיח הדירות (reproducibility).
- ניתן להתאימה לקווי תאים יונקיים שונים ולמדלים של נזק ל-DNA באמצעות אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- תלוי בבקרים מתוקפים לעיכוב PARP ותגובה לגנוטוקסינים כדי להבטיח את הספציפיות של הבדיקה.
