Rat Assay Angiogenesis Mesentery

Summary

Adulto normal tecido vascularizado mamíferos que carece de angiogênese fisiológica e que não tenha sido exposto a uma intervenção cirúrgica é usado para estudar: (i) o início e desenvolvimento da angiogênese após a administração intraperitoneal de agentes de teste, e (ii) a modificação da angiogênese após a administração sistêmica de selecionados agentes de teste.

Abstract

O adulto de ratos mesentério ensaio angiogênese janela é biologicamente apropriada e é excepcionalmente adequado para o estudo de germinação angiogênese in vivo [ver artigos de revisão], que é a forma dominante de angiogênese em tumores humanos e não-tecidos tumorais, como discutido na revisão solicitada papers ^1,2. Angiogênese induzida nas partes membranosas mesentérica por injeção intraperitoneal (ip) de um fator pró-angiogênico pode ser modulada por via subcutânea (sc), intravenosa (iv) ou oral (po) o tratamento com agentes modificadores de escolha. Cada parte membranosa do mesentério é translúcido e emoldurado por tecido adiposo, dando-lhe uma aparência janela-like.

O ensaio tem as seguintes características vantajosas: (i) o tecido de teste é nativamente vascularizado, apesar da baixa densidade, e uma vez que é extremamente fina, a rede microvascular é praticamente bidimensional, que permite que toda a rede a ser avaliados microscopicamente in situ; ( ii) em ratos adultos o tecido teste carece de angiogênese fisiológica significativa, o que caracteriza a maioria dos adultos normais tecidos de mamíferos, o grau de vascularização nativa é, no entanto, correlacionada com a idade, como discutido no ^1; (iii) o nível insignificante de trauma angiogênese induzida garante alta sensibilidade; (iv) o ensaio reproduz a situação clínica, como as drogas angiogênese modulador de teste são administrados por via sistémica e as respostas observadas refletem o efeito líquido de todos os metabólica, celular e alterações moleculares induzidas pelo tratamento, (v) o ensaio permite avaliações de objetivo, quantitativo, variáveis ​​imparciais sobre extensão espacial microvascular, densidade e formação de padrões de rede, bem como de germinação capilar, permitindo assim robusta análises estatísticas da dose-efeito e molecular relações estrutura-actividade, e (vi ) o ensaio revela com alta sensibilidade aos efeitos tóxicos ou nocivos dos tratamentos em termos de diminuição da taxa de ganho de peso-fisiológicos, como ratos adultos crescer robustamente.

Mast-mediada por células angiogênese foi demonstrada pela primeira vez com este ensaio ^3,4. O modelo demonstra um alto nível de discriminação em relação dose-efeito e os efeitos medidos administrada sistemicamente quimicamente ou funcionalmente drogas intimamente relacionados e proteínas, incluindo: (i) de baixa dosagem, administrada metronomicamente quimioterápicos padrão que produzem diversos, drogas efeitos específicos (isto é, atividades angiogênese-supressiva, neutro ou angiogênese estimulante ^5), (ii) natural de ferro-insaturados lactoferrina humana, o que estimula VEGF-A-angiogênese mediada ^6, e natural de ferro-insaturados lactoferrina bovina, que inibe o VEGF-A- angiogênese mediada ^7, e (iii) as frações de baixo peso molecular, a heparina produzida por vários meios ^8,9. Além disso, o ensaio é altamente adequado para estudos dos efeitos combinados sobre a angiogênese de agentes que são administrados por via sistémica, de forma concomitante ou seqüencial.

A idéia de fazer este vídeo originou-se do falecido Dr. Judah Folkman, quando visitou nosso laboratório e testemunhou a metodologia que está sendo demonstrada.

Revisão papers (convidados) discutindo e avaliando o ensaio

Norrby, K. Em modelos in vivo da angiogênese. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).

Norrby, K. O teste de drogas com modelos de angiogênese. Especialista Opin. Drogas. Descoberta. 3, 533-549 (2008).

Protocol

1. Animais

1. Pequenos roedores, como ratos, ratos e cobaias, foram utilizados como modelos animais. Infelizmente, os ratos adultos (muitas linhagens de camundongos foram avaliados) tendem a falta ou ter apenas um número muito baixo de potencial de pais microvasos (a partir do qual a angiogênese pode originar) dentro de suas janelas mesentérica, que faz estudos com ratos não-confiáveis. Portanto, o ensaio foi desenvolvido principalmente para ratos.
2. Os ratos, que são aclimatadas a um ambiente padrão para pelo menos 7 dias após a entrega do criador, são geralmente alojados em pares em uma gaiola com um padrão de 12 horas de ciclo claro / escuro, com livre acesso à água e pelotas. Cada animal é marcado. Usamos principalmente ratos adultos jovens (normalmente 7-10 semanas de idade de várias cepas, mas geralmente do sexo masculino Sprague-Dawley; em ratos com idade inferior a 5-6 semanas de idade o número de microvasos nativos tendem a ser baixas) obtido a partir de criadores diversos. No período anterior ao experimento e durante todo o experimento, os animais são pesados ​​a cada segundo dia, e sempre no dia do sacrifício. Quando os animais são tratados concomitantemente ip (para indução de angiogênese, veja abaixo) e sc ou iv ou po, eles são pesados ​​a cada dia. Isto permite a criação de grupos experimentais e controle do peso corporal igual no início do experimento, e permite o monitoramento da influência do tratamento sobre o corpo-ganho de peso durante o curso do experimento. Desde ratos machos adultos crescer robustamente fisiologicamente (ganhando cerca de 40-60 g por semana, dependendo do tipo de tensão), ganho de peso retardo é um marcador substituto sensíveis de toxicidade sistêmica, bem-estar, anorexia, e falha prosperar.

Nós trabalhamos em uma instituição de cuidados de alto padrão animal e esforços consideráveis ​​são feitos para minimizar os níveis de estresse vivida pelos animais. As diretrizes atuais éticos são aqueles estabelecidos pela Workman P. et al. (Diretrizes para o bem-estar e uso de animais na pesquisa do câncer. Br. J. Cancer 102, 1555-1577, 2010). O Animal Comitê de Ética da Universidade de Gotemburgo aprovou esses estudos.

2. Pró-angiogênicos tratamento intraperitoneal

1. O candidato fator pró-angiogênico a ser testada é dissolvido e diluído no endotoxina livre de soro fisiológico utilizado para infusão de pacientes (mesmo em níveis extremamente baixos, endotoxina é pró-angiogênicos). Todas as soluções são compostas recentemente no dia da injeção, estéril, filtrada (Millipore 0,22 mM-filtração), marcada para pH neutro (7,1-7,3), e usado em temperatura ambiente.
   O agente de teste é injetado em concentrações baixas ou muito baixas. Por exemplo, rato rVEGF ₁₆₄ (564-RV/CF; R & D Systems Europe, Ltd., Oxon, Reino Unido), que é o VEGF-A isoforma predominante em ratos, é diluído a 96 pmole / ml em solução salina livre de endotoxina, congelados e descongelado e um volume de 5 ml é injetada ip em ratos. Usamos uma seringa de 5 ml com 0,8 mm-agulha (agulha verde, 21G) para a injeção ip. Este tratamento, administrado duas vezes por dia durante 4,5 dias, ie., De segunda-feira de manhã (Dia 0) a sexta-feira pela manhã (dia 4), ​​induz uma resposta robusta sprouting angiogênese no tecido de teste mesentérica, com pico em torno de dia 21.
   Administrando o ip solução garante que todo o volume é entregue para a cavidade peritoneal (e não para o intestino, bexiga ou qualquer outro órgão). A injeção rápida de 5 ml permite a confirmação tátil pelo operador que o jato de fluido passou através da parede abdominal para a cavidade abdominal.
   Seguinte, antes ou concomitantemente com o tratamento pró-angiogênico ip, qualquer agente de teste de escolha podem ser administrados por via sistémica.

3. Administrando sistêmico da angiogênese modulador agentes

1. Qualquer outra via que o ip route pode ser usado, pois o tratamento ip pode afetar a reação em curso angiogênica através da indução da inflamação ou, possivelmente, pela ativação de mastócitos no tecido de teste, que pode levar a uma resposta pró-angiogênico forte. Além de administração oral ou injeção única sc ou iv, muitas vezes usamos sc administração usando minipumps osmótica (um ou mais, com vários volumes e bombeamento vezes) para entregar a solução a uma taxa constante por até duas ou várias semanas.
2. Perfusão subcutânea contínua de agentes de teste
   Enchimento e implantação de minipumps osmótica
   Normalmente no dia 5, ou seja, um dia após o término do tratamento VEGF ip, minipumps osmótico (por exemplo, Modelo 2ML2, com taxa de bombeamento constante de 5,0 mL / h para 14-15 dias; Alzet Bombas osmótica, Mountain View, CA , EUA) são preenchidos em condições estéreis com o agente de teste ou o veículo apropriado. Após armazenamento em estéril 0,9% (w / v) NaCl durante a noite a 37 ° C, a bomba (s) são implantados cirurgicamente sc nas costas (no lado da colu espinhalmn na região da escápula) de ratos que foram anestesiados com gás isoflurano (Isoba vet; Schering-Plough Animal Health, Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, NJ, EUA), inicialmente em uma câmara a vácuo transparente e posteriormente, através de uma máscara (para minimizar o stress causado ao animal seguinte, a câmara é lavada com ar antes de ser reutilizado). A incisão na pele feita para implantação da bomba é suturado imediatamente pós-implantação usando fio de seda.
   Uma vez que os animais ganho de peso fisiologicamente durante o período experimental e os agentes de teste são administrados em uma taxa constante, a dose real selecionado para um teste de drogas por kg de peso corporal é maior do que a dose média no início do período de infusão e é menor do que a dose média ao final do período de infusão.
   Infusão contínua, como descrito aqui, pode ser visto como uma forma estendida de tratamento metronomic.

4. Acabar com o Experimento

1. Um animal de cada vez é colocado em uma câmara hermética transparente, que é lavada com gás CO _2, que rapidamente se mata o animal. A câmara é lavada com ar antes de ser usado novamente.

5. Amostras de tecido colheita

1. Como mostrado no DVD, a parede abdominal é aberto, eo mesentério do intestino pequeno é identificado, incluindo a parte mais distal, que atinge a válvula íleo-cecal (a junção do intestino delgado e do intestino grosso). Quatro (ou mais) dos mais distais "janelas" são numeradas e espalhado objetivo padrão Superfrost não tratada Plus-slides (DAKO Dinamarca A / S, Glostrup, Dinamarca). É importante evitar, se possível, contaminando as amostras com conteúdo de sangue, tripas ou outros fluidos corporais, como esses materiais podem ser manchadas não especificamente, embora isso não invalida a visualização posterior imuno-histoquímica de microvasos.
2. Cada amostra janela mesentérica com o segmento do intestino pequeno é anexado espalhou em um slide e secas à temperatura ambiente por 20 minutos. Então, o coto intestinal é cortado, enquanto os espécimes intactos mesentério membranosa são armazenadas a -20 ° C por períodos prolongados. Isso é mostrado no DVD.

Deve-se mencionar que a vasculatura de tecido e de patentes podem ser visualizadas antes da colheita com microscopia de luz transmitida intravital.

6. Protocolo para a coloração imuno-histoquímica de microvasos

1. Dia 0
   Os espécimes são permitidos para descongelar de -20 ° C à temperatura ambiente, secas em um armário a 60 ° C por 1 hr, e mantido à temperatura ambiente durante a noite.
2. 1 dia
   Colocar as lâminas na coloração titulares slide (em cada faixa segundo) em uma tina de coloração e lavar duas vezes com TBS (pH 7,8) por 10 minutos em temperatura ambiente. A solução é descartada e substituída pela próxima solução, e assim por diante para todas as etapas a seguir.
3. Tratamento com tripsina
   Encha a tina de coloração que vai abrigar o suporte de slides coloração com solução de tripsina (25 ° C por 20 minutos). Descartar a solução e incubar duas vezes com solução de sacarose 2,5% (temperatura ambiente por 10 minutos cada tempo). Descartar a solução e lavar um par de vezes em água destilada (temperatura ambiente por alguns minutos cada).
4. Bloqueio
   Encha a tina de coloração que vai abrigar o suporte de slides coloração com 0,5% H ₂ O ₂ em metanol (temperatura ambiente por 30 minutos). Descartar a solução e enxágüe com água destilada (temperatura ambiente por alguns minutos). Descartar a solução e lavar duas vezes com TBS (pH 7,4) (temperatura ambiente durante 8 minutos de cada vez).
5. Incubação
   Todas as incubações estão em câmara úmida à temperatura ambiente. Aproximadamente 150 mL de cada uma das soluções listadas abaixo são usados ​​por slide. Os slides são colocados em uma câmara úmida e as soluções são pipetadas para os espécimes (as partes não-membranosa não precisa ser coberto pelas soluções).
   Para cada um dos seguintes passos, cuidadosamente sacudir toda a solução antes que a solução subseqüente é adicionado.
   1. Incubação com Normal (bloqueio) de soro (cavalo) (ABC kit) 3 gotas de solução amarela / 10 ml de tampão de diluição por 20 minutos.
   2. Incubação com anticorpo primário ARU0181, que rotula de ratos células endoteliais vasculares. O anticorpo é diluída 1:600 ​​com tampão de diluição (Biosource) (100 l diluído 40 vezes [frozen] mais 900 mL de tampão de diluição) e incubação ocorre durante a noite a 4 ° C.
6. Dia 2
   Os slides são removidos da câmara úmida, o anticorpo primário é descartado, e os slides são colocados em um compartimento de slides, coloração, que está submersa na tina de coloração e lavadas duas vezes com TBS(PH 7,8) por 8 minutos.
   1. Incubação com anticorpo biotinilado (ABC kit)
      Os slides são colocados horizontalmente em câmara úmida e incubadas com 1 gota de solução de azul / 10 ml de tampão de diluição por 30 minutos. Descartar a solução e colocar as lâminas em porta-lâminas coloração submerso na tina de coloração e enxaguar duas vezes com TBS (pH 7,4) por 8 minutos.
   2. Incubação com o reagente ABC
      As lâminas são novamente colocados horizontalmente em câmara úmida e as soluções a seguir são pipetados sobre as partes membranosa das amostras: 2 gotas de solução de laranja mais 2 gotas de solução marrom / 10 ml TBS (pH 7,4) por 30 minutos. Misture com cuidado 30 minutos antes de usar! Descartar a solução e coloque os slides no suporte de slides na tina de coloração e enxaguar duas vezes com TBS (pH 7,4) por 8 minutos.
7. Coloração com DAB (0,05%)
   Esta etapa deve ser realizada em uma capela química ventilados!
   Coloque os slides e adicione o 3,3-diaminobenzidina (DAB; Sigma-Aldrich) solução usando uma pipeta: solução DAB 0,1% em TBS (pH 7,4) [frozen] é diluído 1:1 com uma mistura de 10 ml H ₂ O ₂ e 7,5 ml TBS (pH 7,4). Esta solução é estéril filtrada imediatamente antes da utilização (para eliminar quaisquer partículas que podem obscurecer a imagem microscópica). Mancha as amostras por 8 minutos. Descartar a solução e coloque os slides no suporte de slides coloração submerso na tina de coloração. Enxágüe em água corrente e depois em água destilada por alguns minutos.
8. Desidratação
   Os slides são mantidos no compartimento de slides coloração. Enxágüe por devoluções e recarga do jar coloração contendo água destilada / etanol: água destilada, álcool 70%, álcool 95%, álcool absoluto, com dois minutos em cada solução.

7. Imagem e Avaliação da Rede Microvascular em cada amostra Janela mesentérica após coloração imuno-histoquímica de células endoteliais vasculares

Como mostrado no filme, microvasos são microscopicamente visualizadas in situ no tecido intacto.

1. Primeiro, usamos um microscópio desenho com faixa de ampliação de 14-34 (Leica M Selvagem 3Z) para lápis em papel branco a área de janela inteira, bem como a área vascularizada inteiro (VA) por janela mesentérica. VA, como uma porcentagem de toda a área, é facilmente medida por planimetria computadorizada ou não informatizado (ou simplesmente cortando e ponderação a imagem de toda a janela, e as imagens de todas as suas partes vascularizado).
2. Usando outro microscópio desenho, perfis microvascular individuais, que são facilmente identificados, são desenhadas em tinta preta sobre papel branco em 80 de ampliação dentro de campos escolhidos aleatoriamente. Este é o ponto de partida para a avaliação computadorizada subseqüente morfométricas de comprimento microvascular (MVL), que é basicamente uma medida de densidade microvascular.
3. Opcionalmente, variáveis ​​relacionadas à formação de padrões microvascular, bem como aqueles para a avaliação do número de brotos microvascular e comprimento de brotos individuais microvascular (No. SP e Le. SP, respectivamente) pode ser determinada. -O contraste entre o ideal representado estruturas vaso preto e fundo branco facilita a análise detalhada das imagens, na maioria dos comerciais morfométricas programas computadorizados.
4. Na maioria dos casos, as principais variáveis ​​são VA e MVL, que quando multiplicados juntos geram o comprimento microvascular total (TMVL).

8. Análise estatística

Normalmente, usamos o padrão não-paramétrico Mann-Whitney U-teste para analisar unpaired (bicaudal) observações. Uma média de quatro janelas mesentérica por animal é usado como o ponto de dados independentes para cada variável da janela mesentérica. O critério de significância estatística é P ≤ 0,05.

Discussion

O ensaio foi introduzida em 1986 ³ e tem sido sucessivamente desenvolvidos e aperfeiçoados em nosso laboratório ^7,10-12. Como discutido em artigos de revisão (convidado) ^{1, 2,} o ensaio compara bem com outros mamíferos ensaio in vivo de angiogênese em consideração, nomeadamente, características importantes, como o tecido teste adultos é nativamente vascularizado e carece de angiogênese fisiológica; trauma mínimo, se houver, é infligida ao tecido; variáveis ​​quantitativas realmente são medidos, o que permite análise estatística de som em relação dose-resposta e atividade molecular estudos; angiogênese surgimento ocorre, que é predominante em tecidos normais e tumores, e dados de toxicidade são facilmente acumulada em ratos que crescer robustamente fisiologicamente na idade adulta. Características desfavoráveis ​​podem incluir o fato de que o ensaio é relativamente demorado, especialmente quando se avalia o número ea duração de segmentos individuais microvascular microvascular e brotos, que não permite observações real-time/serial, e que dificilmente é adequado para ratos uma vez que muitas janelas mesentérica em ratos falta microvasos pai potencial a partir do qual pode originar novos capilares.

Observações em tempo real, no entanto, habilitado por microscopia intravital onde as janelas exteriorizado, mas ainda intacta mesentérica estão espalhados ao longo de um estágio do microscópio enquanto o animal é anestesiado, como discutido na ^1.

Avanços significativos na pesquisa da angiogênese foram alcançados nas últimas décadas com modelos como o micropocket da córnea, membrana pinto corioalantóicas e ensaios plug-sc Matrigel, que são ferramentas úteis, mas, em última análise limitada. Futuras aplicações clínicas de terapias anti-angiogênicos e pró-angiogênico exigir o estabelecimento e validação de mais sensível e biologicamente relevantes, verdadeiramente quantitativa modelos pré-clínicos, como o descrito no relatório atual.

Materials

Buffers and reagents

0.5 M Tris-HCl (pH 7.8) stock solution Tris (hydroxymethyl) aminomethan (60.57 g) is dissolved in ~900 ml aqua dest and ~45 ml of 25% HCl (concentrated) is added to achieve pH 7.8 followed by dilution to 1 liter with aqua dest.

Tris-buffer saline (TBS; pH 7.8) To 200 ml of the stock solution is added 18 g NaCl dissolved in ~1800 ml aqua dest with adjustment of pH to 7.8 using the stock solution, followed by dilution to 2 liter with aqua dest.

TBS (pH 7.4) To 200 ml of the stock solution is added 18 g NaCl dissolved in dissolved in ~1800 ml aqua dest with adjustment of pH to 7.4 using the stock solution, followed by dilution to 2 liter with aqua dest.

Trypsin solution (0.05% trypsin, 0.1% CaCl2) Contains 0.1 g trypsin and 0.2 g CaCl2 in 200 ml TBS (pH 7.8).

Sucrose solution 2.5% Contains 5 g sucrose in 200 ml TBS (pH 7.8).

Stock solution of 1% Sodium azide in TBS (pH 7.4) Contains 1 g Na-azide in 100 ml with TBS (pH 7.4).

Diluting buffer: 0.1% BSA, 0.01% Na-azide (Used to dilute antibodies in the Vectastain ABC kit). Contains 0.1 g bovine serum albumin (BSA) and 1 ml of 1% Na-azide, diluted to 100 ml with TBS (pH 7.4).

ABC kit Vectastain PK 4002, ABC peroxidase mouse IgG Normal horse serum; blocking serum; yellow solution: 3 drops/10 ml dilution buffer. Biotinylated antibody; anti-mouse IgG; blue solution: 1 drop/10 ml dilution buffer. ABC-reagent: orange solution, 2 drops plus brown solution 2 drops/10 ml TBS (pH 7.4).

Mix these solutions 20 minutes before use!

Mouse (monoclonal) anti-rat endothelium(Biosource International, Camarillo, CA, U.S.A.)

This antibody is directed against all vascular endothelial cells in the rat, with the exception of those in the brain.

Vectastain peroxidase Avidin Biotin Complex (ABC) kit The kit contains primary antibody, biotinylated secondary antibody, avidin-biotinylated enzyme complex (ABC), and enzyme substrate. See www.vectorlabs.com or www.immunkemi.se for protocols.

Bovine serum albumin(BSA) (Sigma-Aldrich, catalog # A-4503). DAB= 3,3’-Diaminobenzidine Isopac (Sigma-Aldrich, catalog # D 9015). Trypsinfrom Bovine Pancreas (Sigma-Aldrich, catalog # T 4665). Vectastain peroxidase ABC-kit, Mouse IgG (Immunkemi F & D AB, Jarfalla, Sweden)