Summary
微泡Insonation是很有前途的战略肿瘤消融时间平均减少声学权力，以及为靶向给药疗法。本研究的目的是开发低占空比超声脉冲战略和nanocarriers最大限度地发挥非热微血管消融和有效载荷运送到皮下C6脑胶质瘤。
Abstract
我们正在开发的微创造影剂微泡造影剂的基础微血管的通透性和/或消融是由不同的超声脉冲参数控制的治疗方法。具体来说，我们正在测试这种办法是否可用于药物输送和微血管消融治疗恶性脑肿瘤。已经进行初步研究，以确定是否有针对性的药物轴承纳米粒子交付，可以通过100nm的聚（乳酸 - 乙醇酸）（PLAGA）坚持白蛋白炮轰微泡的纳米粒子组成的“复合”投递代理的超声导破坏促进。我们这些代理商表示微气泡纳米粒子复合代理人（MNCAs）。当与超声定位皮下C6脑胶质瘤，我们观察到纳米粒子交付立即与与纳米粒子和8.5倍的增长比非治疗肿瘤共同管理的微泡治疗肿瘤在MNCA治疗肿瘤中增加了4.6倍。此外，在许多癌症的应用，我们认为它可能是可取的执行结合消融肿瘤微循环，这将导致肿瘤的缺氧和凋亡的靶向给药的。为此，我们已经测试非theramal气蚀引起的微血管消融的疗效，表明这种方法引出肿瘤灌注减少，细胞凋亡，显着的生长抑制作用，并坏死。两者合计，这些结果表明，超声定位的方法有可能增加肿瘤坏死创建通过微血管的消融和/或同时提高药物的有效载荷在胶质瘤治疗的效率。
Protocol
1。微泡生产
- 为了准备白蛋白微泡（MBS），放置在一个烧瓶血清白蛋白的1％溶液与水相中的气毯以上（octafluoropropane）生理盐水。简言之超声配备一个扩展½“钛探头超声粉碎机（30秒）的解决方案，这一提法是Optison（GE Heathcare），这是在0.5 - 1.2 × 10 9 MBS /毫升的浓度范围内提供类似。确定平均MB与Multisizer库尔特计数器直径白蛋白MB的直径平均在这项研究中使用了1.93um ± 1.63um。
- 编造脂质MBS，准备1 mg / ml的聚乙二醇- 40硬脂酸（Sigma公司，圣路易斯，密苏里州）和2毫克/毫升distearoyl磷脂（阿凡提极地血脂，雪花石膏，AL）的水性分散体和sonciate如以前（1.1）decafluorobutane气体。测定平均MB的直径与Multisizer库尔特计数器。在这项研究中所使用的脂质MB的平均直径为2.01um ± 1.29um。
2。纳米粒子的制备
- 这些方法适应的水在油中水乳化溶剂蒸发技术Davda（2002年）和Chappell（2008）所描述。
- 准备在1000毫升的去离子（DI）水溶解的PVA20克2％的聚（乙烯醇）PVA溶液。允许不小的轰动板的解决方案，充分溶解过夜。离心10分钟，用0.22μm的无菌过滤器的过滤器在1000 RPM的解决方案，以消除任何残留不溶的聚乙烯醇。
- 编造牛血清白蛋白（BSA）加载聚（乳酸 - 乙醇酸）（PLAGA）纳米粒子（NPS），溶于6毫升二氯甲烷（MC）的玻璃闪烁瓶180mg封顶85:15 PLAGA。旋涡2分钟MC / PLAGA解决方案。
- 溶解于1.5毫升的PBS所需的有效载荷（牛血清白蛋白15毫克）。在两部分的PBS / BSA溶液加入间歇振荡的PLAGA / MC解决方案。 5分钟冰和解决方案，45W超声为120秒。
- 添加MC / PLAGA /有效载荷/ PBS液的2％聚乙烯醇24毫升，在两个部分中间震荡。
- 配售5分钟冰的解决方案和120超声在45W。
- 搅拌12小时在通风柜的轰动板的NP乳液，让MC和NP稳定蒸发。
- 离心20,000 rpm的暂停25分钟在4 ° C两次分离粒子，除去残留的聚乙烯醇。重悬在DI水和离心机8毫升沉淀10分钟在1000 RMP 4 ° C至隔离核动力源的100nm的人口。
- 分离上清和闪光灯冻结在-80 ° C。冻干48小时冷冻样品。商店dessicator冻干颗粒于-80 ° C，直到使用时间。
3。综合配送车辆制造VisEn化学债券议定书“（改编）
- VivoTag680转换羧基表面功能
- 结合50μL1.0 M羟乙基，pH值7和丁二酸酐在25μL的DMSO（2.5毫克，25 ìmol）之一VivoTag680小瓶。这个解决方案，充分混合添加1.0 M NaOH溶液50μL;允许解决方案，在避光室温反应2小时。净化颗粒使用Bio - Rad公司BioGel（P100，中）与0.1 M的MES缓冲液，pH值6.0洗脱。收集的绿色带。
- 活化羧基改性VivoTag680
- 结合羧基改性VivoTag680在0.1 M的MES缓冲液，pH值6取得，与1毫克1 - 乙基-3 - （3 dimethylaminopropyl） - 碳二亚胺（EDC）和2.2毫克（N -羟基氨基NHS）。允许反应在室温下2小时。
- 净化凝胶过滤多余的激活剂（EDC）激活颗粒，使用Bio - Rad公司BioGel（P100，中），用0.1 M的MES缓冲液，pH 6.0洗脱，收集的绿色带。立即共轭含胺分子（如牛血清白蛋白纳米微粒）的活性粒子。允许解决方案的反应在室温下2小时。胺共轭粒子在20000转离心60分钟，在4 ° C，浇注，离心后的上清液和0.1的MES缓冲resuspending从过剩的EDC纯化。
- 停在这里编造VivoTag680标记为给药研究纳米粒子。
- 羧基改性的PLGA - BSA的VivoTag680纳米粒子（NP680）共轭白蛋白微泡
- 结合NP680在0.1 M MES缓冲液，pH值6获得1毫克，1 - 乙基-3 - （3 dimethylaminopropyl）碳二亚胺（EDC）和N -羟基- sulfosuccinimide（磺酸基NHS）的2.2毫克。让溶液在室温下1小时反应。
- 净化多余的EDC激活纳米粒子在20000转离心60分钟4 ° C，浇注，离心后的上清液。悬浮纳米粒子在0.1的MES缓冲液。
- 洗白蛋白MBS在脱气PBS 3倍，从解决方案中删除多余的牛血清白蛋白。
- 立即共轭含胺分子（如白蛋白微泡）的活性粒子。 NP680的解决方案，允许在室温下反应2小时。净化与脱气PBS洗涤三次未绑定NP680s NP680（MNCA）结合微泡。
- 确定的使用库尔特计数器的MNCAs浓度。
4。肿瘤模型
所有的动物实验与弗吉尼亚大学动物护理和使用委员会批准的动物协议的规定。
- C6 Giloma大鼠肿瘤细胞株是由贾森的UVA博士希恩（夏洛茨维尔，弗吉尼亚州）提供。
- 细胞系进行了测试，以确保细胞被支原体免费。
- 保持细胞株中的F - 12K的营养补充混合16％马血清，3％胎牛血清（FBS），和1％的笔链球菌（GIBCO，美国），在37 ° C和5％的CO 2 。
- 接种3 × 10 6 C6 Giloma肿瘤细胞在左后肢皮下注射300μL的PBS暂停C57BLJ6/Rag1小鼠（杰克逊）。让肿瘤为12天增长达到8 - 10MM，最大直径。
在体内超声应用5。
- 麻醉小鼠腹腔（IP）组合注射盐酸氯胺酮（60毫克/公斤体重）和甲苯噻嗪（0.1毫克/公斤体重）治疗前。
- 准备一个维护盐酸氯胺酮麻醉（20毫克/公斤体重）和甲苯噻嗪（0.3毫克/公斤体重）。管理作为需要。
- Cannulate每个动物的尾静脉注射，静脉注射（IV）的一个MB，MB / NP或MNCA解决方案管理。
- 肿瘤灌注测量
- 第四注入连续输液泵（2000年哈佛器械PHD;哈佛器械，Holliston，马）在15μl/min率脂质MB的解决方案（1 × 10 8 MBS / g体重0.3毫升0.9％生理盐水） 。
- ACUSON红杉512超声系统（西门子医疗解决方案，美国加州Mountain View）8月13 MHz的线性15L8探头配备使用在这项研究中，量化的对比增强肿瘤灌注。夫妻15L8探头肿瘤的水基超声凝胶（帕克实验室Aquasonic 100;帕克实验室公司，费尔菲尔德，新泽西州）。扫描肿瘤在B模式，以获得最佳的成像平面。
- 在对比脉冲序列（CPS）模式，获得一个连续的视频捕获微泡信号强度前5秒，20以下，高振幅的“突发”的13Hz的帧速率的脉冲。在四个平面成像重复的测量。
- 等待10分钟，注入白蛋白MBS和启动治疗的低频率的治疗，以使血脂MBS清除流通。
- 治疗性超声治疗
- 10分钟以下的肿瘤灌注测量（5.3）夫妇0.75英寸直径为1 MHz的重点不突出传感器（A314S;的Panametrics，沃尔瑟姆，马）以上的侧翼肿瘤的皮肤。四，注入白蛋白MB（1 × 10 5 MBS / g体重0.3毫升0.9％生理盐水），MB / NP（1 × 10 5 MBS /克和0.2微克粒子/克体重0.3毫升0.9％生理盐水）或MNCA解决方案（1 × 10 5 MNCAs /克体重0.3毫升0.9％生理盐水）。
- 药物输送治疗
- Insonate为60分钟的“1爆裂”脉冲序列在连续输注的粒子，MBS和NPS的合作注入，或MNCAs（5.4.1）（5.4.2.2）。
- “1爆”脉冲序列由连续100 1 MHz的正弦信号（占空比= 0.00002），1V峰到峰值振幅波形发生器（AFG - 310;泰克公司日前宣布，比弗顿，或）。放大55分贝（埃尼集团3100LA电子导航行业，理查森，TX）与功率放大器的RF波形信号。
- 烧蚀治疗
- 相同5.4.2.1，但是与“突发中等”或“5连拍 - 扩展”insonate脉冲序列
- “5突发中的”脉冲序列由5000 1 MHz的正弦波（占空比= 0.005）1V峰 - 峰幅度。 “5突发Exteneded”脉冲序列由10000 1 MHz的正弦波（占空比= 0.01）1V峰 - 峰幅度。
- 在插入一根针进入肿瘤的热电偶探头（欧米茄T型，HYP1-30-1/2-TG-60-SMPW-M）2厘米实验监测肿瘤温度的时间当然。记录温度测量，每五分钟。
- 重复肿瘤灌注测量5.3 10分钟以下治疗服务。
6。肿瘤灌注的定量
- 红杉上使用的CPS程序，输入ACQ模式。选择日E区包括完整的肿瘤体积的利益。灌注复苏曲线的形式会产生Y = A（1 - E -βt）+（Sadlowski 2002年，2001年色度;叶2004年）是适合的CPS数据。评估β，一个红血细胞的速度，前处理和后处理的相对措施。
- 出口CPS的文件进行离线分析。数据转换成AVI文件。打破AVI文件转换成图像序列帧一帧。使用康柏的Visual Fortan，或类似的软件包，生成时间平均从破坏性脉冲的所有帧图像为8秒以下的破坏性脉冲。
- 要确定肿瘤灌注区，使用ImageJ软件，应用门槛247 8叮咬的时间平均CPS的形象和量化增强像素内的肿瘤体积的百分之。相应的B型图像覆盖的时间平均阈值的图像，准确地确定肿瘤的面积。
- ％的平均灌注获得在给定时间点为特定肿瘤的最后的灌注区的面积至少四个郊野公园段剪辑。
- 以％灌流区（6.4）和β（0.1），以确定相对肿瘤血流的产品。
7。纳米粒子在肿瘤的生物分布
- 12天前与荧光标记的低alfasprot饮食（哈伦，印第安纳波利斯）核动力源小鼠治疗，以减少正常小鼠议员成像时造成的自体荧光。
- 剃须成像网站（侧翼肝）删除所有的头发。
- 删除与化学脱毛剂，如奈尔，残留的头发。
- 所有剩余的化学头发卸妆冲洗或可能发生的化学品燃烧。
- 如在5.4.2中所述的治疗，治疗后0，1，4，和24小时前（FMT系统VisEn医疗）的图像小鼠。
- 成像与盐酸氯胺酮（60毫克/公斤体重）和甲苯噻嗪（0.1毫克/公斤体重）的IP组合注射麻醉小鼠之前。将鼠标上的成像盒。收购白色的光反射和荧光模式图像。 VT680渠道开展荧光层析成像。
- 采用的裂变材料条约的软件来生成三维重建成像数据利用归一出生方程。重建后，选择利益卷（VOI），在所有3个成像平面（X，Y，Z）的绘图区域的利益率（ROI）。平均荧光值的总VOI体积和荧光浓度，由于荧光标记的BSA的纳米粒子，会产生VOI的无所不包的脚和肝脏。
8。肿瘤的生长速度
- 评估采取日常使用数字口径测量肿瘤体积。计算椭球近似的肿瘤体积V = 1 / 6πABC。其中A，B和C三个正交平面测量肿瘤的最大直径。
9。肿瘤的处理和分析
- 7天以下治疗安乐死动物。 Cannulate10毫升2％的左心室和抽血血液肝素化三氯化钙缓冲液（0.68毫米）灌注10ml三氯化钙中2缓冲液（0.68毫米），每10分钟在100毫米汞柱。
- 灌注修复组织10分钟灌注4％多聚甲醛的PBS（4℃），在100毫米汞柱。允许样品固定为60分钟。
- 海关的标本，嵌入石蜡，切成5微米的部分。
- 执行标准的苏木精伊红染色，以评价超声暴露的结果，可能发生的病理变化。
- 检测细胞凋亡，使用终端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记法（TUNEL）法（ApoptTag套件，InterGen公司有限公司，诺克罗斯，GA，美国）。
10。代表性的成果
1。纳米粒子的制备（2.0）
- 如果这个协议是正确的预制的粒子，将是球形的形状，通过扫描电子microcopy（SEM）确定，并有大约100nm的高斯分布，光散射技术决定。代表结果如图1所示。
2。靶向给药（5.4.1）
- 根据发表的研究报告在我们的实验室（宋2002年，查普尔2008），在图2中，超声破坏微泡造影剂在肿瘤组织血管纳米粒子增强交付结果未公布结果进行。我们还表明，我们的MNCA交付技术成果在提高纳米粒子交付紧随治疗。
3。肿瘤消融（5.4.3）
- 我们已经表明在相对较低的占空比，长时间超声微泡的破坏，（0.005-0.01），在机械消融结果肿瘤生长的肿瘤微血管和回归。如果这个协议是正确执行，不要指望在变化（I）肿瘤的生长率（图3）;（二）肿瘤的血流动力学变化（图4），（三）坏死区;及（iv）凋亡。
图1。PLAGA表征轴承牛血清白蛋白。 （一）正确装配纳米粒子的SEM图像。 （二）不当编造的纳米粒子的SEM图像。
（一）介导的荧光断层成像（FMT）的图像的超声治疗（顶部）和控制处理（下）皮下神经胶质瘤的治疗后，立即用一个MNCAs，纳米粒子（NPS）轴承680荧光信号叠加在图2。灰度平面激发光的形象。
图3。以下五爆裂延长脉冲协议的微泡insonation代表在肿瘤生长的倍数变化。
图4。B型（A，C）和超声造影（B，D）在小鼠皮下C6胶质瘤肿瘤的影像。在最初的预处理图像（一）多为低回声肿瘤的边界一直追溯到蓝色。 （二）预处理时间平均提高静脉注射造影剂后显示。治疗后，注射造影剂前，肿瘤又大多是低回声（四）。注射造影剂后，有明显减少，在肿瘤的增强。
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Discussion
关键步骤
小鼠尾静脉插管的：
静脉注射入小鼠尾静脉，可以是一个具有挑战性的的过程。然而，尾静脉导管，可以大大提高了一个成功注入的可能性。为了使导管，来回反复弯曲25号针头，直到它打破从枢纽。钝端插入体育20月底油管和密封胶与硅的连接。要准备的导管插管，将装有1％肝素生理盐水的凯瑟注射器和液体的死腔的导管注入。尾静脉麻醉鼠标在其一侧的位置，所以看法是。扩张用温水（105 ° - 110 ° F）的尾巴。针插入静脉。如果成功的血液，通常会进入导管。验证结算用少量生理盐水静脉针静脉。安全与磁带连接注射器，输液泵的导管到位。
纳米微粒再悬浮：
纳米粒子可能聚合下列冻干。 PBS中的悬浮颗粒，反复涡流和超声简要声波水浴（10秒）。这是至关重要的正确悬浮冻干样品。表征与显微镜的扫描电镜和光散射技术，冷冻干燥和再悬浮暂停。
可能的修改：
调整纳米颗粒的制造协议的条款，BSA作为一个替代药物，可用于多种治疗药物互换。根据治疗剂中的溶解度，纳米粒子可作为水包油型乳液或油 - 水在油乳剂制备。装载效率和PLAGA NPS，治疗剂的释放，也可能是很大的调整，如果需要的话。为了提高装载效率，增加聚合物载体，通过优化的NP制造参数WT / WT装载的药物。定制的治疗剂的释放速度，水解率而有所改变，通过分子量的变化和PLAGA乳酸/羟基的比例常数。 talioring装载效率和治疗剂的释放率和PLAGA粒子，所需的本地浓度可交付组织。在调整传递协议的条款，最重要的因素是超声波MNCA破坏的程度和微血管通透性。据报道，炮轰，白蛋白微泡的半衰期为1.3 ± 0.69分钟，平均（± SD）（Optison 2008年）。我们推测，连续输液剂和长时间的超声应用将增加微血管通透性的程度。通过增加治疗的时间，我们的目标是瞬时提高微血管的通透性。
非热机械消融协议，通过改变MB浓度或超声峰值压力可能会有所调整。据预计，增加MB的浓度和/或超声峰值压力会增加肿瘤血管损害程度。
应用范围：
我们正在开发技术，以降低经颅高强度聚焦超声（HIFU）声功率达到理想的治疗效果。
部分是由于通过头骨和高强度聚焦超声（HIFU）尚未取得广泛使用，作为一个脑癌治疗的选择与周围组织，肿瘤组织消融热的重要性的治疗相关的并发症。前三患者的临床列车的初步结论表明脑深部分烧蚀焦温度在颅加热结果（McDannold 2009年）的高强度聚焦超声治疗。高强度聚焦超声作为颅治疗脑肿瘤的临床治疗的成功，关键是本地化的声能传递到一个划定区域的能力。传递声波能量的能力是复杂的骨或空中接口，如头骨和以往的手术切除，产生相位和功率畸变的超声能量衰减是沿传播路径（Tanter 1998年）。这些异常往往有助于预焦点加热（McDonnald 2009年）和健康组织的空泡。
在过去的几年中，利用微气泡的声功率降低为有针对性的，可逆BBB破坏和肿瘤消融已经吸引了大量的研究兴趣（许尼宁2001年，Sheikov 2004年，McDannold 2006A，2006年b，Meairs 2005年）。 McDannold 等 （2006A）表明，血管内注射微泡在HIFU治疗时间在91％减少时间平均声功率阈值控制，其中无微泡人出席，产生病变，降低温度的升高呈现出的潜力相比，机械损伤。减少病变的形成反过来热阈值降低的热量堆积在脱靶组织或骨的可能性。此外，它已经表明，静脉注射微泡在超声处理结果在短暂的，局部的，BBB的开放与权力的程度低于病变的形成所需的约两个订单的时间。
这是这项工作的目标，制定超声微泡技术，既降低颅高强度聚焦超声声功率和控制程度的微血管通透性。这项工作在大脑中的两个具体的治疗应用靶向给药和非热消融。通透性增加和永久消融的相对水平是可以控制的，通过调节声波的功率水平，取决于是否重视改善药物输送，永久性的微血管消融，或结合药物输送和永久微血管消融。这种潜在的控制能力如何微血管回应创造了机会发展不同的排列，我们治疗的具体颅治疗应用策略。我们认为这种做法有可能大幅转变，如何处理脑瘤。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
由美国国立卫生研究院R01 HL74082，哈特韦尔基金会，聚焦超声手术基金会支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ApoptTag kit | Intergen Co. | S7110 | |
| un-capped 85:15 poly(lactic-co-glycolic acid) (PLAGA) | Lakeshore Biomaterials | Custom | |
| Vivo Tag 680 | VisEn Medical | 10120 | Used to Tag BSA |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | 363136 | |
| MicroTip Sonicator | Misonix | S-4000 | |
| Sequoia | Simons Medical | P.O.A | Equipped with CPS |
| FreeZone 2.5 | Labconco Corp. | 7670020 | Equipped with Nitrogen Trap |
| Methylene chloride (CH2Cl2) | Fisher Scientific | D37-500 | |
| FMT 250 | VisEn Medical | P.O.A | |
| F-12K Nutrient Mixture | GIBCO, by Life Technologies | 21127-022 | |
| polyethyleneglycol-40 stearate | Sigma-Aldrich | 9004-99-3 | |
| distearoyl phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipid, Inc | 770365 | |
| Multisizer Coulter Counter | Beckman Coulter Inc. | P.O.A | |
| Waveform Generator | Tektronix, Inc. | AFG-310 | |
| water-based ultrasound gel | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic 100 | |
| Infusion pump | Harvard Apparatus | Harvard Apparatus PHD 2000 | |
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide (EDC) | Pierce, Thermo Scientific | 25952-53-8 | |
| N-hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS) | Pierce, Thermo Scientific | 106627-54-7 | |
| Succinic anhydride | Sigma-Aldrich | 603902 | |
| Power Amplifier | Electronic Navigation Industries | ENI 3100LA | |
| Needle Thermocouple Probe | Omega Engineering, Inc. | HYP1-30-1/2-T-G-60-SMPW-M | |
| BioGel (P100, medium) | Bio-Rad | 150-4170 | |
| .75’’ diameter 1 MHz unfocused transducer | Panametrics | A314S |
References
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