Overview
Это видео описывает метод для разобщенности целых червей в одноклеточную подвеску, подходящую для FACS или иммунопреципиентации нетронутых клеток.
Protocol
Этот протокол является выдержкой из Германии и др., Изоляция конкретных популяций нейронов от Круглого червя Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).
1. Подготовка и сбор выдержанных червей для изоляции клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Ниже объясняется изоляция холинергических нейронов от трансгенного unc-17::GFP штамма (OH13083), полученные из Центра генетики каенорхабдита (CGC) штамм репозиторий в Университете Миннесоты. Крайне важно поддерживать стерильные условия для предотвращения загрязнения от грибков или бактерий.
- Подготовка и синхронизация червей с помощью метода отбеливания, как описано Т. Stiernagle. Для экспериментов по старению, пластины червей на нематод роста средней (NGM) пластин, содержащих 25 МК Водного раствора фтордоксиуридина (FuDR) для сокращения производства яиц и ареста инкубации яиц. Регулярно проверяй агарные пластины, чтобы предотвратить загрязнение или вылупление яиц, так как это приведет к ненадежным результатам.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для unc-17::GFP клетки, как правило, три 100 мм х 15 мм NGM пластины используются для изоляции достаточного количества клеток, представляющих интерес. - Собирайте червей и подготовявая буферы для изоляции клеток.
- Соберите червей в конической трубке 15 мл. Вымойте червей из пластины с буфером 1,5 мл буфера M9 (1 мМ МгСО4,85 мМ НаКл, 42мМНа 2 HPO4'7H2O, 22мМХ 2PO, рН 7,0) и центрифуги на 5 мин при 1600 х г. Откажитесь от супернатанта и помойте червей 1 мл буфера M9. Повторите центрифугации и мыть в общей сложности пять раз, чтобы удалить как можно больше кишечной палочки загрязнения, как это возможно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление антибиотиков (50 мкг/мл), таких как ампициллин, на этом этапе может помочь уменьшить бактериальное загрязнение. - Для двух образцов приготовьте 2 мл лиза-буфера натрия додекил сульфат-дитиотрейтол (SDS-DTT) лиза буфера: 200 мММ ДТТ, 0,25% (ж/в) SDS, 20 мМ HEPES (pH 8.0) и 3% (w/v) сахарозы.
- Подготовь 15 мл буфера изоляции (118 мМ. NaCl, 48 мм ККл, 2 мМ CaCl2, 2 мм MgCl2, 25 мМ HEPES (pH 7,3") и храните его на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед каждым экспериментом необходимо сделать еще более свежим буфер SDS-DTT и буфер изоляции.
- Соберите червей в конической трубке 15 мл. Вымойте червей из пластины с буфером 1,5 мл буфера M9 (1 мМ МгСО4,85 мМ НаКл, 42мМНа 2 HPO4'7H2O, 22мМХ 2PO, рН 7,0) и центрифуги на 5 мин при 1600 х г. Откажитесь от супернатанта и помойте червей 1 мл буфера M9. Повторите центрифугации и мыть в общей сложности пять раз, чтобы удалить как можно больше кишечной палочки загрязнения, как это возможно.
- Нарушение кутикулы и одноклеточная изоляция
- Центрифуга животных, собранных в шаге 1.2.1 за 5 мин при 1600 х г. Удалите все супернатанты и приостановите червей в 1 мл M9-средства массовой информации и перенесите на микроцентрифугную трубку 1,5 мл.
- Пеллетные черви с центрифугой при 1600 х г в течение 5 мин.
- Добавьте 200 МКЛ буфера лиза SDS-DTT к червям и инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре (RT). Черви должны казаться "подмигнуть" вдоль тела, если рассматривать под легким микроскопом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Длительное воздействие буфера лиза SDS-DTT может привести к гибели червей, за которыми можно следить, наблюдая за червями. Черви, которые мертвы будет удлинить и не будет локон. - Добавьте 800 мкл ледяного буфера изоляции и смешайте, аккуратно щелкивая трубку.
- Пеллет червей в течение 1 мин при 13000 х г при 4 градусов по Цельсию, удалить супернатант и мыть с 1 мл буфера изоляции.
- Повторите шаг 1.3.5 в общей сложности пять раз, тщательно удаляя буфер изоляции каждый раз.
- Добавьте 100 л смеси протеазы из Streptomyces griseus (15 мг/мл)(Таблица материалов),растворенных в буфере изоляции, в гранулы и инкубировать в течение 10-15 мин в RT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как и в случае с буфером лиза SDS-DTT, расширенное переваривание протеазы может привести к чрезмерному расщеплению белков вдоль плазменной мембраны, предотвращая изоляцию поверхности, подвергаемой воздействию GFP с помощью магнитных бусин. - Во время инкубации с помощью протеазной смеси нанесите механические нарушения, прочинив образцы вверх и вниз по дну микроцентрифугной трубки 1,5 мл с наконечником микропипетта 200 мкл в 60–70 раз. Держите наконечник пипетки к стене микроцентрифуг трубки с постоянным давлением, чтобы правильно отмежеваться клеток.
- Чтобы определить стадию пищеварения, удалите небольшой объем (1–5 мл) смеси пищеварения, опустите его на стеклянную горку и осмотрите с помощью микроскопа культуры тканей. После 5-7 мин инкубации, фрагменты червя должны иметь заметно уменьшенную кутикулу и суспензии клеток будут легко видны.
- Остановите реакцию с 900 л коммерчески доступной холодной среды Лейбовица L-15, дополненной 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) и пенициллин-стрептомицин (окончательная концентрация при пенициллине 50 U/mL и 50 мкг/мл стрептомицина).
- Пеллет изолированных фрагментов и клеток центрифугации в течение 5 мин при 10000 х г при 4 градусов по Цельсию. Вымойте гранулы клетки с 1 мл холодного L-15-дополненных средств массовой информации в два раза больше, чтобы убедиться, что избыток мусора и кутикулы удаляется.
- Повторное высасывка гранулы клеток в 1 мл L-15-дополненных средств массовой информации и оставить на льду в течение 30 мин. Возьмите верхний слой, примерно 700–800 мкл, в микроцентрифугную трубку. Этот слой содержит клетки без клеточного мусора и будет использоваться в последующей изоляции клеток, представляющих интерес.
- Следуя инструкциям производителя, используйте автоматизированный счетчик клеток или гемоцитометр для измерения плотности клеток в 10–25 мкл изолированных клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Agar, Molecular Biology Grade | VWR | A0930 | |
CaCl2 | Sigma | C5670 | |
Contess Automated Cell Counter | Invitrogen | Z359629 | |
DTT | USBiological | D8070 | |
FBS | Omega Scientific | FB-02 | |
Fluorodeoxyuridine | Sigma | F0503 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
KCl | Amresco | O395 | |
KH2PO4 | USBiological | P5110 | |
Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
MgCl2 | Sigma | M8266 | |
MgSO4 | USBiological | M2090 | |
Na2HPO4·7H2O | USBiological | S5199 | |
NaCl | VWR | X190 | |
NaOCl (Bleach) | Clorox | ||
Penicillin-Streptomicen | Fisher Scientific | 15140122 | |
Pronase E | Sigma | 7433 | protease mixture from Streptomyces griseus |
SDS | Amresco | O227 | |
SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope | Tritech Research | ||
Sucrose | USBiological | S8010 |