Summary
Insonation من microbubbles هو استراتيجية واعدة لاجتثاث الورم في وقت بلغ متوسط القوى خفض الصوتية ، فضلا عن تقديم العلاجات المستهدفة. الغرض من هذه الدراسة هو تطوير استراتيجيات منخفضة الموجات فوق الصوتية واجب دورة ينبض nanocarriers لتعظيم غير الحرارية الاجتثاث والاوعية الدموية الدقيقة تحت الجلد لإيصال حمولة C6 الاورام الدبقية.
Abstract
نحن نعمل على تطوير الغازية الحد الأدنى من وكيل النقيض microbubble النهج العلاجية التي يوجد مقرها في السيطرة على permeabilization و / أو الاقتلاع من microvasculature بواسطة الموجات فوق الصوتية متفاوتة المعلمات ينبض. على وجه التحديد ، ونحن اختبار ما إذا كان يمكن استخدام هذه الأساليب لعلاج أورام المخ الخبيثة من خلال تقديم الأدوية والتذرية الاوعية الدموية الدقيقة. وقد أجريت الدراسات الأولية لتحديد ما إذا كان يمكن سهلت تسليم جسيمات متناهية الصغر تستهدف المخدرات الحاملة بواسطة الموجات فوق الصوتية الدمار بوساطة من "مركبة" تتألف من وكلاء التسليم بولي 100nm (lactide - CO - glycolide) (PLAGA) النانوية التي انضمت إلى microbubbles قصفت الألبومين . نحن دلالة على هذه العوامل وعوامل microbubble بين nanoparticle مركب (MNCAs). لاحظنا عندما تستهدف تحت الجلد C6 الاورام الدبقية مع الموجات فوق الصوتية ، على الفور 4،6 أضعاف الزيادة في تسليم جسيمات متناهية الصغر في الأورام MNCA علاج أكثر الأورام تعامل مع microbubbles المشترك الذي تديره مع النانوية ، وزيادة بنسبة 8.5 مرات أكثر من غير علاج الأورام. علاوة على ذلك ، في تطبيقات عديدة من السرطان ، ونحن نعتقد أنه قد يكون من المرغوب فيه لأداء استهدفت تسليم المخدرات بالتعاون مع الاجتثاث من ورم دوران الأوعية الدقيقة ، الأمر الذي سيؤدي إلى نقص الأكسجة الورم وموت الخلايا المبرمج. ولهذه الغاية ، وقد اختبرنا كفاءة غير theramal التجويف بفعل الاجتثاث الاوعية الدموية الدقيقة ، والتي تبين أن هذا النهج يثير الورم خفض نضح ، موت الخلايا المبرمج ، كبير إعاقة النمو ، والنخر. أخذت معا ، فإن هذه النتائج تشير إلى أن الموجات فوق الصوتية لدينا نهج استهداف لديه القدرة على زيادة الكفاءة العلاجية من خلال خلق نخر الورم عن طريق الاوعية الدموية الدقيقة الاجتثاث و / أو تعزيز واحد حمولة المخدرات في الاورام الدبقية.
Protocol
1. Microbubble الإنتاج
- لإعداد microbubbles الزلال (MBS) ، وضع حل 1 ٪ من ألبومين المصل في ملحي عادي في قارورة بغطاء من الغاز (octafluoropropane) أعلاه المرحلة المائية. يصوتن لفترة وجيزة الحل (30 ثانية) مع منحل بالموجات فوق الصوتية مجهزة موسعة ½ "التيتانيوم التحقيق ، وهذا وضع يشبه Optison (GE Heathcare) ، والتي يتم توفيرها في مجموعة تركيز 0،5-1،2 ميجا 10 9 خ / مل. يعني تحديد ميغابايت القطر مع عداد كولتر Multisizer. ميغابايت وكان يعني ألبومين القطر المستخدمة في هذه الدراسة 1.93um ± 1.63um.
- الى افتعال ميجا الدهون ، يعد تشتت مائي من 1 ستيارات polyethyleneglycol - 40 ملغ / مل (سيغما كيميكال ، وسانت لويس ، MO) و 2 فسفاتيديل كولين distearoyl ملغ / مل (الدهون أفانتي القطبية ، المرمر ، AL) وsonciate سابقا وصف (1.1) مع decafluorobutane الغاز. يعني تحديد قطرها ميغابايت مع عداد كولتر Multisizer. وكان الإخوان الدهون يعني القطر المستخدمة في هذه الدراسة 2.01um ± 1.29um.
2. جسيمات متناهية الصغر التصنيع
- تم تكييف هذه الأساليب من الماء في والنفط في المياه تقنية مستحلب تبخر المذيبات التي وصفها Davda (2002) وتشابيل (2008).
- يعد حل 2 ٪ بولي بولي (فينيل الكحول) عن طريق إذابة 20G من بولي في 1000 مل من الماء (DI) منزوع الأيونات. حل يسمح بحل كاملا على طبق من اثارة بين عشية وضحاها. حل الطرد المركزي في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة مع وتصفية تصفية 0.22μm معقمة لإزالة أي PVA المتبقية غير منحل.
- الى افتعال ألبومين المصل البقري (BSA) تحميل بولي (اللبنيك المشترك ، حمض الجليكوليك) (PLAGA) النانوية (NPS) ، ويحل 180mg من لم يسبق لهم اللعب في 85:15 PLAGA كلوريد الميثيلين 6ml (MC) في قارورة زجاجية التلألؤ. دوامة الحل MC / PLAGA لمدة 2 دقيقة.
- حل الحمولة المطلوب (15mg من BSA) في 1.5 مل من برنامج تلفزيوني. إضافة الحل PBS / جيش صرب البوسنة في جزأين في حل PLAGA / MC مع vortexing متقطعة. حل مكان على الجليد ل5minutes ويصوتن في 45W لمدة 120 ثانية.
- إضافة MC / PLAGA / حمولة / PBS حل ل24ml من 2 ٪ بولي ، في جزأين مع vortexing المتوسطة.
- وضع الحل على الجليد ل5minutes ويصوتن في 45W لمدة 120.
- تحريك NP مستحلب لمدة 12 ساعة على طبق من ضجة في غطاء للسماح للالدخان تبخر مولودية والاستقرار NP.
- الطرد المركزي للتعليق على 20000 دورة في الدقيقة 25minutes في 4 درجات مئوية مرتين لعزل مصادر الطاقة النووية وإزالة PVA المتبقية. Resuspend الكرية في 8ml المياه دي وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 1000 خطة إدارة المبردات في 4 درجات مئوية لعزل السكان 100nm مصادر القدرة النووية.
- عزل طاف وفلاش تجميده عند -80 درجة مئوية. Lyophilize عينة مجمدة لمدة 48 ساعة. تخزين جزيئات مجفد في dessicator في -80 حتى وقت الاستخدام درجة مئوية.
3. مركب التسليم تصنيع السيارات (بروتوكول مقتبس من الملاحظات الكيمياء VisEn)
- تحويل VivoTag680 إلى وظيفة سطح كربوكسي
- الجمع بين one قنينة من VivoTag680 مع 50 ميكرولتر من 1.0 M HEPES ، ودرجة الحموضة 7 و أنهيدريد السكسينيك (2.5 ملغ ، 25 ìmol) في 25 ميكرولتر DMSO. إضافة 50 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم 1.0 M لهذا الحل ، خلطها بشكل تام ؛ تسمح حل للرد لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء. تنقية جزيئات باستخدام بيو راد BioGel (P100 ، وسط) يبلغ حجمه بنسبة 0.1 العازلة MES M ، 6.0 درجة الحموضة. جمع الفرقة الخضراء.
- تفعيل كربوكسي المعدلة VivoTag680
- الجمع بين كربوكسي المعدلة VivoTag680 حصلت في 0.1 م العازلة زارة التربية والعلم ، ودرجة الحموضة 6 ، مع 1 ملغ من 1 الأثيل - 3 - (3 - dimethylaminopropyl) - carbodiimide (EDC) و 2.2 ملغ من N - hydroxysulfosuccinimide (سلفو - NHS). السماح للرد لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- تنقية جزيئات المنشط من وكيل تفعيل الزائدة (EDC) عن طريق الترشيح باستخدام الجل بيو راد BioGel (P100 ، وسط) يبلغ حجمه بنسبة 0.1 العازلة MES م ، ودرجة الحموضة 6.0 وجمع الفرقة الخضراء. المتقارن على الفور إلى تنشيط الجزيئات التي تحتوي على جزيئات الأمينات (مثل جيش صرب البوسنة محملة الجسيمات النانوية). السماح للحل للرد لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة. وتنقيته من NPS مترافق أمين EDC الزائد عن طريق الطرد المركزي في 20000 دورة في الدقيقة ل60min في 4 درجات مئوية ، وسكب قبالة طاف بعد الطرد المركزي وإعادة التعليق في المخزن MES 0.1.
- أتوقف هنا لتلفيق VivoTag680 NPS المفتاحية للدراسات تسليم المخدرات.
- اقتران كربوكسي المعدلة PLGA - BSA - VivoTag680 النانوية (NP680) لMicrobubbles الزلال
- الجمع بين NP680 حصلت في 0.1 م العازلة زارة التربية والعلم ، ودرجة الحموضة 6 مع 1 ملغ من 1 الأثيل - 3 - (3 dimethylaminopropyl) - carbodiimide (EDC) و 2.2 ملغ من N - هيدروكسي sulfosuccinimide (سلفو - NHS). السماح للحل للرد لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- تنقية جزيئات المنشط من EDC الزائد عن طريق الطرد المركزي في 20000 دورة في الدقيقة ل60min عند 4 درجات مئوية ، وسكب قبالة طاف بعد الطرد المركزي. Resuspend النانوية في المخزن MES 0.1.
- غسل ميجا الألبومين ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني degassed لإزالة الفائض من حل جيش صرب البوسنة.
- المتقارن على الفور إلى تنشيط الجزيئات التي تحتوي على جزيئات الأمينات (Microbubbles الزلال مثلا). تسمح NP680 حل للرد لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة. تنقية NP680 microbubbles مترافق (MNCA) من NP680s غير منضم عن طريق الغسيل ثلاث مرات مع PBS degassed.
- تحديد تركيز MNCAs باستخدام عداد كولتر.
4. الاورام النموذجي
وكانت جميع التجارب على الحيوانات في الامتثال لبروتوكول الحيوانية التي وافقت عليها جامعة فرجينيا رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام.
- وقدمت C6 الورم الفئران Giloma خط الخلية الدكتور جايسون شيهان للأشعة فوق البنفسجية (شارلوتسفيل ، فرجينيا).
- تم اختبار خط لضمان الخلايا خلايا الميكوبلازما كانت حرة.
- الحفاظ على الخط في الخلية F - 12K خلطة غذائية تستكمل مع مصل الحصان 16 ٪ و 3 ٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1 ٪ القلم بكتيريا (Gibco ، الولايات المتحدة) في 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2
- تلقيح الفئران C57BLJ6/Rag1 (جاكسون) مع 3 × 10 6 خلايا الورم C6 Giloma علقت في 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني تحت الجلد في hindlimb اليسار. السماح للنمو الورم لمدة 12 يوما للوصول إلى الحد الأقصى لقطر 10MM - 8.
5. الموجات فوق الصوتية في التطبيق فيفو
- تخدير الفئران مع الحقن داخل الصفاق الجمع (IP) من هيدروكلوريد الكيتامين (60 من وزن الجسم ملغ / كلغ) وزيلازين (0.1 وزن الجسم ملغ / كلغ) قبل العلاج.
- إعداد مخدر صيانة هيدروكلوريد الكيتامين (20 من وزن الجسم ملغ / كلغ) وزيلازين (0.3 وزن الجسم ملغم / كغم). إدارة حسب الحاجة.
- يقني ؛ يدخل القنية السياق ذيل كل حيوان لادارة (الرابع) في الوريد ميغابايت ، MB / NP أو حل MNCA.
- قياسات الورم نضح
- رابعا لبث حل MB دهن (1x10 8 ميجا / غرام من وزن الجسم في 0.3 مل من المياه المالحة 0.9 ٪) بمعدل 15μl/min مع مضخة التسريب المستمر (جهاز الدكتوراه في جامعة هارفارد عام 2000 ؛ جهاز هارفارد ، Holliston ، MA).
- تم استخدام التصوير بالموجات فوق الصوتية سيكويا Acuson 512 نظام (سيمنز للحلول الطبية ، ماونتن فيو ، كاليفورنيا) مجهزة 8 13 ميغاهرتز مسبار 15L8 الخطية في هذه الدراسة لتحديد حجم الورم نضح النقيض المحسن. الزوجان التحقيق 15L8 للورم مع الموجات فوق الصوتية هلام المياه القائمة (باركر مختبرات Aquasonic 100 ؛ باركر المختبرات ، وشركة ، فيرفيلد ، نيو جيرسي). تفحص الورم في الوضع - B للحصول على أفضل تصوير الطائرة.
- في المقابل وضع نبض (CPS) تسلسل ، والحصول على شريط فيديو مستمر التقاط microbubbles كثافة إشارة قبل 5 ثوان ، وبعد 20 ، وعالية السعة "انفجار" نبض بمعدل إطار 13Hz. تكرار القياسات في التصوير الطائرات الأربع.
- الانتظار عشر دقائق للبث ميجا الزلال والشروع في العلاج العلاجية التردد المنخفض الدهون ميجا للسماح لمسح من التداول.
- الموجات فوق الصوتية العلاجية العلاج
- بعد عشر دقائق القياسات نضح الورم (5.3) زوجين قطرها 0.75 ''1 ميغاهيرتز محول غير مركزة (A314S ؛ Panametrics ، التايم ، ماجستير) في الجلد فوق الورم الجناح. رابعا ميغابايت an لبث الزلال (1 X10 5 ميجا / غرام من وزن الجسم في 0.3 مل من المياه المالحة 0.9 ٪) ، MB / NP (1 X10 5 ميجا / ز وNPS 0.2 ميكروغرام / غرام من وزن الجسم في 0.3 مل من 0.9 ٪ المالحة) أو MNCA حل (1 X10 5 وزن الجسم MNCAs / غ في 0.3 مل من المياه المالحة 0.9 ٪).
- تسليم المعاملة المخدرات
- Insonate لمدة ستين دقيقة مع "1 - انفجر" تسلسل نبض (5.4.2.2) خلال استمرار تدفق مصادر الطاقة النووية ، وشارك في حقن ميجا وNPS ، أو MNCAs (5.4.1).
- في "1 - انفجر" تسلسل النبض يتكون من 100 ميغاهرتز على التوالي sinusoids 1 (دورة العمل = 0.00002) في كل من الذروة إلى الذروة 1V السعة من مولد الموجي (AFG - 310 ؛ تكترونكس ، شركة ، بيفيرتون ، OR). تضخيم إشارة الموجي من 55 ديسيبل RF مع مضخم الطاقة (ايني 3100LA ؛ صناعات الالكترونية للملاحة ، ريتشاردسون ، تكساس).
- الجر المعاملة
- مطابق ل5.4.2.1 ، insonate لكن مع "5 - المتوسطة الانفجار" أو "5 - انفجر -- الموسعة" تسلسل ينبض
- "5 المتفجر المتوسطة" تسلسل النبض يتكون من 5000 ميغاهيرتز sinusoids 1 (دورة العمل = 0.005) لكل من الذروة إلى الذروة 1V السعة. "5 - Exteneded المتفجر" تسلسل النبض يتكون من 10000 ميغاهيرتز sinusoids 1 (دورة العمل = 0.01) في كل من الذروة إلى الذروة 1V السعة.
- أثناء فترة التجربة رصد درجة حرارة الورم عن طريق ادخال ابرة التحقيق الحرارية (أوميغا تي النوع ، HYP1-30-1/2-TG-60-SMPW-M) 2cm داخل الورم. قياسات درجات الحرارة سجل كل خمس دقائق.
- تكرار القياسات نضح ورم كما هو موضح في الدقائق العشر التالية 5.3 العلاجية.
6. ورم الإرواء الكمي
- باستخدام برنامج CPS على سيكويا ، أدخل ACQ الوضع. حدد ال(ه) من مصلحة المنطقة التي تشمل حجم الورم كاملة. سيتم إنشاء منحنيات الانتعاش نضح من النموذج Y = A (1 -- البريد βt) + C (Sadlowski 2002 ؛ Chromas 2001 ؛ يه 2004) التي تصلح لبيانات النيابة العامة. تقييم β ، وهو مقياس نسبي للخلية الدم الحمراء سرعة ، قبل العلاج وبعد العلاج.
- تصدير ملفات النيابة العامة لخارج خط التحليل. تحويل البيانات إلى ملفات افي. كسر افي الملفات في تسلسل الصور الإطار حسب الإطار. كومباك باستخدام Fortan البصرية ، أو حزمة برامج مماثلة ، وتوليد وقت بلغ متوسط صورة من جميع الأطر نبض التدميرية إلى 8 ثواني بعد نبض التدميرية.
- لتحديد منطقة الورم perfused ، وذلك باستخدام ImageJ البرمجيات ، وتطبيق الحد الأدنى من 247 إلى وقت لدغة 8 متوسط النيابة العامة وتحديد صورة بكسل في المئة زيادة في حجم الورم. وبلغ متوسط تراكب المقابلة B - وضع الصور مع الوقت صورة thresholded لتحديد منطقة الورم بدقة.
- perfused في المئة في المتوسط لمدة لا تقل مساحة من مقاطع CPS أربعة إلى الحصول على مساحة النهائي perfused في نقطة زمنية معينة لورم معين.
- يأخذ المنتج في المئة من مساحة perfused (6.4) وβ (0.1) لتحديد نسبة تدفق الدم للورم.
7. Biodistribution جسيمات متناهية الصغر في استئصال ورم
- قبل اثني عشر يوما للعلاج مع fluorescently المسمى الفئران مكان NPS على نظام غذائي منخفض alfasprot (هارلان ، في انديانابوليس) للحد من تألق ذاتي الناجمة عن تشاو الماوس العادي عند التصوير.
- حلق موقع التصوير (الجناح إلى الكبد) لإزالة كل الشعر.
- إزالة الشعر المتبقية مع وكيل إزالة الشعر الكيميائية ، مثل ناير.
- شطف جميع مزيل الشعر الكيميائية المتبقية أو حرق المواد الكيميائية قد تحدث.
- الفئران الصورة على نظام FMT (VisEn الطبية) قبل العلاج وساعات 0 ، 1 ، 4 ، و 24 بعد العلاج كما هو موضح في 5.4.2.
- قبل التصوير مع تخدير الفئران حقنة تركيبة IP من هيدروكلوريد الكيتامين (60 من وزن الجسم ملغ / كلغ) وزيلازين (0.1 وزن الجسم ملغم / كغم). مكان الماوس على خرطوشة التصوير. الحصول على صور انعكاس الضوء الأبيض في وسائط الفلورسنت. تنفيذ الفلورسنت التصوير تصوير الشعاعي الطبقي في القناة VT680.
- توظيف البرمجيات FMT لتوليد اعادة بناء 3D البيانات باستخدام التصوير معادلة تطبيع ولد. بعد إعادة الإعمار ، حدد حجم الفائدة (لوكالة المستقلة للأنباء) عن طريق رسم المنطقة ذات الاهتمام (ROI) في جميع طائرات التصوير 3 (X ، Y ، Z). سيتم إنشاء قيمة يعني الفلورسنت واجمالى حجم وتركيز ملون تألقي وكالة المستقلة للأنباء ، وذلك بسبب NPS BSA الموسومة fluorescently ، لوكالة المستقلة للأنباء التي تشمل القدمين والكبد.
8. معدل نمو الورم
- تقييم حجم الورم عن طريق أخذ القياسات اليومية باستخدام الكوادر الرقمية. حجم الورم باستخدام حساب تقريبي الإهليلجي ؛ V = π ABC 1 / 6. حيث أ ، ب ، ج هي بأقطار الأقصى للورم يقاس في ثلاث طائرات المتعامدة.
9. ورم معالجة وتحليل
- سبعة أيام بعد الموت ببطء الحيوانات المعالجة. Heparinized يقني ؛ يدخل القنية البطين الأيسر والدم يستنزف مع 2 ٪ 10ML تريس CaCl 2 العازلة (0.68 ملم) الارواء ، تليها تريس 10ML الاحتياطي CaCl 2 (0.68 ملم) ، ولكل لمدة 10 دقائق عند 100 مم زئبق.
- نضح إصلاح الأنسجة ، مع ضخ بارافورمالدهيد 4 ٪ في برنامج تلفزيوني (4 درجات مئوية) ل10minutes عند 100 مم زئبق. السماح لإصلاح العينة لمدة 60 دقيقة.
- عينات الإنتاج ، وتضمينها في البارافين ، ويقتطع من 5 ميكرون المقاطع.
- أداء قياسي الهيماتوكسيلين - يوزين تلطيخ لتقييم التغيرات النسيجية التي قد حدث نتيجة التعرض للموجات فوق الصوتية.
- لكشف الخلايا أفكارك ، واستخدام محطة deoxynucleotidyl deoxyuridine بوساطة ترانسفيراز ثلاثي الفوسفات نك وسم نهاية (النفق) مقايسة (ApoptTag عدة ، Intergen شركة نوركروس ، GA ، الولايات المتحدة).
10. ممثل النتائج
1. تصنيع جسيمات متناهية الصغر (2.0)
- إذا بريفورميد هذا البروتوكول بشكل صحيح وسوف يكون NPS كروية الشكل ، على النحو الذي يحدده المسح الإلكترون مصغرة (SEM) ، ولها حول توزيع جاوس 100nm ، وفقا لما يحدده تقنيات تشتت الضوء. وتظهر نتائج ممثلة في الشكل 1.
2. استهدفت تسليم المخدرات (5.4.1)
- بناء على دراسات أجريت في مختبر نشرت لدينا (أغنية عام 2002 ، تشابيل 2008) ونتائج غير منشورة موجودة في الشكل 2 ، بالموجات فوق الصوتية النتائج الدمار microbubble في تعزيز تقديم النانوية داخل الأوعية الدموية إلى الأنسجة السرطانية. لقد أظهرنا أيضا أن لدينا تقنية تسليم النتائج MNCA في تسليم جسيمات متناهية الصغر مشددة في أعقاب مباشرة العلاج.
3. ورم تذرية (5.4.3)
- وقد أظهرت لنا أن طويلة الدمار microbubble بالموجات فوق الصوتية ، في دورات العمل منخفض نسبيا (،005-،01) ، والنتائج في الاجتثاث الميكانيكية للmicrovasculature الورم وتراجع نمو الورم. إذا تم تنفيذ هذا البروتوكول بشكل صحيح وينبغي للمرء أن يتوقع تغييرات في (ط) معدل نمو الورم (الشكل 3) ، (ب) ديناميكا الدم الورم (الشكل 4) ، (ج) منطقة نخرية ، وموت الخلايا المبرمج (رابعا).
الشكل 1. توصيف جزيئات تحمل PLAGA جيش صرب البوسنة. (A) SEM صورة ملفقة النانوية بشكل صحيح. (ب) SEM صورة ملفقة النانوية بشكل غير صحيح.
الشكل 2 : (أ) الإسفار بوساطة التصوير المقطعي (FMT) صور الموجات فوق الصوتية العلاج (أعلى) ، وفرضه السيطرة المعالجة (القاع) تحت الجلد مباشرة علاج الاورام الدبقية التالية مع MNCAs ، حيث النانوية (NPS) هي التي تحمل إشارات 680 مضان الرمادي على مستو الإثارة ضوء الصورة.
الشكل 3. تغير الممثل أضعاف في نمو الورم التالية insonation microbubble مع بروتوكول تمديد خمس انفجار ينبض.
الشكل 4. B - وضع (A ، C) وعلى النقيض محسنة التصوير بالموجات فوق الصوتية (B ، D) صورا لورم تحت الجلد دبقي C6 في الماوس. في صورة المعالجة الأولية (A) وقد تتبعت حدود الورم ناقص الصدى معظمها في الزرقاء. يظهر الوقت تعزيز المتوسط بعد الحقن في الوريد لعامل تباين في (ب) المعالجة. Posttreatment ، قبل الحقن النقيض من ذلك ، الورم مرة أخرى معظمها ناقص الصدى (D). بعد الحقن النقيض من ذلك ، هناك زيادة أقل بشكل ملحوظ في الورم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
خطوات حاسمة
إقناء ؛ إدخال القنية من الوريد ذيل الفأر :
ويمكن حقن في الوريد إلى الوريد الماوس الذيل يكون الإجراء تحديا. ومع ذلك ، يمكن للقسطرة الوريد الذيل تحسن كثيرا من احتمال نجاح الحقن. لجعل القسطرة ، والانحناء مرارا جيئة وذهابا إبرة قياس 25 حتى فواصل من المحور. إدراج نهاية حادة في نهاية أنابيب PE 20 وختم الاتصال مع الغراء السيليكون. لتحضير القسطرة لإقناء ؛ إدخال القنية ، نعلق حقنة محملة 1 ٪ heparinized المالحة إلى كاثر وسائل لبث في الفضاء القتلى القسطرة. موقف ماوس تخدير على جانبها حتى الوريد الذيل الأفقي في العرض. تمدد الذيل بالماء الدافئ (105 ° -- 110 درجة فهرنهايت). ادخال الإبرة في الوريد. إذا سوف الدم ناجحة يدخلون عادة القسطرة. تحقق من أن الإبرة في الوريد عن طريق مسح عرق مع كمية صغيرة من المياه المالحة. تأمين القسطرة في مكان مع الشريط قبل إرفاق المحقنة إلى مضخة الحقن في الوريد.
إعادة تعليق جسيمات متناهية الصغر :
قد النانوية lyophilization التالية الكلي. Resuspend الجزيئات في برنامج تلفزيوني ، لفترة وجيزة دوامة مرارا وتكرارا ويصوتن (10 ثانية) في حمام مائي الصوتية. من الأهمية بمكان resuspend صحيح العينة مجفف بالتجميد. تميز مع تعليق المجهري SEM وتقنيات تشتت الضوء التالية lyophilization وإعادة تعليق.
تعديلات ممكنة :
من حيث تعديل بروتوكول تصنيع جسيمات متناهية الصغر ، BSA بمثابة دواء مركب ، ويمكن أن يكون متبادل للعديد من العوامل العلاجية. اعتمادا على الذوبان وكيل العلاجية ، يمكن أن تكون ملفقة النانوية ومستحلب النفط في المياه أو مستحلب الزيت في الماء في النفط. ويمكن أيضا كفاءة التحميل والافراج عن وكيل العلاجية من NPS PLAGA ، يمكن تعديلها بشكل كبير اذا شئت. لزيادة كفاءة التحميل ، زيادة وزن التحميل / بالوزن من المخدرات في ناقلات البوليمر عبر الاستفادة المثلى من معلمات تلفيق NP. لتكييف معدل الافراج عن وكيل العلاجية ، ويختلف معدل التحلل ثابت عبر التغييرات في الوزن الجزيئي ونسبة اللاكتيك / الجليكوليك من PLAGA. بواسطة talioring كلا من الكفاءة ومعدل التحميل الافراج عن وكيل العلاجية ، من داخل وPLAGA NPS ، يمكن تسليم المطلوب تركيز المحلية لالأنسجة. من حيث تعديل بروتوكول التسليم ، وأهم العوامل هي درجة الدمار MNCA بالموجات فوق الصوتية وpermeabilization الاوعية الدموية الدقيقة. وقد أفيد بأن microbubbles قصفت ألبومين لها نصف عمر قدره 1.3 ± 0.69 دقيقة (يعني ± SD) (Optison 2008). ونحن نفترض أن التسريب المستمر لفترات طويلة وكيل وتطبيق الموجات فوق الصوتية ستزيد من مدى permeabilization microvessel. العلاج عن طريق زيادة الوقت ونحن نهدف إلى زيادة permeabilization عابر للmicrovasculature.
ويمكن تعديل وعدم بروتوكول التذرية الحرارية الميكانيكية عن طريق تغيير تركيز ميغابايت أو الضغط ذروة الموجات فوق الصوتية. ومن المتوقع أن زيادة تركيز ميغابايت و / أو الموجات فوق الصوتية ذروة الضغط وزيادة درجة الأضرار التي لحقت الأوعية الدموية للورم.
التطبيقات :
نحن نعمل على تطوير تقنيات لخفض الطاقة الصوتية التي يتطلبها عبر الجمجمة الموجات فوق الصوتية عالية الكثافة مركزة (HIFU) للوصول إلى النتيجة المرجوة العلاجية.
جزئيا ، بسبب المضاعفات المرتبطة العلاج من خلال الجمجمة وأهمية الأنسجة المحيطة ، والأنسجة السرطانية التذرية الحرارية مع كثافة عالية تركز الموجات فوق الصوتية (HIFU) لم يتحقق بعد الاستخدام الواسع النطاق كخيار علاجي لسرطان الدماغ. وقد أشارت النتائج الأولية من المرضى الثلاثة الأولى من قطار العلاج السريري العميق HIFU الدماغ في شبه الجر النتائج درجات الحرارة في التدفئة المركزية في الجمجمة (McDannold 2009). المفتاح لنجاح HIFU كعلاج السريرية لعلاج أورام المخ عبر الجمجمة هو القدرة على توطين إيصال الطاقة الصوتية إلى المنطقة المحددة جيدا. معقد القدرة على توفير الطاقة من خلال واجهات الصوتية العظم أو الهواء ، مثل الجمجمة واستئصال الجراحي السابقة ، التي تولد الطاقة والمرحلة الانحرافات مثل الطاقة بالموجات فوق الصوتية هو الموهن على طول مسار الانتشار (Tanter 1998). هذه الانحرافات تسهم في كثير من الأحيان إلى ما قبل التنسيق للتدفئة (McDonnald 2009) وcavitations في الأنسجة السليمة.
على مدى السنوات العديدة الماضية ، استقطب استخدام microbubbles لخفض الطاقة الصوتية للاستهداف ، واختلال BBB عكسها والتذرية ورم كبير الفائدة البحوث (Hynynen 2001 ، Sheikov 2004 ، McDannold 2006a ؛ 2006b ، Meairs 2005). وقد أثبتت McDannold آخرون (2006a) أن الحقن داخل الأوعية الدموية من microbubbles في وقت العلاج HIFU أدى إلى تخفيض 91 ٪ فيالوقت عتبة متوسط القوة الصوتية عن الأضرار الميكانيكية بالمقارنة مع الضوابط التي لا microbubbles كانوا حاضرين ، وتبين إمكانات لتوليد آفات مع ارتفاع درجات الحرارة المنخفضة. تخفيض عتبة الحرارية لتشكيل الآفة بدوره يقلل من احتمال تراكم الحرارة في النسيج المستهدف الخروج أو العظام. علاوة على ذلك ، فقد تبين أن الإدارة في الوريد من microbubbles في وقت نتائج الموجات فوق الصوتية في العلاج ، مترجمة عابرة افتتاح BBB ، مع ما يقرب من اثنين أوامر سلطات مقادير أقل من تلك المطلوبة لتشكيل الآفة.
هذا هو الهدف من هذا العمل على تطوير تقنيات الموجات فوق الصوتية ، microbubbles لخفض السلطة على حد سواء الصوتية المطلوبة من قبل HIFU عبر الجمجمة والتحكم في درجة permeabilization الاوعية الدموية الدقيقة. واستهدفت اثنين من التطبيقات العلاجية المحددة لهذا العمل في الدماغ تسليم المخدرات والاجتثاث غير الحرارية. يمكن التحكم في مستويات النفاذية النسبية لزيادة والتذرية دائم من خلال تعديل مستويات من الطاقة الصوتية اعتمادا على ما إذا كان التركيز على تحسين تسليم المخدرات واجتثاث الاوعية الدموية الدقيقة دائمة ، أو مزيج من تسليم المخدرات ودائم الاجتثاث الاوعية الدموية الدقيقة. هذه القدرة المحتملة للتحكم في كيفية الاستجابة microvessels يخلق فرصة لتطوير استراتيجية مختلفة من التباديل معالجتنا لتطبيقات محددة العلاجية عبر الجمجمة. ونحن نعتقد أن هذا النهج لديه القدرة على تحويل جذري في كيفية تعامل أورام الدماغ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
بدعم من المعاهد الوطنية للصحة HL74082 R01 ، ومؤسسة هارتويل ، وجراحة الموجات فوق الصوتية المركزة مؤسسة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ApoptTag kit | Intergen Co. | S7110 | |
| un-capped 85:15 poly(lactic-co-glycolic acid) (PLAGA) | Lakeshore Biomaterials | Custom | |
| Vivo Tag 680 | VisEn Medical | 10120 | Used to Tag BSA |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | 363136 | |
| MicroTip Sonicator | Misonix | S-4000 | |
| Sequoia | Simons Medical | P.O.A | Equipped with CPS |
| FreeZone 2.5 | Labconco Corp. | 7670020 | Equipped with Nitrogen Trap |
| Methylene chloride (CH2Cl2) | Fisher Scientific | D37-500 | |
| FMT 250 | VisEn Medical | P.O.A | |
| F-12K Nutrient Mixture | GIBCO, by Life Technologies | 21127-022 | |
| polyethyleneglycol-40 stearate | Sigma-Aldrich | 9004-99-3 | |
| distearoyl phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipid, Inc | 770365 | |
| Multisizer Coulter Counter | Beckman Coulter Inc. | P.O.A | |
| Waveform Generator | Tektronix, Inc. | AFG-310 | |
| water-based ultrasound gel | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic 100 | |
| Infusion pump | Harvard Apparatus | Harvard Apparatus PHD 2000 | |
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide (EDC) | Pierce, Thermo Scientific | 25952-53-8 | |
| N-hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS) | Pierce, Thermo Scientific | 106627-54-7 | |
| Succinic anhydride | Sigma-Aldrich | 603902 | |
| Power Amplifier | Electronic Navigation Industries | ENI 3100LA | |
| Needle Thermocouple Probe | Omega Engineering, Inc. | HYP1-30-1/2-T-G-60-SMPW-M | |
| BioGel (P100, medium) | Bio-Rad | 150-4170 | |
| .75’’ diameter 1 MHz unfocused transducer | Panametrics | A314S |
References
- Chappell, J., Song, J., Burke, C., Klibanov, A., Price, R. Targeted delivery of nanoparticles bearing fibroblast growth factor-2 by ultrasonic microbubble destruction for therapeutic arteriogenesis. Small. 10, 1769-1777 (2008).
- Chomas, J. E., Pollard, R., Wisner, E., Ferrara, K. Subharmonic Phase-Inversion for Tumor Perfusion Estimation. IEEE. 2, 1713-1716 (2001).
- Davda, J., Labhasetwar, V. Characterization of nanoparticle uptake by endothelial cells. Int J Pharm. 233, 51-51 (2002).
- Hynynen, K., McDannolod, N. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220, 640-646 (2001).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Microbubble contrast agent with focused ultrasound to create brain lesions at low power levesl: MR imaging and histological study in rabbits. Radiology. 241, 95-106 Forthcoming.
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Targeted disruption of the blood-brain barrier with focused ultrasound: Association with cavitation activity. Phys Med Biol. 51, 793-807 Forthcoming.
- McDannold, N., Clement, G. T., Black, P., Jolesz, F., Hynynen, K. Transcranial magnetic resonance imaging- guided focused ultrasound surgery of brain tumors: initial findings in 3 patients. Neurosurgery. 66, 323-332 (2009).
- Meairs, S., Alonso, A.
- Optison, products insert. , Food and Drug Administration. (2009).
- Sadlowskie, A., Chromas, J., Pollard, R., Bloch, S., Griffey, S., Wisner, W., Ferrara, K. W. Mean Flow Rate and Intergrated Perfusion Estimates Obtained with Contrast-Assisted Ultrasound. IEEE Ultrasonics Symposium. , 1977-1980 (2002).
- Song, J., Chappell, J. C., Qi, M., VanGieson, E. J., Kaul, S., Price, R. J. Influence of injection site, microvascular pressure and ultrasound variables on microbubble-mediated delivery of microspheres to muscle. J Am Coll. Cardiol. 39, 726-731 (2002).
- Sheikov, N., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F., Hynynen, K. Cellular mechanisms of blood-brain barrier opeing induced by ultrasound in the presences of microbubbles. Ultrasound Med. Biol. 30, 979-989 (2004).
- Tanter, J., Fink, M. Focusing and steering through absorbing and aberrating layers: Application to ultrasonic propagation through the skull. J Acoust Soc Am. 103, 2403-2410 (1998).
- Yeh, C. K., Kruse, D. E., Lim, M. C., Redline, D. E., Ferrara, K. W. A New High Frequency Destruction/Reperfusion System. IEEE. 1, 433-436 (2003).
