פרוטוקול נוירונים culturing הסימפתטית מן הגרעינים עכברוש צוואר הרחם מעולה (SCG)

הליך זה מתחיל בבידוד הגנגליונים הסימפתטיים הצוואריים העליונים (superior cervical sympathetic ganglia) מחולדות רכים ביום הלידה (P zero). בכל מוח ישנם שני גנגליונים סימפתטיים צוואריים עליונים. ניתן לאסוף כ-24 גנגליונים משגררה אחת של גורי חולדה.

דיסוציאציית הגנגליונים מתחילה באמצעות טיפול ב-trypsin למשך 30 דקות. דיסוציאציה נוספת מבוצעת באמצעות תגובות חוזרות עם פיפטת פסטור שעברה חישול באש, דבר המוביל לסספנסיות של תאים בודדים. לאחר מכן, נוירונים סימפתטיים נזרעים בצלחות מצופות collagen ENC.

שלום, אני נילה זורין מהמעבדה של ד"ר לויד גרין במחלקה לפתולוגיה וביולוגיה של התא באוניברסיטת קולומביה בניו יורק. היום נדגים כיצד לבודד ולגדל נוירונים סימפתטיים ראשוניים מganglia cervicalis superior של גורי חולדה אדומים בניו born. במעבדה שלנו, אנו משתמשים בדרך כלל בתאים אלו כדי לחקור אפופטוזיס בתגובה להסרת גורם גדילה עצבי (nerve growth factor).

בואו נתחיל. אנו פותחים את הפרוצדורה בציפוי של צלחת תרבית בקולגן מזנב חולדה 24 שעות לפני ביצוע הדיסקציה. בהתאם לאופי הניסוי, נעשה שימוש בצלחת תרבית של 24 בארות או 48 בארות.

בשלב הבא יוכנו מצעי תמיסות וציוד. חומרים וריאגנטים אלו מופיעים בפרוטוקול הטקסט המלווה סרטון זה. חשוב לציין כי יש להכין את תמיסת ה-uridine וה-5-FDU רגע לפני השימוש.

המשך את ההכנה באמצעות להבת אש. יש ללטש את פיפטות הזכוכית עבור שלבי הטיטולציה. קצה פיפטת הזכוכית מוחזק בלהבה למשך מספר שניות תוך כדי סיבוב כדי להצר ולהחליק אותו.

יש לבצע את הליטוש הראשוני באש בתוך מנדף סטרילי לתרביות תאים. כדי להתחיל בניתוח, אספו גורי חולדה ניאונטליים בשלבים P zero עד P one. יש לנגב במהירות גור חולדה ניאונטלי ב-70%ethanol כדי להפחית זיהומים.

לאחר העריפה, מניחים את הראש על משטח הנתיחה כאשר הצד הוונטרלי (הבטני) פונה כלפי מעלה והקצה הקודלי (הזנבי) פונה אליך. קנה הנשימה החתוך צריך להיות גלוי למגמה. מחטי מזריק סטריליות משמשות לקיבוע הראש הערוף למשטח הנתיחה באופן הבא.

דחפו סיכה אחת דרך חך הפה אל תוך משטח הניתוח ודחפו את הסיכה השנייה דרך חוט השדרה הקטוע אל תוך המשטח. לאחר הזזת משטח הניתוח אל מתחת למיקרוסקופ והסתכלות דרך העדשות, השתמשו בשתי זוגות פינצטות כדי להסיר את העור והשומן מסביב לקנה הנשימה. תוך הקפדה שלא להעמיק יתר על המידה, ייחשפו שני שרירים הנעים כמעט במקביל זה לזה משני צדדיו של קנה הנשימה.

במהלך הניתוח, יהיה צורך לבצע שטיפה באמצעות PBS סטרילי קר או מצע RPMI 1640 קר ללא סרום, שיועבר באמצעות פסטור-פיפט סטרילית כדי לשטוף דם עודף. ניתן לבצע זאת פעם אחת או יותר, בהתאם למהירות העבודה. לאחר מכן משתמשים בפינצטה כדי לחתוך ולהסיר תחילה את השריר מצד אחד.

לאחר הסרת השריר, העורק הגרוני (carotid artery) יהיה גלוי. עורק זה רץ לצד הקנה ומסתעף לצורה הנראית כסרט בצורת Y. הסתעפות זו היא נקודת ציון חשובה, וברגע שהיא תאותר, יהיה קל יחסית למצוא את הגנגליונים הצוואריים העליונים (superior cervical ganglia).

חוצים את העורק בקצה המרוחק ביותר ומרימים אותו מעט בעזרת פינצטה. הקצה השני של העורק נשאר מחובר. לאחר ביצוע פעולה זו, הגנגליון הצווארי העליון (superior cervical ganglion) יהיה גלוי.

יש לוודא כי מדובר במסה קטנה של רקמה בעלת מראה מבריק ובצורת שקד, המחוברת באופן רופף לעורק בנקודת הפיצול, וכי יש לה קשרי גנגליוניים טרום ו/או לאחר-גנגליוניים דמויי חוטים. נעזרים בזוג פינצטות שני כדי לנתק בעדינות את הגנגליון הצווארי העליון ולהניחו בצלחת תרבית קטנה בקוטר 35 millimeter המכילה מצע RPMI 1640 קר ללא סרום. לאחר מכן, מוציאים את הגנגליון מהצד השני של הקנה בהתאם לאותו פרוטוקול.

לאחר שכל הגנגליונים הוצאו בדיסקציה, הם מנוקים ככל הניתן מרקמה זרה. בהסתכלות דרך המיקרוסקופ, ניתן להבחין כי לגנגליונים צמודים חתיכות של שומן מעורק התרדמה (carotid artery) או רקמות אחרות; יש להשתמש בפינצטה כדי להסיר חומרים לא רצויים אלו. כמו כן, יש לקצץ את הקשרי הגנגליונים הפרה- ו/או הפוסט-סינפטיים.

בכל גנגליון יש כ-10,000 נוירונים. לאחר זריעת הנוירונים, הם יצמיחו מחדש את דנדריטים נקיים. לאחר מכן, מניחים את הגנגליונים בתוך מבחנה קונית סטרילית מポリפרופילן בנפח 15 milliliter המכילה מצע RPMI 1640.

בשלב הבא, מקמיים תרבית של נוירונים סימפתטיים. את הגנגליונים סובבים בצנטריפוגה ב-200 G למשך שתי דקות ושואבים את הנוזל העליון. את הגנגליונים מרחיפים מחדש ב-0.5 עד 1 מיליליטר של תמיסת טריפסין 0.25%, ולאחר מכן מניחים אותם במקלח מים או באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות כדי לסייע בדיסוציאציה של התאים בגנגליונים.

לאחר 30 דקות, מוסיפים 10 milliliters של מצע מלא על מנת לדלל ולנטרל את ה-trypsin. לאחר מכן, סובבים את התמיסות בצנטריפוגה ב-200 G למשך שתי דקות. את הנוזל העליון שולפים והגנגליונים מושעים מחדש בשני milliliters של מצע סופי.

באמצעות אחד מקצות הפיפטות שעברו ליטוש באש ובעלי פתח רחב, מפרידים את התאים עוד יותר על ידי העברת הגנגליונים למעלה ולמטה 20 פעמים. לאחר מכן, מניחים את המבחנה על קרח למשך מספר דקות. בשלב הבא, מבצעים שוב ליטוש באש לקצה הפיפטה כדי להפוך את הפתח לצר עוד יותר.

לאחר שהפיפט מקורר, יש לבצע טריטורציה (trituration) של הגנגליונים 20 פעמים נוספות. המדיום יהפוך לעכור יותר ויותר, דבר המעיד על כך שהתאים עוברים דיסוציאציה. שלב זה יחזור פעם או פעמיים נוספות, בהתאם למידת הדיסוציאציה של התאים.

לאחר זמן מה, הגנגליונים יתפרקו לנוירונים ולא ייראו גנגליונים שלמים בתוך המבחנה. ייתכן שיהיה חלק מרקמה שלא יתפרק בשלב זה. המבחנה תישאר על קרח למשך מספר דקות כדי שכל השאריות שלא התפרקו ישקעו לתחתית.

כל הנוזל העליון, למעט כ-50 µL, נאסף בזהירות ומועבר למבחנה אחרת. 50 µL נותרים בתחתית המבחנה כדי למנוע מעבר של פסולת שאינה קשורה. כמות נוספת של המדיום הסופי מתווספת למבחנה המכילה את התאים המופרדים.

נפח המצע הסופי המתווסף תלוי בסוג פיתח התרבית שבו משתמשים לגידול הנוירונים. לדוגמה, אם נעשה שימוש בצלחת של 24 בארות, יש להניח גנגליון אחד לכל בארה ב-0.5 milliliters של מצע סופי לכל בארה.

שגרת גורילים טיפוסית של חולדה כוללת 12 גורים, אשר יספקו 24 גנגליונים. כמות זו מספיקה לזריעה של פלטת 24 בארות אחת, ונפח המדיום הסופי הכולל הוא 12 milliliters. השימוש ב-uridine five FDU במדיום הסופי ימנע את התרבותם ויקדם את מותם של אוכלוסייה קטנה של גליות וסוגי תאים אחרים.

במהלך התרבית, התאים מקבלים הזנה מדי 48 שעות על ידי החלפת שני שלישים מהתווך. ההזנה מורכבת מ-RPMI טרי בתוספת 1% horse serum, NGF, uridine וחמש FDU. בתחילה, התרבית מכילה נוירונים סימפתטיים הנראים עגולים ללא נוירונים.

נוירונים קצרים הופכים לנראים 24 שעות לאחר הניתוח, והופכים לצפופים ומסועפים יותר עם הזמן. כעת הצגנו בפניכם כיצד לבודד ולגדל תרביות ראשוניות של נוירונים סימפתטיים מקשריות צוואריות עליונות של חולדות רט חד born. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור, ראשית, להקדיש זמן ותשומת לב לניקוי הקשריות, ולהסיר את כל השאריות, כלי הדם והשומן.

שלב זה חשוב להבטחת תרבית שהיא הומוגנית פחות או יותר ונקייה מסוגי תאים זרים. שנית, במהלך שלב הדיסוציאציה, היו סבלניים והקדישו את הזמן הדרוש להפרדת הנוירונים כדי שלא ייווצרו גושים גדולים. לאחר שהם יושבנו על הצלחות, גושים גדולים יקשרו את התהליך.

ביישומים עוקבים, כגון חיתוך רוחבי או הדבקה של הנוירונים, גם צביעה אימונוהיסטוכימית עלולה להיפגע, וכל ניסוי הדורש ספירה של הנוירונים יהיה קשה לביצוע. לבסוף, אין צורך להוסיף פניצילין-סטרטומייצין למצע הגידול. בכל פעם שהתרביות מקבלות הזנה, אין צורך בתוספת פניצילין-סטרטומייצין; ההוספה הראשונית בעת זריעת התאים מספיקה.

יש להוסיף uridine five FDU טרי למצע בכל פעם שמחליפים את המצע. המעבדה שלנו השתמשה בתרבית נוירונים סימפתטית כדי לחקור אפופטוזיס בתגובה להסרת גורם גדילה עצבי. וזהו.

תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.