Name: פרוטוקול נוירונים culturing הסימפתטית מן הגרעינים עכברוש צוואר הרחם מעולה (SCG) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: למדו לבודד ולגדל נוירונים סימפתטיים מגנגליוני עצבון צווארי עליון בעכברושים נאונטליים. פרוטוקול זה מספק שיטה אמינה למחקר נוירוביולוגי וללימוד תפקודי מערכת העצבים האוטונומית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NZ רוצה להודות מעבדה חברי שובהאש ביזוואז, אנדרו Sproul, וראיין Willet לאימונים שלה לנתח והקציר נוירונים אוהד. נתמכות על ידי תרומות של NIH-NINDS.

1. הכנה לניתוח: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את המנה המתאימה תרבות (10 ס&quot;מ או 6 צלחות, או גם 24 טוב, וכו &#39;) בהתאם לאופי הניסויים שלך, מעיל אותם עם זנב עכברוש 24 שעות לפני קולגן לנתיחה. שיטות להכנת עכברוש זנב קולגן ושימוש בו כדי המנות תרבות מעיל תוארו במקום אחר (1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון טריפסין 0.25% ב שנאגרו מלוחים פוספט (PBS) (ללא EDTA) ולסנן לעקר. הכן 1 aliquots מ&quot;ל ולאחסן ב -20 º C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תמיסה המכילה 2.5 מ&quot;מ כל אחד uridine ו-5-FDU ב מזוקקים / deionized H 2 O. מסנן לעקר ולהכין 50 aliquots μl. חנות ב -20 º C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני השלם: RPMI 1640 בינוני התרבות עם חום מומת 10% נסיוב סוס (חום להשבית ידי דוגרים על 56 º C waterbath במשך 30 דקות) ו -5% בסרום שור העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני סופי: RPMI 1640 בינוני התרבות עם חום מומת 1% סוס סרום + NGF (ריכוז 100ηg/ml הסופי) + פניצילין / סטרפטומיצין (1 / 250) + 1 / 250 פתרון uridine/5-FDU (10 מיקרומטר הריכוז הסופי) . הערה: זה צריך להיות בינוני מורכב טרי לפני השימוש בכל פעם. לצורך ניסוי בתבנית של 24 גם צלחת, אחד יצטרך להכין 12 מ&quot;ל של מדיום זה. מומלץ לכם להכין תוספת קטנה. NGF ניתן לרכוש ממגוון רחב של מקורות מסחריים (ראו טבלה בסוף פרוטוקול זה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציוד: אחד יהיה צורך במיקרוסקופ הניתוח, מקור האור. מתכווננת כפול סיבים אופטיים עם הפנס טיפים התמקדות היא העדיפה. בנוסף, יהיה צורך לנקות לעקר (מעוקר או על ידי השריית באתנול 70% לפחות 20 דקות) כלי החיתוך הבא: שני זוגות של מיקרו לנתח מלקחיים נירוסטה, וזוג מספריים לנתח (גם נירוסטה ושניהם מ Roboz). שני מחטי מזרק סטרילי (26 gague x ½ 1 ס&quot;מ או דומה) יהיה גם צורך. יש צורך להגדיר לוח לנתיחה, המהווה 3 חתיכה &quot;x3&quot; של קלקר עטוף בנייר אלומיניום מכוסה Kimwipe. רסס את הלוח עם אתנול 70% כדי לטהר. לבסוף, להכין אש מלוטש פיפטה מרעה זכוכית. כדי אש פולנית, לקחת את פיפטה זכוכית והחזק את הטיפ הלהבה למשך כמה שניות, בעוד סיבוב. לאחר בדיקה, טיפ תיראה חלקה פתיחת יהיה צר יותר. זה הכרחי עבור השלב שבו התאים יהיה מנותק. בצע אש ליטוש ברדס תרבית תאים כך פיפטה נשאר סטרילי. </li></ol> 2. Dissection של הגרעינים צוואר הרחם מעולה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף גורים עכברוש בילוד כי הם בגיל P0 או P1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות לנגב את הגור לנתיחה עם אתנול 70% כדי להפחית את הסיכויים לזיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות לערוף את הגור עם זוג מספריים חדות (שלב זה לא יהיה המוצג בסרטון). החזק את הראש באמצעות מלקחיים סטריליות נגד גזה סטרילית בקצרה לנקז דם עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הראש על כרית דיסקציה עם הצד הגחוני פונה כלפי מעלה, ואת הקצה הזנב מכוונת כלפיך. קנה הנשימה הקטועה צריך להיות גלוי לעין. השתמש במחטים מזרק סטרילי כדי לאבטח את ראשו הכרות לרפד את הניתוחים באופן הבא: לדחוף אחד את הסיכה כי הגג של הפה לתוך כרית ולדחוף את מספר הזיהוי האישי השני כי קנה הנשימה החתוך לתוך כרית. הנח את כרית מתחת למיקרוסקופ לנתח ולהתחיל לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בשני מלקחיים (אחד בכל יד) העור לסלק שומן סביב קנה הנשימה, טיפול לא להיכנס עמוק מדי. פעולה זו תחשוף זוג שרירים פועל כמעט במקביל זה לזה משני צדי קנה הנשימה. הערה: במהלך דיסקציה, תצטרך להשקות עם PBS סטרילי קר או קר, סרום חינם בינוני 1640 RPMI נמסר עם סטרילית, פיפטה פסטר לשטוף דם עודף כדי לשמור על האזור נקי ולח. ניתן לעשות זאת רק פעם או יותר מפעם אחת, תלוי כמה מהר מהם עובד. עבור מבתר חוויה, זה לוקח רק כ 2-3 דקות לנתח את זוג הגרעינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מלקחיים לחתוך ולהסיר את השרירים בצד אחד הראשונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שריר מוסר, העורק הראשי יהיה גלוי. לעתים קרובות הוא ורדרד בהיר והוא מכיל דם. זה אולי יראה בהיר יותר מאשר כלי דם אחרים אתה עשוי לראות בסביבה ומסיבה זו העורק הראשי לא יכול להיות מורגש מיד. עורק זה פועל לצד קנה הנשימה ואת bifurcates לתוך מה שנראה כמו &quot;Y&quot; בצורת סרט. הסתעפות זו היא ציון דרך חשוב ופעם הוא נמצא, זה יהיה קל יחסית למצוא את SCG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סבר העורק בסוף הזנב ביותר להרים אותו מעט עם מלקחיים (את הקצה השני מחובר עדיין). ברגע שאתה עושה את זה, תוכל לראות שקדיות, מבריק מסה קטנה מחפש הרקמה מחוברת באופן רופף העורק רק בנקודת הסתעפות וכי יש thread דמוי מראש ו / או פוסט ganglionic connectives. זהו הגנגליון הצווארי מעולה. השתמש בזוג השני של מלקחיים ביד אחרים לנתק אותו בעדינות ומניחים בצלחת תרבות קטן (35 מ&quot;מ) המכיל קר, סרום חינם RPMI 1640 בינוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, לחלץ את הגנגליון בצד השני של קנה הנשימה בעקבות פרוטוקול זהה. </li></ol> 3. ניקוי הגרעינים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כל הגרעינים כבר גזור החוצה, הם צריכים להיות משוחרר ככל האפשר של רקמה זרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת המיקרוסקופ לנתיחה, אתה עשוי לראות כי בגרעיני יש המצורפת חתיכות של העורק הראשי, רקמת שומן או אחר. עבודה עם מלקחיים בכל יד לקנטר ממנו את החומרים האלה לא רצויות. המקום נוקה הגרעינים לתוך סטרילית 15ml חרוטי, צינור פוליפרופילן, המכיל RPMI 1640 בינוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Connectives מראש ו / או פוסט ganglionic צריך להיות גם מטופח משם. הגנגליון לכל אחד יש כ -10,000 נוירונים. לאחר הנוירונים מצופה, הם יוכלו לצמוח מחדש neurites שלהם. </li></ol> 4. ביסוס תרבות Neuron הסימפתטית: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הגרעינים ב 200xg למשך 2 דקות ו למחוק את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend הגרעינים ב 0.5-1 מ&quot;ל של תמיסת טריפסין 0.25%. מקום 37 ˚ C waterbath או בחממה במשך 30 דקות. זה יעזור לנתק את התאים בגרעיני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 30 דקות, להוסיף 10 מ&quot;ל של מדיום השלם לדלל החוצה לנטרל את טריפסין ו צנטריפוגות ב 200xg במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו resuspend ב 2 מ&quot;ל של מדיום הסופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהמשך לנתק את התאים על ידי triturating הגרעינים למעלה ולמטה עם אש מלוטש פיפטה זכוכית למרעה. Triturate הגרעינים 20 פעמים במקום צינור על קרח למשך כמה דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, אש לצחצח את פיפטה יותר לעשות פתיחת צר (כ 2 / 3 עד 1 / 2 מ&quot;מ קוטר). חכה כמה דקות עד שהוא מתקרר triturate הגרעינים פי 20 יותר. כפי שאתה ממשיך, המדיום יהפוך בהדרגה מעורפל המציין כי התאים נמצאים ניתק. חזור על פעולה זו פעם או פעמיים יותר תלוי גם לנתק את התאים. לאחר זמן מה, תוכלו להבחין כי כל הגרעינים יש ניתק לתוך הנוירונים ולא הגרעינים שלמים נראים בצינור. אולי יש קצת חומר הרקמה לא לנתק. בשלב זה, לתת הצינור לשבת קרח למשך כמה דקות, כך כל פסולת undissociated ניתן ליישב לתחתית. עכשיו בזהירות לאסוף כמעט את כל המדיום מלמעלה ומניחים צינור אחר. על מנת להבטיח כי אתה לא לאסוף את השברים undissociated, להשאיר כ 50 μl בחלק התחתון של הצינור. הוסף יותר של המדיום הסופי צינור המכיל תאים ניתק: בכרך זה תלוי בסוג של צלחת אחת היא באמצעות תרבות לתרבות נוירונים. לדוגמה: אם מנה של 24 גם הוא להיות מועסק, אז 0.5 צלחת הגרעינים היטב לכל (~ 10,000 נוירונים מדי טוב) ב 0.5 מ&quot;ל של מדיום הסופי לכל טוב. המלטה עכברוש טיפוסית מורכבת 12 גורים, אשר ייתן 24 הגרעינים. זה מספיק כדי צלחת אחת 24 גם הזרע ואת הנפח הכולל של המדיום הסופי הוא 12 מ&quot;ל. הערה: הגרעינים מכילים גם אוכלוסייה קטנה של גליה סוגי תאים אחרים יהיו נוכחים בתרבות. Uridine/5-FDU שימוש במדיום הסופי שימנע את שגשוגם ולקדם את מותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזנת התאים כל 48 שעות על ידי החלפת 2 / 3 של המדיום עם טרי RPMI 1% סוס סרום + NGF ו uridine/5-FDU. הערה: בשלב ראשון, התרבות מכיל נוירונים אוהד שנראים עגול עם neurites לא. Neurites קצר להיות גלוי 24 שעות לאחר דיסקציה בהדרגה להיות צפופים מסועפת יותר לאורך זמן. </li></ol>

<ol><li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBanker%2C+G+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. , MIT Press. (1998).</li>
<li>Biswas, S. C., Shi, Y., Sproul, A., Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-apoptotic+Bim+Induction+in+Response+to+Nerve+Growth+Factor+Deprivation+Requires+Simultaneous+Activation+of+Three+Different+Death+Signaling+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Pro-apoptotic Bim Induction in Response to Nerve Growth Factor Deprivation Requires Simultaneous Activation of Three Different Death Signaling Pathways.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (40), 29368-29374 (2007).</li>
<li>Bocchini, V., Angeletti, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nerve+Growth+Factor%3A+purification+as+a+30%2C000-molecular-weight+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">The Nerve Growth Factor: purification as a 30,000-molecular-weight protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (64), 787-794 (1969).</li>
<li>Dechant, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chat+in+the+Trophic+Web%3A+NGF+Activates+Ret+by+Inter-RTK+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Chat in the Trophic Web: NGF Activates Ret by Inter-RTK Signaling.</a> Neuron. 33 (2), 156-158 (2002).</li>
<li>Deckwerth, T., Elliott, J. L., Knudson, C. M., Johnson, E. M., Snider, W. D., Korsmeyer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bax+is+required+for+neuronal+death+after+trophic+factor+deprivation+and+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Bax is required for neuronal death after trophic factor deprivation and during development.</a> Neuron. (17), 401-411 (1996).</li>
<li>Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+Vitro+Studies+on+the+Nerve+Growth+Factor+%28NGF%29+Requirement+of+Neurons+-+I.+Sympathetic+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative in Vitro Studies on the Nerve Growth Factor (NGF) Requirement of Neurons - I. Sympathetic Neurons.</a> Developmental Biology. (58), 96-105 (1977).</li>
<li>Park, D. S., Morris, E. J., Padmanabhan, J., Shelanski, M. L., Geller, H. M., Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin-dependent+kinases+participate+in+death+of+neurons+evoked+by+DNA-damaging+agents%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cyclin-dependent kinases participate in death of neurons evoked by DNA-damaging agents.</a> The Journal of Cell Biology. 143, No 2 457-467 (1998).</li>
<li>Pierchala, B. A., Ahrens, R. C., Paden, A. J., Johnson, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+Growth+Factor+Promotes+the+Survival+of+Sympathetic+Neurons+through+the+Cooperative+Function+of+the+Protein+Kinase+C+and+Phosphatidylinositol+3-Kinase+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nerve Growth Factor Promotes the Survival of Sympathetic Neurons through the Cooperative Function of the Protein Kinase C and Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathways.</a> The Journal of Cell Biology. 279, No 27 27986-27993 (2004).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

אנו משתמשים חולדות Sprague Dawley עבור התרבויות שלנו. קח את הזמן והטיפול כאשר מנקים את הגרעינים. הסר את כל פסולת, כלי דם ושומן. שלב זה חשוב בהבטחת תרבות פחות או יותר הומוגני חינם של סוגי תאים זרים. תוספת של uridine/5-FDU יהיה בעיקר לחסל את התאים הלא העצבית (mitotic) הנותרים לזהם את התרבות או לפחות לדכא את התרבות שלהם. בנוסף, במהלך השלב דיסוציאציה, להיות סבלנית ולקחת את הזמן כדי להפריד בין נוירונים כך שהם לא...

<table><tbody><tr><td>פינצטה, פלדת אל-חלד #5</td><td>כלי</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS4976</td><td></td></tr><tr><td>מספריים, DEAVER ישרים, חד-קהה - להבים 43mm - 5.5</td><td>כלי</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS6760</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 עם L-Glutamin</td><td>ריאגנט</td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי (Fetal Bovine Serum)</td><td>ריאגנט</td><td>SAFC Global</td><td>12103c</td><td></td></tr><tr><td>סרום סוס מתורם</td><td>ריאגנט</td><td>JRH Biosciences</td><td>12449</td><td>יש לבצע אינאקטיבציה בחום על ידי הדגרה באמבט מים ב-56&amp;#x00B0;C למשך 30 דקות.</td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומייצין</td><td>ריאגנט</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין ללא EDTA</td><td>ריאגנט</td><td>Difco Laboratories</td><td>MT 25-050-CI</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluoro-5&amp;rsquo; deoxyuridine</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-8791</td><td></td></tr><tr><td>NGF</td><td>ריאגנט</td><td>Harlan Laboratories</td><td>BT-5025</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דיסקציה ומקור אור</td><td>מיקרוסקופ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מבחנות פוליפרופילן 15 ml</td><td>כלי</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>צלחונות לתרבית תאים</td><td>כלי</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

פרוטוקול נוירונים culturing הסימפתטית מן הגרעינים עכברוש צוואר הרחם מעולה (scg)

Protocol for Culturing Sympathetic Neurons from Rat Superior Cervical Ganglia (SCG)

הגרעינים צוואר הרחם מעולה (SCG) אצל חולדות הם קטנים, מבריק, דמוי שקד מבנים המכילים נוירונים אוהד. נוירונים אלה מספקים innervations אוהד לראש ואזורים הצוואר והם מהווים אוכלוסייה היטב מאופיין והומוגני יחסית (4). נוירונים הסימפתטית תלויים בגורם גדילה עצבי (NGF) לצמיחה, הישרדות בידול axonal והתפשטות רחבה הזמינות של NGF מקלה תרבותם מניפולציה ניסויית (2, 3, 6). מסיבות אלה, נוירונים בתרבית אוהד כבר בשימוש במגוון רחב של מחקרים כולל פיתוח בידול עצב, מנגנונים של מות תאים מתוכנת ופתולוגיים, ואת הולכת אותות (1, 2, 5, 6). לנתח את SCG מן החולדות יומו נוירונים culturing אוהד לא מאוד מסובך וניתן לשלוט די מהר. במאמר זה נתאר בפירוט כיצד לנתח את SCG מ גורים עכברוש היילוד להשתמש בהם כדי להקים תרבויות של נוירונים אוהד. המאמר כמו כן נתאר את הצעדים ההכנה ואת ריאגנטים שונים וציוד הנחוצים כדי להשיג זאת.

זהו פרוטוקול המתאר כיצד לבודד תרבות נוירונים אוהד העיקרי של הגנגליונים צוואר הרחם מעולה (SCG) של גורי חולדה היילוד.

פרוטוקול נוירונים culturing הסימפתטית מן הגרעינים עכברוש צוואר הרחם מעולה (SCG)

הגנגליונים הצוואריים העליונים (SCG) בחולדות הם מבנים קטנים, מבריקים ובצורת שקד המכילים נוירונים סימפתטיים. נוירונים אלו מספקים...

הליך זה מתחיל בבידוד הגנגליונים הסימפתטיים הצוואריים העליונים (superior cervical sympathetic ganglia) מחולדות רכים ביום הלידה (P zero). בכל מוח ישנם שני גנגליונים סימפתטיים צוואריים עליונים. ניתן לאסוף כ-24 גנגליונים משגררה אחת של גורי חולדה.דיסוציאציית הגנגליונים מתחילה באמצעות טיפול ב-trypsin למשך 30 דקות. דיסוציאציה נוספת מבוצעת באמצעות תגובות חוזרות עם פיפטת פסטור שעברה חישול באש, דבר המוביל לסספנסיות של תאים בודדים. לאחר מכן, נוירונים סימפתטיים נזרעים בצלחות מצופות collagen ENC.שלום, אני נילה זורין מהמעבדה של ד"ר לויד גרין במחלקה לפתולוגיה וביולוגיה של התא באוניברסיטת קולומביה בניו יורק. היום נדגים כיצד לבודד ולגדל נוירונים סימפתטיים ראשוניים מganglia cervicalis superior של גורי חולדה אדומים בניו born. במעבדה שלנו, אנו משתמשים בדרך כלל בתאים אלו כדי לחקור אפופטוזיס בתגובה להסרת גורם גדילה עצבי (nerve growth factor).בואו נתחיל. אנו פותחים את הפרוצדורה בציפוי של צלחת תרבית בקולגן מזנב חולדה 24 שעות לפני ביצוע הדיסקציה. בהתאם לאופי הניסוי, נעשה שימוש בצלחת תרבית של 24 בארות או 48 בארות.בשלב הבא יוכנו מצעי תמיסות וציוד. חומרים וריאגנטים אלו מופיעים בפרוטוקול הטקסט המלווה סרטון זה. חשוב לציין כי יש להכין את תמיסת ה-uridine וה-5-FDU רגע לפני השימוש.המשך את ההכנה באמצעות להבת אש. יש ללטש את פיפטות הזכוכית עבור שלבי הטיטולציה. קצה פיפטת הזכוכית מוחזק בלהבה למשך מספר שניות תוך כדי סיבוב כדי להצר ולהחליק אותו.יש לבצע את הליטוש הראשוני באש בתוך מנדף סטרילי לתרביות תאים. כדי להתחיל בניתוח, אספו גורי חולדה ניאונטליים בשלבים P zero עד P one. יש לנגב במהירות גור חולדה ניאונטלי ב-70%ethanol כדי להפחית זיהומים.לאחר העריפה, מניחים את הראש על משטח הנתיחה כאשר הצד הוונטרלי (הבטני) פונה כלפי מעלה והקצה הקודלי (הזנבי) פונה אליך. קנה הנשימה החתוך צריך להיות גלוי למגמה. מחטי מזריק סטריליות משמשות לקיבוע הראש הערוף למשטח הנתיחה באופן הבא.דחפו סיכה אחת דרך חך הפה אל תוך משטח הניתוח ודחפו את הסיכה השנייה דרך חוט השדרה הקטוע אל תוך המשטח. לאחר הזזת משטח הניתוח אל מתחת למיקרוסקופ והסתכלות דרך העדשות, השתמשו בשתי זוגות פינצטות כדי להסיר את העור והשומן מסביב לקנה הנשימה. תוך הקפדה שלא להעמיק יתר על המידה, ייחשפו שני שרירים הנעים כמעט במקביל זה לזה משני צדדיו של קנה הנשימה.במהלך הניתוח, יהיה צורך לבצע שטיפה באמצעות PBS סטרילי קר או מצע RPMI 1640 קר ללא סרום, שיועבר באמצעות פסטור-פיפט סטרילית כדי לשטוף דם עודף. ניתן לבצע זאת פעם אחת או יותר, בהתאם למהירות העבודה. לאחר מכן משתמשים בפינצטה כדי לחתוך ולהסיר תחילה את השריר מצד אחד.לאחר הסרת השריר, העורק הגרוני (carotid artery) יהיה גלוי. עורק זה רץ לצד הקנה ומסתעף לצורה הנראית כסרט בצורת Y. הסתעפות זו היא נקודת ציון חשובה, וברגע שהיא תאותר, יהיה קל יחסית למצוא את הגנגליונים הצוואריים העליונים (superior cervical ganglia).חוצים את העורק בקצה המרוחק ביותר ומרימים אותו מעט בעזרת פינצטה. הקצה השני של העורק נשאר מחובר. לאחר ביצוע פעולה זו, הגנגליון הצווארי העליון (superior cervical ganglion) יהיה גלוי.יש לוודא כי מדובר במסה קטנה של רקמה בעלת מראה מבריק ובצורת שקד, המחוברת באופן רופף לעורק בנקודת הפיצול, וכי יש לה קשרי גנגליוניים טרום ו/או לאחר-גנגליוניים דמויי חוטים. נעזרים בזוג פינצטות שני כדי לנתק בעדינות את הגנגליון הצווארי העליון ולהניחו בצלחת תרבית קטנה בקוטר 35 millimeter המכילה מצע RPMI 1640 קר ללא סרום. לאחר מכן, מוציאים את הגנגליון מהצד השני של הקנה בהתאם לאותו פרוטוקול.לאחר שכל הגנגליונים הוצאו בדיסקציה, הם מנוקים ככל הניתן מרקמה זרה. בהסתכלות דרך המיקרוסקופ, ניתן להבחין כי לגנגליונים צמודים חתיכות של שומן מעורק התרדמה (carotid artery) או רקמות אחרות; יש להשתמש בפינצטה כדי להסיר חומרים לא רצויים אלו. כמו כן, יש לקצץ את הקשרי הגנגליונים הפרה- ו/או הפוסט-סינפטיים.בכל גנגליון יש כ-10,000 נוירונים. לאחר זריעת הנוירונים, הם יצמיחו מחדש את דנדריטים נקיים. לאחר מכן, מניחים את הגנגליונים בתוך מבחנה קונית סטרילית מポリפרופילן בנפח 15 milliliter המכילה מצע RPMI 1640.בשלב הבא, מקמיים תרבית של נוירונים סימפתטיים. את הגנגליונים סובבים בצנטריפוגה ב-200 G למשך שתי דקות ושואבים את הנוזל העליון. את הגנגליונים מרחיפים מחדש ב-0.5 עד 1 מיליליטר של תמיסת טריפסין 0.25%, ולאחר מכן מניחים אותם במקלח מים או באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות כדי לסייע בדיסוציאציה של התאים בגנגליונים.לאחר 30 דקות, מוסיפים 10 milliliters של מצע מלא על מנת לדלל ולנטרל את ה-trypsin. לאחר מכן, סובבים את התמיסות בצנטריפוגה ב-200 G למשך שתי דקות. את הנוזל העליון שולפים והגנגליונים מושעים מחדש בשני milliliters של מצע סופי.באמצעות אחד מקצות הפיפטות שעברו ליטוש באש ובעלי פתח רחב, מפרידים את התאים עוד יותר על ידי העברת הגנגליונים למעלה ולמטה 20 פעמים. לאחר מכן, מניחים את המבחנה על קרח למשך מספר דקות. בשלב הבא, מבצעים שוב ליטוש באש לקצה הפיפטה כדי להפוך את הפתח לצר עוד יותר.לאחר שהפיפט מקורר, יש לבצע טריטורציה (trituration) של הגנגליונים 20 פעמים נוספות. המדיום יהפוך לעכור יותר ויותר, דבר המעיד על כך שהתאים עוברים דיסוציאציה. שלב זה יחזור פעם או פעמיים נוספות, בהתאם למידת הדיסוציאציה של התאים.לאחר זמן מה, הגנגליונים יתפרקו לנוירונים ולא ייראו גנגליונים שלמים בתוך המבחנה. ייתכן שיהיה חלק מרקמה שלא יתפרק בשלב זה. המבחנה תישאר על קרח למשך מספר דקות כדי שכל השאריות שלא התפרקו ישקעו לתחתית.כל הנוזל העליון, למעט כ-50 µL, נאסף בזהירות ומועבר למבחנה אחרת. 50 µL נותרים בתחתית המבחנה כדי למנוע מעבר של פסולת שאינה קשורה. כמות נוספת של המדיום הסופי מתווספת למבחנה המכילה את התאים המופרדים.נפח המצע הסופי המתווסף תלוי בסוג פיתח התרבית שבו משתמשים לגידול הנוירונים. לדוגמה, אם נעשה שימוש בצלחת של 24 בארות, יש להניח גנגליון אחד לכל בארה ב-0.5 milliliters של מצע סופי לכל בארה.שגרת גורילים טיפוסית של חולדה כוללת 12 גורים, אשר יספקו 24 גנגליונים. כמות זו מספיקה לזריעה של פלטת 24 בארות אחת, ונפח המדיום הסופי הכולל הוא 12 milliliters. השימוש ב-uridine five FDU במדיום הסופי ימנע את התרבותם ויקדם את מותם של אוכלוסייה קטנה של גליות וסוגי תאים אחרים.במהלך התרבית, התאים מקבלים הזנה מדי 48 שעות על ידי החלפת שני שלישים מהתווך. ההזנה מורכבת מ-RPMI טרי בתוספת 1% horse serum, NGF, uridine וחמש FDU. בתחילה, התרבית מכילה נוירונים סימפתטיים הנראים עגולים ללא נוירונים.נוירונים קצרים הופכים לנראים 24 שעות לאחר הניתוח, והופכים לצפופים ומסועפים יותר עם הזמן. כעת הצגנו בפניכם כיצד לבודד ולגדל תרביות ראשוניות של נוירונים סימפתטיים מקשריות צוואריות עליונות של חולדות רט חד born. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור, ראשית, להקדיש זמן ותשומת לב לניקוי הקשריות, ולהסיר את כל השאריות, כלי הדם והשומן.שלב זה חשוב להבטחת תרבית שהיא הומוגנית פחות או יותר ונקייה מסוגי תאים זרים. שנית, במהלך שלב הדיסוציאציה, היו סבלניים והקדישו את הזמן הדרוש להפרדת הנוירונים כדי שלא ייווצרו גושים גדולים. לאחר שהם יושבנו על הצלחות, גושים גדולים יקשרו את התהליך.ביישומים עוקבים, כגון חיתוך רוחבי או הדבקה של הנוירונים, גם צביעה אימונוהיסטוכימית עלולה להיפגע, וכל ניסוי הדורש ספירה של הנוירונים יהיה קשה לביצוע. לבסוף, אין צורך להוסיף פניצילין-סטרטומייצין למצע הגידול. בכל פעם שהתרביות מקבלות הזנה, אין צורך בתוספת פניצילין-סטרטומייצין; ההוספה הראשונית בעת זריעת התאים מספיקה.יש להוסיף uridine five FDU טרי למצע בכל פעם שמחליפים את המצע. המעבדה שלנו השתמשה בתרבית נוירונים סימפתטית כדי לחקור אפופטוזיס בתגובה להסרת גורם גדילה עצבי. וזהו.תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.

protocol-for-culturing-sympathetic-neurons-from-rat-superior-cervical

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים באמצעות פרוטוקול המוךפו"גנטי שהולך העצם חלבונים 7 (BMP-7) או Matrigel סלקטיבי לגרום לצמיחה הדנדריטים בנוירונים אוהדים העיקריים הסתייגותם מן הגרעינים צוואר הרחם מעולה (SCG) של חולדות הלידה.

גרימת צמיחה הדנדריטים בנוירונים אוהדים מתורבתים

הפרוטוקול מתאר את מערכת מודל יעיל לשחזור ללמוד הרפס סימפלקס סוג הנגיף 1 (HSV-1) ההשהיה מחדש. Assay מעסיקה הומוגניות תרבויות נוירונים אוהדים ומאפשר לנתיחה מולקולרית של וירוסים נוירונים אינטראקציות באמצעות מגוון של כלים, כולל התערבות RNA וביטוי של חלבונים רקומביננטיים.

תא עצב ראשי מערכת התרבות לחקר וירוס הרפס סימפלקס המתנה ו הפעלה מחדש

סרטון זה מדגים הליך לבידוד נוירונים של גנגליון שורש גבי (DRG) מעוברי חולדות וטיפוחם יחד עם מבשרי תאי Schwann ליצירת תאי Schwann בוגרים. ה-DRGs המבודדים מעובדים כדי לבודד תאי עצב ותאי גלייה. התאים המבודדים מתורבתים כדי לטהר את תאי העצב, אשר לאחר מכן מתורבתים יחד עם תאים דמויי תאי Schwann (SCLCs) במדיום של תרבית משותפת. אינטראקציה עם נוירוני DRG מובילה להבשלה של SCLCs לתוך תאי Schwann.

בידוד של נוירוני DRG והתרבות משותפת עם מבשרי תאי Schwann ליצירת תאי Schwann

סרטון זה מתאר את הבידוד והטיפוח של תאי Schwann משורשי עמוד השדרה של עכבר. תאים מבודדים עוברים תרבית במדיה ספציפית. תאי Schwann מבודדים באמצעות עיכול דיפרנציאלי והיצמדות. לאחר מכן הם מועברים לכיסויים חוץ-תאיים מצופים מטריצה לצורך התקשרות והתפשטות.

בידוד תאי Schwann משורשי עמוד השדרה של העכבר

סרטון זה מדגים טכניקה לבידוד וטיפוח תאי גרעיני שורש גבי (DRG) מעמוד השדרה של החולדה. DRGs שנכרתו מעמוד השדרה מטופלים באנזימים ומנתקים מכנית כדי להשיג תרחיף חד-תאי. התאים מגודלים בתרבית בתווך המכיל מעכבים וגורמי גדילה המגבילים את התפשטות תאי הגליה ומקדמים צמיחה עצבית, בהתאמה.

הקמת תרבית תאי גרעיני שורש גבי ראשונית מעמוד השדרה של חולדה

כאן אנו מתארים תא שוואן (SC) assay הגירה שבSCS מסוגל לפתח לאורך האקסונים של הארכה.

ניתוח התפתחות תאי שוואן Murine לאורך האקסונים של גידול

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של נוירונים של גנגליון שורש הגב (DRG) שבודדו מחולדות ואת התרבית של נוירוני DRG על מערכת תרבית תאים סטטית מתוחה מראש כדי לשפר את יישור האקסונים, עם תרבית משותפת של תאי שוואן (SCs) כדי לקדם מיאלינציה.

גישת שפר מערך myelination של נוירונים שורש הגבה גנגליון

שורש העץ הגרעינים (DRG) ראשי תרבויות משמשים לעתים קרובות כדי לחקור פונקציות פיזיולוגיים או אירועים הקשורים לפתולוגיה, החישה הניריונים. כאן, נדגים את השימוש המותני תרבויות DRG כדי לזהות את השחרור של הנוירוטרנסמיטרים לאחר neuropeptide FF קולטן הקלד 2 גירוי עם אגוניסט סלקטיבי.

בידוד גרעיני הבסיס העזוב והתרבות העיקריים ללמוד שחרור נוירוטרנסמיטר

מאמר זה מתאר את הבידוד וההתלות של נוירונים אוהדים של חולדה עוברית מגנגליה צוואר הרחם מעולה. הוא גם מספק פרוטוקולים מפורטים עבור כתמים חיסוניים והכנת תמציות עצביות לניתוח ספקטרומטרי מסה.

חולדה Culturing נוירונים סימפטיים מגנגליה צוואר הרחם מעולה עוברית לניתוח מורפולוגי ופרוטונומי

גנגוליה (CG) היא חלק ממערכת העצבים הפאראסימפתטית. תרבויות נוירואליות של אפרוח CG הנוירונים הוכחו להיות מודלים תא יעיל במחקר של אינטראקציות שרירים עצביים. אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור הניתוח, דיסוציאציה ותרבות מבחנה של CG נוירונים מ עוברי האפרוח.

בידוד ותרבות של צ'יק סילייון גנגליון נוירונים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מודל עכברי של אבלציה של עצבוב אדרנרגי על ידי זיהוי וכריתה של גנגליון צוואר הרחם העליון.

טכניקה כירורגית לכריתת גנגליון צוואר הרחם מעולה במודל מורין

למדו לבודד ולגדל נוירונים סימפתטיים מגנגליוני עצבון צווארי עליון בעכברושים נאונטליים. פרוטוקול זה מספק שיטה אמינה למחקר נוירוביולוגי וללימוד תפקודי מערכת העצבים האוטונומית.

פרוטוקול נוירונים culturing הסימפתטית מן הגרעינים עכברוש צוואר הרחם מעולה (SCG)

גלה סרטונים נוספים