פרוטוקול נוירונים culturing הסימפתטית מן הגרעינים עכברוש צוואר הרחם מעולה (SCG)

הליך זה מתחיל בבידוד הגרעינים הסימפתטיים של צוואר הרחם העליונים מחולדות יילודים P אפס. לכל מוח יש שני גנגליונים סימפתטיים עליונים בצוואר הרחם. ניתן לקצור כ-24 גנגליונים מהמלטה אחת של גורי חולדות.

הדיסוציאציה של הגרעינים מתחילה בטיולים וטיפול למשך 30 דקות. דיסוציאציה נוספת מושגת באמצעות חידוש חוזר עם פיפטה מלוטשת באש וכתוצאה מכך מתלה תא בודד. נוירונים סימפתטיים מצופים לאחר מכן על כלים מצופים קולגן ENC.

היי, אני נילה זורין מהמעבדה של ד"ר לויד גרין במחלקה לפתולוגיה וביולוגיה של התא באוניברסיטת קולומביה. היום נדגים כיצד לבודד ולתרבית נוירונים סימפתטיים ראשוניים מגרעיני צוואר הרחם העליונים של גורים אדומים שזה עתה נולדו. במעבדה שלנו, אנו משתמשים בדרך כלל בתאים אלה כדי לחקור אפופטוזיס בתגובה לנסיגה מגורם גדילה עצבי.

אז בואו נתחיל. אנו מתחילים את ההליך על ידי ציפוי צלחת תרבות בקולגן זנב עכברוש 24 שעות לפני ביצוע הדיסקציה. בהתאם לאופי הניסוי, משתמשים בצלחת תרבית של 24 בארות או 48 בארות.

הפתרונות הבאים יוכנו מדיה וציוד. ניתן למצוא חומרים וריאגנטים אלה בפרוטוקול הטקסט המלווה את הסרטון הזה. חשוב לציין כי יש להכין את תמיסת האורידין וחמש ה-FDU ממש לפני השימוש.

המשך בהכנה באש. ליטוש פיפטות המרעה מזכוכית למדרגות הטציה. קצה פיפטת הזכוכית מוחזק בלהבה למשך מספר שניות תוך כדי סיבוב לצר וחלק.

ליטוש אש הפתיחה צריך להתבצע במכסה מנוע סטרילי לתרבית תאים. כדי להתחיל בדיסקציה, אספו P אפס עד P גור חולדה יילוד אחד. גור חולדה יילוד נמחק במהירות עם 70% אתנול כדי להפחית את הזיהום.

לאחר עריפת הראש, הראש מונח על כרית הדיסקציה כשהצד הגחוני פונה כלפי מעלה וקצה הכפתור מכוון אליך. קנה הנשימה הקטוע צריך להיות גלוי בקלות. מחטי מזרק סטריליות משמשות לאבטחת הראש הכרות לכרית החיתוך באופן הבא.

דחפו סיכה אחת דרך תקרת הפה לתוך הרפידה ודחפו את הסיכה השנייה דרך חוט השדרה הקטוע לתוך הרפיד. לאחר הזזת כרית החיתוך מתחת למשקף והסתכלות דרך העיניים, השתמש בשני זוגות מלקחיים כדי לנקות את העור והשומן סביב קנה הנשימה. תוך הקפדה לא להיכנס עמוק מדי, זוג שרירים הפועלים כמעט במקביל זה לזה ייחשפו משני צידי קנה הנשימה.

במהלך הדיסקציה, תצטרך להשקות עם PBS סטרילי קר או מדיום RPMI 1640 ללא סרום קר המסופק עם פיפטת מרעה סטרילית כדי לשטוף עודפי דם. זה יכול להיעשות פעם או יותר מפעם אחת, תלוי כמה מהר עובדים. לאחר מכן משתמשים במלקחיים כדי לחתוך ולהסיר את השריר בצד אחד תחילה.

לאחר הסרת השריר, עורק הצוואר ייראה לעין. עורק זה עובר לצד קנה הנשימה ומתפצל למה שנראה כמו סרט בצורת Y. התפצלות זו היא נקודת ציון חשובה וברגע שהיא מאותרת, יהיה קל יחסית למצוא את גרעיני צוואר הרחם העליונים.

העורק נחתך בקצה הקפוא ביותר ומורם מעט עם המלקחיים. הקצה השני של העורק נשמר מחובר. ברגע שזה נעשה, הגנגליון הצווארי העליון ייראה לעין.

יש לראות שמדובר במסה קטנה בצורת שקד ומבריקה למראה של רקמה המחוברת באופן רופף לעורק בנקודת ההסתעפות, ושיש לה חוט כמו חיבורים לפני ו/או אחרי גנגליונים. זוג מלקחיים שני משמש לניתוק עדין של גנגליון צוואר הרחם העליון ולהניחו בצלחת תרבית קטנה של 35 מילימטר המכילה מדיום RPMI 1640 ללא סרום קר. לאחר מכן, הגנגליון מופק בצד השני של קנה הנשימה לפי אותו פרוטוקול.

לאחר שכל הגרעינים נותחו, הם משוחררים ככל האפשר מרקמה זרה. בהסתכלות דרך המשקפיים, אתה יכול להבחין שלגנגליונים יש חתיכות מחוברות של שומן בעורק הצוואר או מלקחיים אחרים של רקמות המשמשות כדי להקניט את החומרים הלא רצויים הללו. גם החיבורים שלפני ו/או אחרי גנגליונים נחתכים.

לכל גנגליון יש כ-10,000 נוירונים. ברגע שתאי העצב מצופים, הם יגדלו מחדש את תאי העצב שלהם נקיים. לאחר מכן מכניסים את הגרעינים לתוך צינור פוליפרופילן חרוטי סטרילי של 15 מיליליטר המכיל מדיה RPMI 1640.

לאחר מכן, נוצרת תרבות הנוירונים הסימפתטית. הגרעינים הם צנטריפוגה ב -200 גרם למשך שתי דקות והסנאט נזרק. הגרעינים מושעים מחדש ב-0.5 עד מיליליטר אחד של תמיסת טריפסין של 0.25%, ולאחר מכן מונחים באמבט מים או באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לסייע בניתוק התאים בגרעין.

לאחר 30 דקות מוסיפים 10 מיליליטר של מדיום שלם על מנת לדלל ולנטרל את הטריפסין. לאחר מכן התמיסות הן צנטריפוגה ב -200 גרם למשך שתי דקות. לאחר מכן משליכים את חומר העל והגנגליונים מושעים מחדש בשני מיליליטר של מדיום סופי.

באמצעות אחד מקצות הפיפטה המלוטשות באש שהוכנו מראש עם פתח רחב, התאים מנותקים עוד יותר על ידי משולש הגרעינים למעלה ולמטה 20 פעמים. לאחר מכן מניחים את הצינור על קרח למשך מספר דקות. לאחר מכן, הפיפטה מלוטשת שוב באש כדי להפוך את הפתח לצר עוד יותר.

לאחר שהפיפטה מתקררת, הגרעינים משולשים פי 20 יותר. המדיום יהפוך ליותר ויותר עכור, מה שמצביע על כך שהתאים מתנתקים. שלב זה חוזר על עצמו פעם או פעמיים נוספות בהתאם למידת הניתוק של התאים.

לאחר זמן מה, הגרעינים יתפרקו לתאי עצב ולא ייראו גנגליונים שלמים בצינור. ייתכן שיש חומר רקמה כלשהו שלא יתנתק בשלב זה. הצינור נותר לשבת על קרח במשך כמה דקות כדי שכל פסולת לא קשורה תוכל להתיישב לתחתית.

כל הסופרנטנט מלבד כ-50 מיקרוליטר נאסף בזהירות ומונח בצינור אחר. 50 מיקרוליטר נותרים בתחתית הצינור כדי למנוע העברת פסולת לא קשורה. יותר מהמדיום הסופי מתווסף לצינור המכיל תאים מנותקים.

נפח המדיום הסופי שנוסף תלוי בסוג צלחת התרבות. האחד הוא שימוש בתרבית הנוירונים. לדוגמא, אם יש להשתמש בצלחת של 24 בארות, אז צלחת גרעין אחד לבאר ב -0.5 מיליליטר של מדיום סופי לבאר.

המלטה טיפוסית של חולדות מורכבת מ-12 גורים, מה שנותן 24 גרעינים. זה מספיק כדי לזרוע צלחת באר 1 24, והנפח הכולל של המדיום הסופי הוא 12 מיליליטר. השימוש באורידין חמש FDU במדיום הסופי ימנע את ההתפשטות ויקדם את מותה של אוכלוסייה קטנה של גליה וסוגי תאים אחרים.

בתרבית, התאים מוזנים כל 48 שעות על ידי החלפת שני שליש מהמדיום. עם RPMI טרי בתוספת סרום סוס 1% בתוספת NGF ואורידין וחמישה FDU. בהתחלה, התרבית מכילה נוירונים סימפתטיים שמסתכלים סביב ללא נוירונים.

נוירונים קצרים נראים 24 שעות לאחר הדיסקציה והופכים בהדרגה צפופים ומסועפים יותר עם הזמן. זה עתה הראינו לכם כיצד לבודד ולתרבית נוירונים סימפתטיים ראשוניים מגרעיני צוואר הרחם העליונים של אמבטיות חולדות שזה עתה נולדו. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור, להקדיש זמן וטיפול בניקוי הגרעין, להסיר את כל הפסולת, כלי הדם והשומן.

שלב זה חשוב בהבטחת תרבית הומוגנית פחות או יותר וללא סוגי תאים זרים. שנית, במהלך שלב הדיסוציאציה, היו סבלניים והקדישו את הזמן להפריד את הנוירונים כך שהם לא יימצאו בגושים גדולים. ברגע שהם יושבים על הצלחות, גושים גדולים יקשו על כך.

ביישומים במורד הזרם כמו טרנסקציה או הדבקה של הנוירונים, צביעה חיסונית עלולה גם היא להיות מעוכבת, וכל ניסוי שדורש ספירת תאי העצב יהיה קשה לביצוע גם כן. לבסוף, אין צורך להשלים את המדיום עם סטרפטומיצין פניצילין. בכל פעם שהתרביות מוזנות בסטרפטומיצין נוסף של פניצילין, הפעם הראשונה שהתאים מצופים מספיקה.

הוסף אורידין טרי חמש FDU למדיום בכל פעם שמחליפים את המדיום. המעבדה שלנו השתמשה בתרבית עצבית סימפתטית כדי לחקור אפופטוזיס בתגובה לנסיגה מגורמי גדילה עצביים. אז זהו.

תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.