Summary
微观尺度细胞刺激实验，我们已经开发了一个自动细胞培养和审讯平台。该平台提供简单，功能多样，培育和刺激小的细胞群体，并恢复裂解分子分析和精确的控制。该平台非常适合使用珍贵的细胞和/或试剂的研究。
Abstract
培养的细胞在体外分析中研究复杂的生物系统提供了重要的洞察。常规方法和设备，用于在体外分析中非常适合研究毫升尺度的量（≥0.1毫升）中的大量的细胞（≥10 5）。不过，也有许多情况下，它是必要或适当的缩减培养规模，降低消耗细胞的利息和/或他们的文化，刺激，或加工所需的试剂。不幸的是，传统的方法不支持精确和可重复操作的微观尺度的文化，基于微流体的自动化系统目前过于复杂，专门用于日常使用的大多数实验室。为了解决这个问题，我们已经开发出一种简单和通用的技术平台，为自动化的文化，刺激和复苏在微观尺度量小的细胞群体（100 - 2,000细胞）（1 - 20微升）。该平台由一组纤维连接蛋白涂层的微毛细管（“细胞灌注腔”），内微观尺度的文化是建立，维护和刺激;数字微流体（DMF）设备配备“转移”微毛细管（“中央枢纽“），航线细胞和试剂并从灌注室;一个高精度的注射器泵，权力灌注室和中心位置之间的材料运输和一个电子接口，它提供控制材料运输，这是协调和自动化通过预先确定的脚本。作为一个例子，我们使用的平台，以便研究转录反应引起的免疫细胞与细菌的挑战时。使用的平台使我们能够减少细胞和试剂的消耗，尽量减少实验实验变异，再直接动手劳动。的优点在于它赋予，以及它的可访问性和多功能性，邻的乌尔平台，应使用在各种各样的实验室和应用程序，并在促进细胞和刺激可只在有限数量的分析证明是特别有用的。
Introduction
维持在文化研究的细胞体外分析的基本原则和复杂的生物系统和人类健康的分子机制提供了宝贵的洞察。文化，刺激和收集细胞进行分析，利用培养皿，酶标板，传统的方法是大量人口毫升规模培养体积的细胞（≥10）（≥0.1毫升）的研究设计。但是，也有许多实例中，只有有限数量的细胞（ 例如，原代细胞），或小的细胞群体是可取的（ 例如，在人口减少细胞到细胞的变异），或很难获得所需的试剂或昂贵（ 如纯化细胞分泌的因素）。这样的问题可以顺利解决文化尺寸的缩减，减少消费，这有利于增加所需试剂在体外分析1,2。不幸的是，传统的设备和方法不支持微观尺度的文化和基于微流体的自动化系统目前可用3-11过于复杂，专门用于日常使用的大多数实验室的精确和可重复的操作。
在这份报告中，我们描述了一个简单而灵活的技术平台，为自动化的文化，刺激和恢复小的细胞群体（100 - 2,000细胞）在微观尺度册（1 - 20微升）的组装和使用。采用模块化设计，该平台架构（ 图1）：一组纤维连接蛋白涂层的微毛细管（“细胞灌注腔”模块）作为该网站的建立，维护和刺激微观尺度的文化和数字微流体（DMF ）12,13设备配备“转移”微毛细管（“中央枢纽”模块）14,15航线细胞和试剂从灌注室。二甲基甲酰胺使用户单独处理多个液滴同时不改变的移动设备的硬件的情况下改变或重新排序的操纵（ 即重新配置检测体处理列车）。其巨大的灵活性是显而易见的，其最近出现的一项关键技术在广泛的应用，包括细胞培养16,17，酶化验18,19，20,21免疫测定，DNA分析，22,23，蛋白处理，24,25我们的中心枢纽和临床标本的处理。26,27利用DMF装置所固有的灵活性，进一步增强它通过添加微细的接口，它提供了契机，开展了专门的外设操作的一个子集（ 如细胞培养）模块，而不是在DMF中的移动设备本身。列车以这种方式处理的条块分割也简化了设计解放军TForm的架构（无需修建的DMF装置，可以进行所有的处理步骤），并促进其演变为新功能（简单地集成新的必要的外设模块）。是由电润湿力的DMF装置13,28内的电极所产生的顺序激活，运输到，从运输的中心轮毂内的细胞和试剂，于灌注室是由一个高精度的注射器产生的压力变化泵。所有这些流体运动控制，通过一个简单的电子接口，通过使用预先确定的脚本和自动化。
作为一个有代表性的例子中，我们演示了如何使用该平台的研究转录反应引起的免疫细胞细菌挑战时（ 图2）。这些实验平台上开展，使我们能够与小数量的细胞（〜1,000 元实验，TAL条件），减少实验的实验变异，节约试剂，并重新直接动手劳动。给定的优点，它赋予，以及它的可访问性和多功能性，该平台应该找到实验室和应用程序中使用各种各样的，并证明在促进细胞和刺激可只在有限数量的分析特别有用。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
这是一般的协议被设计为支持应用程序的平台，各种各样的研究，具体代表本报告中描述的研究方面分离出来，在括号中。 图2说明了具有代表性的研究，使用的协议进行。请注意，在协议中，所有的“指示”命令通过使用预先确定的脚本自动化。还要注意的是第2步就可以进行并行步骤1（ 例如，在步骤1.7和1.8），并往往是绕过该步骤2.1（因为的图案/涂层DMF装置板可水洗，并重新使用;见步骤5.2） 。
1。组装和填充细胞灌注室
- 大衣灭菌（高压灭菌的）微毛细管（熔融石英，外径679微米，534微米的id，长15厘米）与纤连蛋白，通过指示画出一个无菌的纤连蛋白溶液（30微升的50微克/毫升的注射器泵的内表面）到每个微细管，温育（37℃，2小时），指令注射泵以退出该溶液，并让微毛细管干燥（6小时，室温（RT））。
- 将每根纤维连接蛋白涂层的微毛细管（灌注室）聚碳酸酯管（外径为500μm，内径为100μm）和管的多端口的注射器泵，使用CapTite的配件（6灌注腔室，8端口注射器泵）。
- 使用胶带，固定每个灌注腔体设置为所期望的温度（37℃）的热块。
- 沉浸在水库中的灌注腔室的开口端（microcentifuge管或微量滴定板的孔）的含细胞（P388D.1小鼠巨噬细胞）悬浮于新鲜的生长培养基（RPMI-1640，10％胎牛血清，500单位/ ml青霉素，500微克/ ml链霉素）在所需的浓度（10 6细胞/ ml）。
- 指示注射泵以绘制细胞（10微升，10 4个细胞），其次是足够的爱到每个灌注室r键将液塞（约4.5厘米）固定到散热块上的一节。
- 使细胞附着到纤连蛋白涂覆的内表面的灌注室（37℃，1 - 2小时）。在此期间，从细胞储层灌注腔室的开口端传输到一个新的含有新鲜的生长培养基中的储层。
- 坚持期后，指示注射器泵送液体插头（空调媒体和未婚细胞），浪费，提取新鲜培养基（10微升），并按照在坚持与足够的空气来定位新的液体插头（新鲜中等）细胞。
- 继续开展中小型交流（ 即重复步骤1.7）定期（每2小时），直到细胞群体有足够的平衡和扩展（16 - 24小时的微观尺度的文化产生的种群〜1,000个细胞/室）。
2。制作的的DMF设备和组装集线器架构
- 使用金属压缩帧，固定到与保持板之间的间距为400μm的凹部的聚合物铸件14,30，此间距与致动电极的大小（2.5毫米2），结合在DMF中板，定义的液滴体积（2.5μl的每个电极）。需要注意的是DMF组件，可以通过简单的装置24。
- “插入”特氟龙涂层转移到DMF板之间的空间中的微毛细管（外径360微米，内径100μm; 3.5 - 4.0厘米长），定位每个公司同源的致动电极的边缘延伸。
- 到对面的连接D每个传输微毛细管加贴CapTite的的拟合。
- 接合电连接器与电源电压的ITO电极。电极激活序列是通过使用计算机控制的电子界面，运行预先确定的脚本自动化。
- 可选：将组装的DMF轮毂上配备了电荷耦合器件（CCD）摄像机（DCR-HC96（索尼，日本）），以便跟踪液滴的显微镜（SZ-6145TR（奥林巴斯，日本））的平移阶段31
3。将连接灌注钱伯斯DMF集线器和刺激细胞群体
- 删除从介质油藏灌注室（见步骤1.6）的开口端，并把它们插入（见步骤2.4）的二甲基甲酰胺集线器转移微毛细管的端部贴到CapTite配件。
- 指示注射器泵送液体插头（空调媒体），在灌注室浪费。
- 研究所构作的DMF集线器画刺激（ 大肠杆菌生物粒子在100微克/毫升的新鲜培养基中的Pluronic F127 0.1％w / v的）从一个板上水库和提供适当大小的液滴（10微升），每个转印微细。主板上的水库是由圆筒状的隔室（1.5×1.5厘米），并通过管道连接到DMF集线器。
- 指示绘制刺激转让微毛细管插入注射器泵，并按照与足够的空气灌注室的细胞群定位插头。
- 培养的细胞与刺激（37℃，1 - 4小时）。可选：新鲜的刺激（ 即重复步骤3.2-3.4）定期交流。
4。终止刺激并恢复细胞裂解液分析
- 可选：如果刺激后需要花多长时间，交换刺激含有液体插头新鲜培养基（ 即重复步骤3.2 - 34，以新鲜培养基刺激），并继续孵化和交流需要。
- 交易所的液体灌注室洗涤缓冲液（前奏曲直接的裂解模块缓冲区B）（ 即重复步骤3.2 - 3.4，以洗涤缓冲液的刺激），孵化（5分钟）插头。
- 交易所液体插头（洗涤缓冲液）裂解液（前奏直接裂解模块缓冲A与0.1％的Pluronic F127 W / V）（ 即重复步骤3.2 - 3.4，裂解液代替刺激），孵化（5分钟） 。
- 指导的注射器泵，送液体插头（细胞裂解液）的DMF集线器。
- 拆卸的DMF枢纽，删除的DMF装置的顶板（注意不要倾斜板横盘整理，因为这可能会导致液滴混合），并收集裂解的Pipetman使用或注射器为平台（基因表达谱分析通过定量PCR）。
5。清洁平台硬件重新使用
- 浸入转印微毛细管和CapTite的管件在10％的漂白剂（在水中的体积/体积）和10分钟，在RT，以及与去离子水和干燥的，用氮气冲洗。
- DMF中的移动设备板浸入10％的漂白剂在RT和10分钟，用异丙醇冲洗，然后用去离子水和干燥用氮气在160℃下烘烤10分钟。
- 的注射器泵的聚碳酸酯管，和DMF的移动设备的聚合物铸造和压缩帧，可以重新使用无清洗。微毛细管灌注室每次实验后丢弃。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
自动化平台作为示范，我们用它来 开展一项研究中，人口较少的免疫细胞生长在微观尺度的文化，挑战与细菌，裂解为平台促炎症反应的分析（ 图2 ）。
每6个细胞的灌注腔10 4免疫细胞（P388D.1小鼠巨噬细胞）的生长培养基中再悬浮于10μl接种。 〜500个细胞粘附期（37℃，2小时）和介质的交换后，仍然连接到每一个腔室（ 图3A）的内表面，通过分析，复制微米文化（细胞通过释放螯合剂处理和计数测量通过血球和光镜）。进一步在37℃下温育16小时，在2小时的时间间隔交换介质，扩大了的细胞群〜1,000个细胞每室（ 图3B）（如测得的第复制微尺度文化，如上所述）粗略分析。在四个六个灌注室，细胞群体的挑战与E.大肠杆菌的细菌（pHrodo生物粒子），悬浮在生长培养基，感染复数（MOI）为20（ 即每个单元有20个生物粒子，被质疑在人口平均）交付。在剩下的两个腔室，细胞群收到一个模拟的挑战（ 即生长培养基）。在37℃下温育1小时（两个挑战细菌的培养物）或4小时（两种细菌的挑战，以及两个模拟挑战，文化）后，洗涤和裂解细胞，回收的溶胞产物从DMF集线器。常规的实验室规模的方法，用于从裂解物来制备cDNA，并衡量炎症介质：趋化因子MIP-1β（CCL4）和RANTES（CCL5），诱导环加氧酶COX-2（PTGS2），细胞因子TNFα（肿瘤坏死因子的转录水平）。
图4总结了三个独立复制的实验结果。我们发现，免疫细胞的生长和挑战在微观尺度的文化（红柱）安装基本上是相同的细胞生长和挑战传统文化（蓝色条）所诱发的促炎症转录反应。此外，平台（微观尺度）的实验表明以下的变异性（如由更小的误差棒表示）和消耗较小数量的细胞和试剂（ 表1）。
图1。的照片自动微观尺度细胞刺激实验平台。
图2。代表平台启用实验：挑战与微观尺度的文化细菌的免疫细胞的转录谱的概述。
图3。在微尺度灌注商会培养的免疫细胞的照片。小鼠巨噬细胞（P388D.1细胞系）在10 6细胞/ ml的浓度再悬浮于生长培养基中，10微升（10 4个细胞）用于种子纤连蛋白涂微细（灌注室）。采取使用MVX10的显微镜（Olympus）搭载的CCD相机的QImaging明场照片。要衡量人口规模，被释放细胞复制微观尺度的文化灌注腔表面采用细胞汽提塔，采用台盼蓝染色，使用血球和光镜下计数。A. 。B.培养16小时后（在37℃孵化中小型交流，每2小时），人口已扩大至1,000个细胞。
图4。培养和刺激的免疫细胞的转录概况在常规与微尺度灌注分庭的船只。小鼠巨噬细胞（P388D.1细胞系），再悬浮于生长培养基中的浓度为10 6细胞/ ml。对于传统文化，用于种子的生长培养基中加入150μl的50微升（5×10 4个细胞），在96孔微量滴定板的一个孔中;使用微观尺度文化，10微升（10 4个细胞）的种子纤维连接蛋白涂层microcapil拉里（灌注室）。在37℃下温育16小时后，将细胞（〜5×10 4每个常规培养，10〜3％微规模培养） 与大肠的挑战大肠杆菌的细菌（pHrodo生物粒子）在感染复数（MOI）为20（即20生物粒子的每一个细胞在文化）;阴性对照组（模拟挑战）文化只接受新鲜培养基。进一步培养后，在37°下进行1小时或4小时，将细胞洗涤，并使用试剂的前奏直接裂解模块裂解。溶胞产物RNA的cDNA使用的Ovation PicoSL WTA，较大（≥200个核苷酸）使用Agencourt RNAClean XP纯化的cDNA产物，而这些产品作为模板的TaqMan定量PCR检测MIP-1β（CCL4）测量转录水平被放大并转换趋化因子RANTES（CCL5），COX-2（PTGS2），和肿瘤坏死因子α（肿瘤坏死因子），以及GAPDH cDNA的溶胞产物之间的水平正常化。每个qPCR分析，一式三份进行，结果取平均值。 EA通道实验独立重复三次。横道倍，平均增幅在传统文化中转录水平（蓝色）或微观尺度的文化（红色）挑战与细菌相比，阴性对照组（模拟挑战）文化;错误横道横跨三个实验的标准偏差。
| 需求 | 常规实验 | 微观尺度实验 |
| 细胞 | 3,000,000 | 60,000 |
| 生长培养基 | 2.4毫升 | 0.7毫升 |
| 生物粒子 | 200微克 | 4微克 |
| 洗车及裂解试剂 | 各加入300微升 | 各60微升 |
表1中。传统与微观尺度细胞刺激实验要求本报告中所述的代表性的实验（ 图2），6个常规（96孔微量滴定板中生长的小鼠巨噬细胞（P388D.1细胞系））与微观尺度（灌注室）培养来自编号第，挑战与E.大肠杆菌的细菌（pHrodo生物粒子）在MOI为20，和裂解的qPCR分析。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
我们已经开发了一个简单而灵活的自动化平台，为微大规模细胞培养和刺激实验。该平台使我们的工作与小培养体积和细胞群（1 - 20μl和100 - 2,000细胞， 每室），文化的尺寸可以进一步降低通过使用较小直径的微毛细管。工作在这些尺度的常规研究，并降低了成本，使需要使用珍贵的试剂和/或细胞的可行性研究。平台上执行的实验也显示较少的可变性，推测可能是由于细胞和体液处理自动化平台的精确度和可重复性。
当前配置的平台，吸引细胞和媒体使用off-board水库（离心管或微孔板）播种，平衡，扩大细胞群在灌注室。这是一个简单的方式来解决之间的不匹配生长培养基中的要求（ 例如上述的代表性的实验中消耗700微升）和DMF中的移动设备的能力，活动板水库（各24微升）。然而，这样的配置必须实验中的人工干预，两个水库（步骤1.6）之间进行切换和连接灌注室DMF枢纽（步骤3.1）。将来的配置可能包括大容量（ 如 1毫升）上板水库，这将使所有材料的路由通过DMF枢纽，从而消除实验中人工干预的需要。
我们的实验只需要短期（<24小时）细胞培养的平台上。我们已经证实，在该平台上的细胞的存活率是与在至少24小时（数据未示出）的常规培养。但是，我们尚未尝试更长的时间，以保持在该平台上的文化。蒸发是不是一个大问题，因为平台的灌注室和生长大中型水库部分封闭的系统，并覆盖细胞的液体插头很容易通过介质交换补充。另一方面，保持在长期培养中的pH值，这可能是必要的，以容纳生长培养基的储层中的5 - 10％的CO 2气氛中，或切换到生长培养基中，不包括CO 2 -碳酸氢盐pH缓冲剂。此外，长期培养的细胞分裂的活性将扩大人群会合点（ 即覆盖所有可用的灌注腔的内表面），这将需要传代细胞（释放，冲洗，稀释，并重新播种） 。其他已经完成了这个在微流体政权3,5,6,9,17，并在其当前配置的平台应该能够开展所需的所有操作。综上所述，我们预计，适度的修改（主要协议，而不是硬件）我们的平台应该是capable支持长期的哺乳动物细胞培养。这似乎是一个特别有前途的未来发展方向，因为传统的方法是费时和劳动密集型;增加一个长期的文化剧目的能力，我们的自动化平台，将进一步使用户能够重新指导他们的劳动，更富有成效。
虽然我们测试只有少数不同的细胞类型迄今（ 例如，小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞，小鼠骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）），该平台应能够容纳任意贴壁细胞类型。在某些情况下，可能会需要改变的灌注腔从纤连蛋白涂层的另一种细胞外基质成分（或组件的混合物），或改变它的生长培养基中，但容易作出这些修改。与非贴壁细胞类型可能是更具挑战性的工作，但细胞圈养策略已经成功地在类似情境32-34。笑民联也有可能建立包括多种类型的细胞的混合培养物，实际上，混合培养，建设高重现性，应确保了精度与该平台处理细胞和体液。
关于刺激，任意内的水性液体插件能够被运输的物质应该是兼容平台5,13,16,35。在大或致密颗粒，它可以随着时间的推移定居的情况下，它可能是必要的定期重悬水库内;在过去，我们已经解决了这个问题，通过使用高密度载液36或一个简单的搅拌系统（数据未示出），的解决方案应该是容易实现的，在我们的平台上。
迄今为止，我们的细胞，并在该平台上的刺激的表征主要集中标志亲炎症反应的定量RT-PCR分析。作为下一个步骤，综合分析的t他的细胞群的转录（通过DNA微阵列或代测序（SGS）（ 即 RNA测序37,38）），是指日可待的cDNA的制备步骤适度修改，我们的平台和协议应该是完全能够支持全球转录谱研究。同样地，在蛋白质水平上分析细胞种群的反应（通过ELISA，免疫沉淀，质谱法，或蛋白质微阵列）应该只需要修改的溶胞产物的制备步骤。该平台还支持基于成像分析细胞反应。细胞内灌注室（ 例如， 图3），可以成像，表面平面（而不是舍入）的微毛细管灌注室模块中的使用将有利于这种类型的分析。此外，细胞可以在DMF中的轮毂14,15上的成像，灌注室和/或从他们释放后播种前。释放的细胞也可能被成像该平台。到目前为止，我们已经使用光镜和荧光显微镜图像在所有这些阶段的细胞，以分析它们的形态，存活率，增殖率和物理相互作用的刺激（ 例如生物粒子）和对方（数据未示出）。显微镜也应使代谢物含量分析（评估通过使用荧光染料）（记者构造通过使用评估），转录活性和蛋白水平/本地化（记者结构，荧光蛋白融合结构，和/或免疫细胞化学评估通过使用）。可以用流式细胞仪分析以及释放细胞。许多这些分析可以进行完全在其平台上的当前配置，别人会要求关闭平台专门基于微流体模块（ 例如，见参考文献36,39-41）的分析或整合到平台通过连接到DMF枢纽。总而言之，它似乎吨帽子我们的平台将被证明是有价值的，实现多维分析细胞，否则只能通过使用非常复杂和昂贵的机器人系统，可以实现小种群。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争经济利益。
Acknowledgments
作者感谢罗纳德·F.壬子和Michael S. BARTSCH的为他们贡献的设计和开发的DMF设备和DMF枢纽。这项研究是完全由实验室的定向研究和发展方案在桑迪亚国家实验室的支持。桑迪亚国家实验室是一个多程序管理和经营的桑迪亚公司是洛克希德·马丁公司的全资附属公司，根据合同DE-AC04 94AL85000的美国能源部下属的国家核安全管理局的实验室。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Prelude Direct Lysis Module | NuGEN | 1400-24 | |
| Trypan Blue (0.4% w/v) | GIBCO | 15250-061 | |
| Cell Stripper | Cellgro | 25-056-C1 | |
| Ovation PicoSL WTA | NuGEN | 3310-048 | |
| Agencourt RNAClean XP | Beckman Coulter Genomics | A63987 | |
| pHrodo BioParticles | Invitrogen | P35361 | |
| CCL4 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443111_m1 | |
| CCL5 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm01302428_m1 | |
| PTGS2 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00478374_m1 | |
| TNF TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443258_m1 | |
| GAPDH TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm99999915_g1 | |
| Pluronic F127 | Sigma Chemical | 2594628 | |
| Fluorinert FC-40 | Sigma Chemical | 51142-49-5 | |
| Parylene C dimer | Specialty Coating Systems | 28804-46-8 | |
| Teflon-AF | DuPont | AF1600 | |
| Polyimide tape | ULINE | S-11928 | |
| Indium tin oxide (ITO) coated glass substrates | Delta Technologies | CB-40IN-1107 | |
| DMF hub Teflon-coated fused-silica microcapillaries | Polymicro Technologies | TSU100375 | |
| Perfusion chamber microcapillaries | Polymicro Technologies | TSP530700 | |
| Tubing and microcapillary fittings | Sandia National Laboratories | ||
| Polycarbonate tubing | Paradigm Optics | CTPC100-500-5 | |
| 8-port precision syringe pump equipped with 30 mm (500 μl capacity) syringes | Hamilton Company | 54848-01 | |
| Parylene-C vapor deposition instrument | Specialty Coating Systems | PDS 2010 Labcoter 2 | |
| High-voltage function generator | Trek | 615A-1 615-3 | |
| MVX10 microscope | Olympus | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) | |
| QIClick digital CCD camera | QImaging | QIClick-F-CLR-12 | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) |
References
- Young, E. W. K., Beebe, D. J. Fundamentals of microfluidic cell culture in controlled microenvironments. Chemical Society Reviews. 39, 1036-1048 (2010).
- Yeo, L. Y., Chang, H. C., Chan, P. P. Y., Friend, J. R.
- Zhang, B., Kim, M. C., Thorsen, T., Wang, Z. A self-contained microfluidic cell culture system. Biomedical Microdevices. 11, 1233-1237 (2009).
- Skafte-Pedersen, P., et al. A self-contained, programmable microfluidic cell culture system with real-time microscopy access. Biomedical Microdevices. 14, 385-399 (2012).
- Barbulovic-Nad, I., Au, S. H., Wheeler, A. R. A microfluidic platform for complete mammalian cell culture. Lab Chip. 10, 1536-1542 (2010).
- Zhou, Y., Pang, Y., Huang, Y. Openly Accessible Microfluidic Liquid Handlers for Automated High-Throughput Nanoliter Cell Culture. Analytical Chemistry. 84, 2576-2584 (2012).
- Wang, H. Y., Bao, N., Lu, C. A microfluidic cell array with individually addressable culture chambers. Biosensors and Bioelectronics. 24, 613-617 (2008).
- Cimetta, E., Cagnin, S., Volpatti, A., Lanfranchi, G., Elvassore, N. Dynamic culture of droplet-confined cell arrays. Biotechnology Progress. 26, 220-231 (2010).
- Hung, P. J., Lee, P. J., Sabounchi, P., Lin, R., Lee, L. P. Continuous perfusion microfluidic cell culture array for high-throughput cell-based assays. Biotechnology and Bioengineering. 89, 1-8 (2005).
- King, K. R., et al. A high-throughput microfluidic real-time gene expression living cell array. Lab on a Chip. 7, 77-85 (2007).
- Gómez-Sjöberg, R., Leyrat, A. A., Pirone, D. M., Chen, C. S., Quake, S. R. Versatile, fully automated, microfluidic cell culture system. Analytical Chemistry. 79, 8557-8563 (2007).
- Wheeler, A. R. Chemistry - Putting electrowetting to work. Science. 322, 539-540 (2008).
- Gong, J., Kim, C. J. All-electronic droplet generation on-chip with real-time feedback control for EWOD digital microfluidics. Lab Chip. 8, 898-906 (2008).
- Choi, K., et al. Integration of field effect transistor-based biosensors with a digital microfluidic device for a lab-on-a-chip application. Lab Chip. 12, 1533-1536 (2012).
- Barbulovic-Nad, I., Yang, H., Park, P. S., Wheeler, A. R. Digital microfluidics for cell-based assays. Lab Chip. 8, 519-526 (2008).
- Gentilucci, L., de Marco, R., Cerisoli, L. Chemical modifications designed to improve peptide stability: incorporation of non-natural amino acids, pseudo-peptide. 16, 3185-3203 (2010).
- Miller, E. M., Wheeler, A. R. A digital microfluidic approach to homogeneous enzyme assays. Anal. Chem. 80, 1614-1619 (2008).
- Jebrail, M. J., Bartsch, M. S., Patel, K. D. Digital microfluidics: a versatile tool for applications in chemistry, biology. 12, 2452-2463 (2012).
- Ng, A. H. C., Choi, K., Luoma, R. P., Robinson, J. M., Wheeler, A. R. Digital Microfluidic Magnetic Separation for Particle-Based Immunoassays. Analytical Chemistry. 84, 8805-8812 (2012).
- Sista, R. S., et al. Heterogeneous immunoassays using magnetic beads on a digital microfluidic platform. Lab Chip. 8, 2188-2196 (2008).
- Malic, L., Veres, T., Tabrizian, M. Biochip functionalization using electrowetting-on-dielectric digital microfluidics for surface plasmon resonance imaging detection of DNA hybridization. Biosens. Bioelectron. 24, 2218-2224 (2009).
- Malic, L., Veres, T., Tabrizian, M. Nanostructured digital microfluidics for enhanced surface plasmon resonance imaging. Biosens. Bioelectron. 26, 2053-2059 (2011).
- Jebrail, M. J., Wheeler, A. R. Digital microfluidic method for protein extraction by precipitation. Anal. Chem. 81, 330-335 (2009).
- Nelson, W. C., et al. Incubated protein reduction and digestion on an electrowetting-on-dielectric digital microfluidic chip for MALDI-MS. Anal. Chem. 82, 9932-9937 (2010).
- Mousa, N. A., et al. Droplet-scale estrogen assays in breast tissue, blood, and serum. Sci. Transl. Med. 1, 1ra2 (2009).
- Jebrail, M. J., et al. A digital microfluidic method for dried blood spot analysis. Lab Chip. 11, 3218-3224 (2011).
- Choi, K., Ng, A. H. C., Fobel, R., Wheeler, A. R.
- Jebrail, M. J., et al. Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing. J. Vis. Exp. (33), e1603 (2009).
- Thaitrong, N., et al. Quality Control of Next Generation Sequencing Library through an Integrative Digital Microfluidic Platform. , Submitted (2012).
- Shin, Y. J., Lee, J. B. Machine vision for digital microfluidics. Review of Scientific Instruments. 81, (2010).
- Thornton, M., Eward, K. L., Helmstetter, C. E. Production of minimally disturbed synchronous cultures of hematopoietic cells. BioTechniques. 32, 1098-1105 (2002).
- Huang, X., Dai, W., Darzynkiewicz, Z. Enforced adhesion of hematopoietic cells to culture dish induces endomitosis and polyploidy. Cell Cycle. 4, 801-805 (2005).
- Raje, M., et al. Charged nylon membrane substrate for convenient and versatile high resolution microscopic analysis of Escherichia coli & mammalian cells in suspension culture. Cytotechnology. 51, 111-117 (2006).
- Chatterjee, D., Hetayothin, B., Wheeler, A. R., King, D. J., Garrell, R. L. Droplet-based microfluidics with nonaqueous solvents and solutions. Lab Chip. 6, 199-206 (2006).
- Perroud, T. D., et al. Microfluidic-based cell sorting of Francisella tularensis infected macrophages using optical forces. Analytical Chemistry. 80, 6365-6372 (2008).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10, 57-63 (2009).
- Malone, J. H., Oliver, B. Microarrays, deep sequencing and the true measure of the transcriptome. BMC Biology. 9, (2011).
- Wu, M., et al. Microfluidically-unified cell culture, sample preparation, imaging and flow cytometry for measurement of cell signaling pathways with single cell resolution. Lab on a Chip. 12, 2823-2831 (2012).
- Srivastava, N., et al. Fully integrated microfluidic platform enabling automated phosphoprofiling of macrophage response. Analytical Chemistry. 81, 3261-3269 (2009).
- Herr, A. E., et al. Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 5268-5273 (2007).
