Summary
Vi har utviklet en automatisert cellekultur og avhør plattform for mikro-skala celle stimulering eksperimenter. Plattformen tilbyr enkel, allsidig og presis kontroll i pleie og stimulere små populasjoner av celler, og utvinne lysatene for molekylære analyser. Plattformen er godt egnet til studier som bruker edle celler og / eller reagenser.
Abstract
Studie av celler i kultur (in vitro-analyse) har gitt viktig innsikt i komplekse biologiske systemer. Konvensjonelle metoder og utstyr for in vitro-analyse er godt egnet for å studere av et stort antall celler (≥ 10 5) i milliliter skala volumer (≥ 0,1 ml). Det er imidlertid mange tilfeller hvor det er nødvendig eller ønskelig å skalere ned kultur størrelse for å redusere forbruket av cellene av interesse og / eller reagensene som er nødvendig for deres kultur, stimulering eller prosesseringssystem. Dessverre har konvensjonelle tilnærminger støtter ikke presis og reproduserbar manipulering av mikro-skala kulturer, og de MicroFluidics-baserte automatiserte systemer som er tilgjengelige er for komplekst og spesialisert for rutinemessig bruk av de fleste laboratorier. For å løse dette problemet, har vi utviklet en enkel og allsidig teknologiplattform for automatisert kultur, stimulering, og utvinning av små populasjoner av celler (100 - 2000 celler) i mikro-skala volums (1 - 20 ul). Plattformen består av et sett av fibronektin-belagt microcapillaries ("celle" perfusjon kamre), innen hvilken mikro-skala kulturer er etablert, opprettholdes, og stimuleres, en digital MicroFluidics (DMF)-enhet utstyrt med «overføring» microcapillaries ("sentralt nav "), hvilke ruter celler og reagenser til og fra kamrene, en perfusjon høy presisjon sprøytepumpe, som driver transport av produkter mellom de perfusjon kamre og den sentralt nav, og et elektronisk grensesnitt som gir kontroll over transport av materialer, som er koordineres og automatiseres via forhåndsbestemte skript. Som et eksempel har vi brukt plattformen for å lette studiet av transkripsjons-responser oppnås hos immunceller ved utfordring med bakterier. Bruk av plattformen det mulig for oss å redusere forbruket av celler og reagenser, minimere eksperiment-til-eksperimentet variasjon, og re-direkte hands-on arbeidskraft. Gitt de fordeler som den trygdede, samt dens tilgjengelighet og fleksibilitet, our plattformen skal finne anvendelse i en rekke laboratorier og anvendelsesområder, og vise seg særlig nyttig i å tilrettelegge analyse av celler og stimuli som er tilgjengelige bare i begrensede mengder.
Introduction
Studiet av cellene holdt i kultur (in vitro-analyse) har gitt uvurderlig innsikt i de grunnleggende prinsipper og molekylære mekanismer som styrer komplekse biologiske systemer og menneskers helse. Den konvensjonelle metoder for kultur, stimulering, og samling av celler for analyse, som utnytter petriskåler og mikrotiterplatene, ble utformet for studier av store populasjoner av celler (≥ 10 5) i milliliter skala kultur volumer (≥ 0,1 ml). Det er imidlertid mange tilfeller hvor bare begrensede mengder av celler er tilgjengelige (f.eks primære celler), eller små grupper av celler er ønskelig (for eksempel for å redusere celle-til-celle variasjon på tvers av populasjonen), eller de nødvendige reagenser er vanskelig å skaffe eller uoverkommelig dyrt (f.eks renset celle-utskilte faktorer). Slike problemer kan være vellykket behandlet ved å skalere ned kultur størrelse, som har den ekstra fordelen av å redusere forbruket av allereagenser som er nødvendig for in vitro-analyse 1,2. Dessverre konvensjonelt utstyr og metoder støtter ikke presis og reproduserbar manipulering av mikro-skala kulturer og MicroFluidics-baserte automatiserte systemer for tiden tilgjengelig 3-11 er for komplekst og spesialisert for rutinemessig bruk av de fleste laboratorier.
I denne rapporten beskriver vi montering og bruk av en enkel og allsidig teknologi plattform for automatisert kultur, stimulering, og gjenvinning av små populasjoner av celler (100 - 2000 celler) i mikro-skala volumer (1-20 ul). Plattformen arkitektur (figur 1) er modulær utforming: et sett med fibronektin-belagt microcapillaries ("celle perfusjon kamre" modul) fungerer som sted for etablering, vedlikehold og stimulering av mikro-skala kulturer, og en digital MicroFluidics (DMF ) 12,13 enhet utstyrt med "overføring" microcapillaries ("sentral hub" modul) 14,15 ruter cellerog reagenser til og fra perfusjon kamre. DMF kan brukeren individuelt rette flere dråper samtidig og til å endre eller endre rekkefølgen på manipulasjoner (dvs. rekonfigurere utvalgets behandling av tog) uten å endre enhetens maskinvare. Sin enorme fleksibilitet er tydelig i sin siste fremvekst som en viktig teknologi i et bredt spekter av applikasjoner, inkludert cellekultur 16,17, enzymanalyser 18,19, immunoanalyser 20,21, DNA-analyse 22,23, protein behandling, 24,25 og klinisk prøve-behandling. 26,27 Vår sentrale nav utnytter den iboende fleksibiliteten til DMF-enheter, og videre forbedrer den gjennom tilsetning av microcapillary grensesnitt, noe som gir mulighet til å gjennomføre en undergruppe av manipulasjoner (f.eks cellekultur) i spesialiserte perifer moduler, snarere enn på DMF enheten selv. Compartmentalization av behandlingen tog på denne måten forenkler også utformingen av plaTForm arkitektur (ikke nødvendig å bygge en DMF enhet som kan utføre alle prosesstrinn) og tilrettelegger sin utvikling som nye funksjoner som kreves (bare integrere nye perifere moduler etter behov). Transport av celler og reagenser innenfor det sentrale navet er drevet av electrowetting kreftene som genereres ved sekvensiell aktivering av elektrodene innenfor DMF-enheten 13,28, transport til, fra og innenfor de perfusjon kamre er drevet av trykkforandringer som genereres av en høy presisjon sprøyte pumpe. Alle disse flytende bevegelser styres via et enkelt elektronisk grensesnitt og automatisert gjennom bruk av forhåndsdefinerte skript.
Som et representativt eksempel demonstrerer vi bruk av plattformen for studiet av transkripsjons-fremkalte responser i immunceller ved utfordring med bakterier (figur 2). Gjennomføring av disse eksperimentene på plattformen mulig for oss å jobbe med et lite antall celler (~ 1000 per experimental tilstand), minimere eksperiment-til-eksperiment variasjon, bevare reagenser, og re-direkte hands-on arbeidskraft. Gitt de fordeler som det confers, samt dets tilgjengelighet og fleksibilitet, bør denne plattformen finner anvendelse i en rekke laboratorier og applikasjoner og vise seg særlig nyttig i å tilrettelegge analyse av celler og stimuli som er tilgjengelige bare i begrensede mengder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne generelle protokollen er utformet for å støtte anvendelse av plattformen til en lang rekke undersøkelser; aspekter som er spesifikke for den representative studien beskrevet i denne rapport er skilt ut i parentes Fig. 2 illustrerer en representativ studie utført ved å bruke protokollen.. Merk at i protokollen, er alle "instruere" kommandoer automatisert gjennom bruk av forhåndsdefinerte skript. Legg også merke til at trinn 2 kan utføres parallelt med trinn 1 (for eksempel i løpet av trinn 1.7 og 1.8), og at trinn 2.1 er ofte forbigås (fordi mønstret / belagt DMF enhet plater kan vaskes og brukes igjen, se trinn 5.2) .
En. Montere og fylle Cell perfusjon Chambers
- Belegge de indre overflater av sterilisert (autoklavert) microcapillaries (kondensert-silika; od 679 mikrometer, 534 mikrometer id, 15 cm lang) med fibronektin, ved å instruere sprøytepumpe for å trekke en steril fibronectin-oppløsning (30 ul av 50 ug / ml) inn i hvermicrocapillary, inkubering (37 ° C i 2 timer), instruerer sprøytepumpe for å trekke oppløsningen, og å la den microcapillaries tørr (romtemperatur (RT) i 6 t.).
- Koble hver fibronectin-belagt microcapillary (perfusjon kammer) til polykarbonat tubing (500 mikrometer od, 100 mikrometer id) og slangen til multi-port sprøyte pumpe, bruker CapTite beslag (6 perfusjon kamre, 8-port sprøyte pumpe).
- Ved hjelp av båndet, feste legemet til hver perfusjon kammeret til en varmeblokk satt til ønsket temperatur (37 ° C).
- Fordype de åpne endene av perfusjon kamre i et reservoar (microcentifuge tube eller mikrotiterplaten godt) inneholder celler (P388D.1 murine makrofager) suspendert i frisk vekst medium (RPMI-1640, 10% FBS, 500 enheter / ml penicillin, 500 mikrogram / ml streptomycin) ved ønsket konsentrasjon (10 6 celler / ml).
- Instruere sprøytepumpe å trekke celler (10 mL, 10 4 celler) i hver perfusjon kammer etterfulgt av nok air for å bevege den flytende pluggen (~ 4,5 cm) til den seksjon sikret til den varme blokken.
- La cellene til å følge de fibronektin-belagte indre overflater av perfusjon kamre (37 ° C i 1-2 timer). I mellomtiden, overfører de åpne endene av perfusjon kamre fra cellene reservoaret i et nytt reservoar inneholdende friskt vekstmedium.
- Etter tilslutning periode, instruere den sprøytepumpe for å sende de flytende pluggene (kondisjonert medium og ikke sammenføyde celler) til avfall, trekke tilbake friskt medium (10 ul), og følger med nok luft til å posisjonere de nye flytende plugger (friskt medium) over det adherte celler.
- Fortsette å utføre middels børser (dvs. gjenta trinn 1.7) med jevne mellomrom (hver 2 time) til celle populasjoner er tilstrekkelig likevekt og utvidet (16 - 24 timer av mikro-skala kultur genererte bestander av ~ 1000 celler / kammer).
2. Dikte DMF Device og Monter Hub Architecture
- Ved hjelp av metall-komprimering rammer, fikse DMF platene i en polymer støpt 14,30 med utsparinger som opprettholder en 400 pm avstand mellom platene, og dette mellomrom, kombinert med aktiveringsmekanismen elektrode størrelse (2,5 mm 2), definerer dråpe volum (2,5 mL per elektrode). Merk at DMF montering kan utføres ved enklere midler 24.
- Sett teflonbelagt overføring microcapillaries (360 mikrometer od, 100 mikrometer id, 3,5 til 4,0 cm lange) inn i rommet mellom platene DMF, posisjonering hver for å utvide til kanten av kognatreseptoren aktuering elektrode.
- Til motsatt nod av hver overføring microcapillary påføre en CapTite montering.
- Engasjere de elektriske kontaktene til å levere spenning til ITO elektroder. Elektrode aktivering sekvenser er automatisert gjennom bruk av en datastyrt elektronisk grensesnitt som kjører forhåndsbestemt skript.
- Valgfritt: Flytt den sammensatte DMF hub på translasjonsforskning fasen av et mikroskop (SZ-6145TR (Olympus, Japan)) utstyrt med en kostnad-brikken (CCD) kamera (DCR-HC96 (Sony, Japan)) for å lette sporing av dråper . 31.
3. Koble perfusjon Chambers til DMF Hub og stimulerer celle populasjoner
- Fjern de åpne endene av perfusjon kamre fra mellom reservoaret (se trinn 1.6) og setter dem inn i de CapTite beslag som er festet til endene av overføringen microcapillaries av DMF nav (se trinn 2.4).
- Instruere sprøytepumpe å sende flytende plugger (aircondition media) i perfusjon kamre å kaste bort.
- Instruct DMF navet for å trekke stimulus (E. coli BioParticles ved 100 ug / ml i friskt medium med 0,1% Pluronic F127 w / v) fra et om bord reservoar og leverer en dråpe med passende størrelse (10 pl) til hver overføring microcapillary . De om bord reservoarene består av sylindriske-formet rom (1,5 x 1,5 cm hver) og koblet til DMF Hub via slange.
- Instruere sprøytepumpe å trekke stimulus kobles til overføring microcapillaries, og følg med nok luft til å plassere pluggene over celle populasjoner i perfusjon kamre.
- Inkuber cellene med stimulus (37 ° C i 1-4 timer). Valgfritt: Exchange for fersk stimulus (dvs. gjenta trinn 03.02 til 03.04) med jevne mellomrom.
4. Avslutt Stimulering og Recover cellelysater for analyse
- Valgfritt: Hvis en post-stimulering periode er nødvendig, utveksle stimulus-inneholdende væske plugger for fersk medium (dvs. gjenta trinn 3,2 til 30,4, ved å erstatte friskt medium for stimulus), og fortsette å inkubere og utveksle etter behov.
- Utveksling væsken plugger i perfusjon kamre for vaskebufferen (Prelude Direkte Lysis Module Buffer B) (dvs. gjenta trinn 03.02 til 03.04, erstatte vask buffer for stimulans), og ruge etter behov (5 min).
- Utveksling væsken plugger (vaske buffer) for lysis løsning (Prelude direkte Lysis Module Buffer A med 0,1% Pluronic F127 w / v) (dvs. gjenta trinn 03.02 til 03.04, erstatte lysis løsning for stimulans), og ruge etter behov (5 min) .
- Instruere sprøytepumpe å sende flytende plugger (cellelysater) til DMF hub.
- Demonter DMF hub, fjerner topplaten av DMF-enhet (med forsiktighet for ikke å vippe plate sidelengs, da dette kan resultere i dråpe miksing), og samle lysatene ved hjelp av en Pipetman eller sprøyte for off-plattformen analyse (genuttrykk profilering via qPCR).
5. Ren Plattform Hardware forGjenbruke
- Fordyp overføringen microcapillaries og CapTite beslag i 10% blekemiddel (v / v i vann) i 10 minutter ved RT, skyll godt med avionisert vann, og ved hjelp av tørr nitrogengass.
- Fordyp DMF enheten plater i 10% blekemiddel i 10 min ved RT, skyll godt med isopropanol fulgt av avionisert vann og tørk ved hjelp av nitrogengass, etterfulgt av baking ved 160 ° C i 10 min.
- Sprøyten pumpens polykarbonat rør, og DMF enhetens polymer støpt og kompresjon ramme, kan gjenbrukes uten rensing. Perfusjon kammer microcapillaries forkastes etter hvert forsøk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som en demonstrasjon av automatiserte plattform, vi brukte den til å gjennomføre en studie der små populasjoner av immunceller ble dyrket i mikro-skala kulturer, utfordret med bakterier, og lysert for off-plattform analyse av pro-inflammatoriske responser (Figur 2 ).
Hver av seks celle perfusjon kamre ble sådd med 10 4 immunceller (P388D.1 murine makrofager) resuspendert i 10 mL av vekstmedium. Etter en tilslutning periode (37 ° C i 2 timer) og et medium utveksling, forble ~ 500-celler festet til de indre overflater av hvert kammer (figur 3A), som målt ved hjelp av analyse av replikate kulturer mikroskala (celler frigjøres via chelator behandling og telles via hemacytometer og lys-mikroskopi). Ytterligere inkubering ved 37 ° C i 16 timer, med medium utvekslinger ved 2 timers intervaller over, utvidet cellepopulasjoner til ~ 1000 celler per kammeret (figur 3B) (målt thgrov analyse av replikate mikroskala kulturer, som beskrevet ovenfor). I fire av de seks perfusjon kamre ble celle populasjoner utfordret med E. coli bakterier (pHrodo BioParticles), resuspendert i vekst medium, og levert på et mangfold av infeksjon (MOI) 20 (dvs hver celle i befolkningen ble utfordret med 20 BioParticles i gjennomsnitt). I de resterende to kamre, fikk celle populasjoner en mock utfordring (dvs. vekst medium only). Etter inkubering ved 37 ° C i 1 time (to bakterie-kulturer utfordret) eller 4 timer (to-utfordret bakterier, og to mock-utfordret, kulturer) ble cellene vasket og lysert, og lysatene utvinnes fra DMF navet. Konvensjonelle benk-skala metoder ble brukt til å forberede cDNA fra lysatene, og for å måle karakterutskrift nivåer for betennelser meklere: chemokines MIP-1β (CCl4) og RANTES (CCL5), induserbar cyklooksygenase COX-2 (PTGS2), og cytokin TNFcc (TNF ).
Figur 4 oppsummerer resultatene fra tre uavhengige replikert eksperimenter. Vi fant ut at immunceller vokst og utfordret i mikro-skala kulturer (røde søyler) montert pro-inflammatoriske transkripsjonelle responser som var hovedsak identiske med de fremkalte i celler dyrket og utfordret i konvensjonelle kulturer (blå søyler). Videre viste de på-plattform (mikro-skala) eksperimenter mindre variasjon (som indikert ved små feilfelt) og forbrukes mindre mengder av celler og reagenser (tabell 1).
Figur 1. Fotografi av Automated Plattform for Micro-Scale Cell Stimulering Experiments.
Figur 2. Oversikt over en representant Platform-Enabled Eksperiment: Transkripsjonell Profilering av immunceller Utfordret med Bakterier i Micro-Scale kulturer.
Figur 3. Fotografier av immunceller kultiveres i en mikroskala Perfusjon kammer. Murine makrofager (P388D.1 cellelinje) ble resuspendert i vekstmedium ved en konsentrasjon på 10 6 celler / ml, og 10 pl (10 fire celler) brukt til frø et fibronektin -belagt microcapillary (perfusjon kammer). Bright-feltet fotografier ble tatt ved hjelp av en MVX10 mikroskop (Olympus) er utstyrt med en CCD-kamera (Qimaging). For å måle befolkningens størrelse, ble celler fra replikere mikro-skala kulturer løslatt fra perfusjon kammer overflater ved hjelp Cell Stripper, farget med trypan blå, og regnet med en hemacytometer og lys mikroskop. A. B. Etter 16 timer av kulturen (inkubering ved 37 ° C med middels børser hver 2 time), hadde befolkningen vokst til ~ 1000 celler.
Figur 4. Transkripsjonelle Profiler av immunceller kultivert og stimulert i Konvensjonelle fartøy versus Micro-skala perfusjon Chambers. Murine makrofager (P388D.1 cellelinje) ble resuspendert i vekst medium i en konsentrasjon på 10 6 celler / ml. For konvensjonelle kulturer, ble 50 pl (5 x 10 4 celler) brukt til frø 150 ul vekstmedium i en brønn av en 96-brønn mikrotiterplate, for mikro-skala kulturer, 10 ul (10 fire celler) ble brukt til frø en fibronek-belagt microcapillary (perfusjon kammer). Etter inkubering ved 37 ° C i 16 timer, ble cellene (~ 5 x 10 4 pr konvensjonell kultur, ~ 10 3 per mikro-skala kultur) utfordret med E. coli bakterier (pHrodo BioParticles) på et mangfold av infeksjon (MOI) på 20 (det vil si 20 BioParticles for hver celle i kultur), negativ kontroll (mock-utfordret) kulturer fikk bare ferske media. Etter ytterligere inkubasjon ved 37 ° C i 1 eller 4 hr, ble cellene vasket og lysert under anvendelse av reagenser fra forspillet direkte Lysis modul. Lysate RNA ble forsterket og konvertert til cDNA ved hjelp av Ovation PicoSL WTA, de større (≥ 200 nt) cDNA produkter renset ved hjelp Agencourt RNAClean XP, og disse produktene brukes som mal i TaqMan qPCR analyser for å måle karakterutskrift nivåer for MIP-1β (CCl4), RANTES (CCL5), COX-2 (PTGS2), og TNF-alfa (TNF), samt GAPDH (for normalisering av cDNA-nivåer mellom lysater). Hver qPCR assay ble utført i triplikat, og resultatene midlet. EaCH eksperiment ble uavhengig replikert tre ganger. Linjene indikerer gjennomsnittlig fold økning i transkripsjon nivåer i konvensjonelle kulturer (blå) eller mikro-skala kulturer (rød) utfordret med bakterier, sammenlignet med negativ kontroll (mock-utfordret) kulturer; feilstolper indikerer standardavvik i de tre forsøkene.
| Krav | Konvensjonell Experiment | Micro-Scale Experiment |
| Celler | 3000000 | 60000 |
| Vekst Medium | 2,4 ml | 0,7 ml |
| BioParticles | 200 pg | 4 mikrogram |
| Vask & Lysis Reagenser | 300 ul hver | 60 ul hver |
Tabell 1. Krav til konvensjonell versus Micro-Scale Cell Stimulering Experiments.. Tall er hentet fra representanten forsøket beskrevet i denne rapporten (figur 2), hvor murine makrofager (P388D.1 cellelinje) ble dyrket i seks konvensjonelle (96-brønn mikrotiterplaten) versus mikro-skala (perfusjon kammer) kulturer , utfordret med E. coli bakterier (pHrodo BioParticles) på en MOI på 20, og lysert for qPCR analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har utviklet en enkel og allsidig automatisert plattform for mikro-skala cellekultur og stimulering eksperimenter. Plattformen gjør det mulig for oss å jobbe med små kultur volumer og celle populasjoner (1 - 20 mL og 100 - 2000 celler, per kammer); kultur størrelser kan bli ytterligere redusert gjennom bruk av microcapillaries av mindre diameter. Å jobbe i disse skalaene reduserer kostnadene ved rutinemessige undersøkelser og gjør gjennomførbare studier som krever bruk av edle reagenser og / eller celler. Plattform-utførte eksperimenter viser også mindre variasjon, antagelig på grunn av presisjon og reproduserbarhet med hvilke celler og væsker håndteres av automatiserte plattformen.
Gjeldende konfigurasjon av plattformen trekker celler og medier fra off-board reservoarer (mikrosentrifugerør eller mikrotiterplaten brønner) for seeding, likevekt, og utvidelse av celle populasjoner i perfusjon kamre. Dette er en enkel måte å løse misforholdet mellomdyrkningsmedium krav (f.eks 700 mL forbrukes i representativt eksperiment som er beskrevet ovenfor) og kapasiteten av DMF-enheten er ombord reservoarer (24 mL hver). Men nødvendiggjør denne konfigurasjonen mid-eksperiment manuell inngripen, for å bytte mellom de to reservoarene (trinn 1.6) og koble perfusjon kammer til DMF hub (trinn 3.1). Fremtidige konfigurasjoner kan omfatte stor kapasitet (f.eks 1 ml) om bord reservoarene, noe som ville gjøre det mulig ruting av alle materialer gjennom DMF hub, og dermed eliminere behovet for mid-eksperiment manuell inngripen.
Våre eksperimenter kreves bare kortvarig (<24 timer) kultur av celler på plattformen. Vi har bekreftet at cellelevedyktighet på plattformen er sammenlignbar med den for konvensjonelle kulturer i minst 24 timer (data ikke vist). Vi har imidlertid ikke til nå forsøkt å opprettholde kulturer på plattformen i lengre perioder av gangen. Fordampning er ikke et stort problem fordi plattformensperfusjon kamre og vekst mellomstore reservoarer er delvis lukkede systemer og flytende plugger som dekker cellene er lett etterfylles via medium utveksling. På den annen side, for å opprettholde pH i langsiktige kulturer kan det være nødvendig å huse vekstmediet reservoarene i en 5 - 10% CO2 atmosfære eller svitsj i et vekstmedium som ikke inneholder en CO 2-bikarbonat-buffer pH baserte . I tillegg vil langsiktig kultur for aktivt dele celler utvide bestander til det punktet av confluency (dvs. dekning av alle tilgjengelige overflater i perfusjon kammer), som vil nødvendiggjøre passaging av cellene (release, vaske, fortynne, og re-seedet) . Andre har oppnådd dette i microfluidic regimer 3,5,6,9,17 og i sin nåværende konfigurasjon plattformen skal kunne utføre alle de nødvendige manipulasjoner. I sammendraget, forventer vi at med beskjedne endringer (i hovedsak protokoller, snarere enn hardware) vår plattform bør være capable å støtte langsiktig pattedyr cellekultur. Dette vil virke spesielt lovende fremtid retning fordi konvensjonelle metoder er tidkrevende og arbeidskrevende, legge en langsiktig kultur evne til repertoar av vår automatiserte plattform vil ytterligere gjør sine brukere til å omdirigere sin arbeidskraft mer produktivt.
Selv om vi har testet bare noen få forskjellige celletyper hittil (f.eks murine makrofag cellelinje RAW264.7; murine benmarg avledet makrofager (BMDM)), skal plattformen kunne romme nesten alle tilhenger celletype. I noen tilfeller kan det være nødvendig å endre perfusjon kammeret belegget fra fibronektin til en annen ekstracellulære matriks-komponenten (eller blanding av komponenter), eller for å endre vekstmediet, men disse modifikasjoner lette å utføre. Arbeid med ikke-heftende celletyper kan være mer utfordrende, men celle tethering strategier har vært vellykket i lignende sammenhenger 32-34. Det should også være mulig å lage blandede kulturer som består av flere celletyper, ja, bør den presisjon med hvilken plattformen håndterer celler og væsker sikrer at konstruksjonen av blandede kulturer er reproduserbar.
Med hensyn til stimuli, bør praktisk talt en hvilken som helst substans som kan transporteres i en vandig væske plugg være kompatibel med vår plattform 5,13,16,35. I tilfelle av store eller tette partikler som kan utfelles over tid, kan det være nødvendig å periodisk resuspendere dem i reservoaret, da de tidligere, har vi løst dette problemet ved bruk av høy-tetthet bærerfluid 36 eller en enkel agitering system (data ikke vist), løsninger som bør være lett å implementere på vår plattform.
Hittil har vår karakterisering av celler dyrket og stimulert på plattformen først og fremst fokusert på QRT-PCR analyse av kjennetegn pro-inflammatoriske responser. Som et neste trinn, omfattende analyse av tHan celle befolkningens transcriptome (via DNA-mikromatriser eller generasjons sekvensering (SGS) (dvs. RNA-Seq 37,38)), er godt innenfor rekkevidde, med beskjeden endring av cDNA forberedelse trinnet, bør vår plattform og protokoller være fullt i stand til å støtte globale transcriptional profilering studier. Likeledes bør analyse av cellepopulasjoner respons på proteinnivå (via ELISA, immunoutfelling, massespektrometri, eller protein mikromatriser) krever bare modifikasjon av lysatet forberedelse trinn. Plattformen støtter også bildebehandling-basert analyse av celle responser. Celler kan avbildes innenfor kammeret perfusjon (for eksempel figur 3); bruk av Flate (i stedet for avrundede) microcapillaries for perfusjon kammeret modulen ville lette denne type analyse. I tillegg kan cellene bli avbildet på navet DMF 14,15, før såing av perfusjon kamre og / eller etter frigjøring fra dem. Utgitt celler også kan avbildes av avplattformen. Så langt har vi brukt lys og fluorescens mikroskopi til bildet celler på alle disse stadiene for å analysere deres morfologi, levedyktighet, proliferasjonsrate, og fysisk interaksjon med stimuli (f.eks BioParticles) og hverandre (data ikke vist). Mikroskopi også skal muliggjøre analyse av metabolitt innhold (vurdert ved bruk av fluorescerende fargestoffer), transkripsjonelle aktivitet (vurdert gjennom bruken av rapportørgrupper konstrukter), og proteinnivåer / Lokalisering (vurdert gjennom bruken av rapportørgrupper konstruksjoner, fluorescerende protein fusjonsproteiner konstruksjoner, og / eller immunocytokjemi ). Utgitt celler kan bli analysert ved hjelp av strømningscytometri også. Mange av disse analysene kunne gjennomføres helt på plattformen i sin nåværende konfigurasjon, andre vil kreve off-plattform analyse eller integrering av spesialiserte MicroFluidics-baserte moduler (f.eks se referanser 36,39-41) inn i plattformen via tilkobling til DMF hub. Tatt sammen, virker det sannsynlig thatten vår plattformen vil være verdifull i muliggjør multi-dimensjonal analyse av små populasjoner av celler, noe som ellers kan oppnås bare ved bruk av meget komplekse og dyre robot-systemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne takker Ronald F. Renzi og Michael S. Bartsch for sine bidrag til design og utvikling av DMF enheter og DMF hub. Denne forskningen var fullt støttet av Laboratory Regi Forskning og utvikling-programmet ved Sandia National Laboratories. Sandia er en multi-program laboratorium administreres og drives av Sandia Corporation, et heleid datterselskap av Lockheed Martin Corporation, for det amerikanske Department of Energy National Nuclear Security Administration under kontrakt DE-AC04-94AL85000.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Prelude Direct Lysis Module | NuGEN | 1400-24 | |
| Trypan Blue (0.4% w/v) | GIBCO | 15250-061 | |
| Cell Stripper | Cellgro | 25-056-C1 | |
| Ovation PicoSL WTA | NuGEN | 3310-048 | |
| Agencourt RNAClean XP | Beckman Coulter Genomics | A63987 | |
| pHrodo BioParticles | Invitrogen | P35361 | |
| CCL4 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443111_m1 | |
| CCL5 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm01302428_m1 | |
| PTGS2 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00478374_m1 | |
| TNF TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443258_m1 | |
| GAPDH TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm99999915_g1 | |
| Pluronic F127 | Sigma Chemical | 2594628 | |
| Fluorinert FC-40 | Sigma Chemical | 51142-49-5 | |
| Parylene C dimer | Specialty Coating Systems | 28804-46-8 | |
| Teflon-AF | DuPont | AF1600 | |
| Polyimide tape | ULINE | S-11928 | |
| Indium tin oxide (ITO) coated glass substrates | Delta Technologies | CB-40IN-1107 | |
| DMF hub Teflon-coated fused-silica microcapillaries | Polymicro Technologies | TSU100375 | |
| Perfusion chamber microcapillaries | Polymicro Technologies | TSP530700 | |
| Tubing and microcapillary fittings | Sandia National Laboratories | ||
| Polycarbonate tubing | Paradigm Optics | CTPC100-500-5 | |
| 8-port precision syringe pump equipped with 30 mm (500 μl capacity) syringes | Hamilton Company | 54848-01 | |
| Parylene-C vapor deposition instrument | Specialty Coating Systems | PDS 2010 Labcoter 2 | |
| High-voltage function generator | Trek | 615A-1 615-3 | |
| MVX10 microscope | Olympus | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) | |
| QIClick digital CCD camera | QImaging | QIClick-F-CLR-12 | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) |
References
- Young, E. W. K., Beebe, D. J. Fundamentals of microfluidic cell culture in controlled microenvironments. Chemical Society Reviews. 39, 1036-1048 (2010).
- Yeo, L. Y., Chang, H. C., Chan, P. P. Y., Friend, J. R.
- Zhang, B., Kim, M. C., Thorsen, T., Wang, Z. A self-contained microfluidic cell culture system. Biomedical Microdevices. 11, 1233-1237 (2009).
- Skafte-Pedersen, P., et al. A self-contained, programmable microfluidic cell culture system with real-time microscopy access. Biomedical Microdevices. 14, 385-399 (2012).
- Barbulovic-Nad, I., Au, S. H., Wheeler, A. R. A microfluidic platform for complete mammalian cell culture. Lab Chip. 10, 1536-1542 (2010).
- Zhou, Y., Pang, Y., Huang, Y. Openly Accessible Microfluidic Liquid Handlers for Automated High-Throughput Nanoliter Cell Culture. Analytical Chemistry. 84, 2576-2584 (2012).
- Wang, H. Y., Bao, N., Lu, C. A microfluidic cell array with individually addressable culture chambers. Biosensors and Bioelectronics. 24, 613-617 (2008).
- Cimetta, E., Cagnin, S., Volpatti, A., Lanfranchi, G., Elvassore, N. Dynamic culture of droplet-confined cell arrays. Biotechnology Progress. 26, 220-231 (2010).
- Hung, P. J., Lee, P. J., Sabounchi, P., Lin, R., Lee, L. P. Continuous perfusion microfluidic cell culture array for high-throughput cell-based assays. Biotechnology and Bioengineering. 89, 1-8 (2005).
- King, K. R., et al. A high-throughput microfluidic real-time gene expression living cell array. Lab on a Chip. 7, 77-85 (2007).
- Gómez-Sjöberg, R., Leyrat, A. A., Pirone, D. M., Chen, C. S., Quake, S. R. Versatile, fully automated, microfluidic cell culture system. Analytical Chemistry. 79, 8557-8563 (2007).
- Wheeler, A. R. Chemistry - Putting electrowetting to work. Science. 322, 539-540 (2008).
- Gong, J., Kim, C. J. All-electronic droplet generation on-chip with real-time feedback control for EWOD digital microfluidics. Lab Chip. 8, 898-906 (2008).
- Choi, K., et al. Integration of field effect transistor-based biosensors with a digital microfluidic device for a lab-on-a-chip application. Lab Chip. 12, 1533-1536 (2012).
- Barbulovic-Nad, I., Yang, H., Park, P. S., Wheeler, A. R. Digital microfluidics for cell-based assays. Lab Chip. 8, 519-526 (2008).
- Gentilucci, L., de Marco, R., Cerisoli, L. Chemical modifications designed to improve peptide stability: incorporation of non-natural amino acids, pseudo-peptide. 16, 3185-3203 (2010).
- Miller, E. M., Wheeler, A. R. A digital microfluidic approach to homogeneous enzyme assays. Anal. Chem. 80, 1614-1619 (2008).
- Jebrail, M. J., Bartsch, M. S., Patel, K. D. Digital microfluidics: a versatile tool for applications in chemistry, biology. 12, 2452-2463 (2012).
- Ng, A. H. C., Choi, K., Luoma, R. P., Robinson, J. M., Wheeler, A. R. Digital Microfluidic Magnetic Separation for Particle-Based Immunoassays. Analytical Chemistry. 84, 8805-8812 (2012).
- Sista, R. S., et al. Heterogeneous immunoassays using magnetic beads on a digital microfluidic platform. Lab Chip. 8, 2188-2196 (2008).
- Malic, L., Veres, T., Tabrizian, M. Biochip functionalization using electrowetting-on-dielectric digital microfluidics for surface plasmon resonance imaging detection of DNA hybridization. Biosens. Bioelectron. 24, 2218-2224 (2009).
- Malic, L., Veres, T., Tabrizian, M. Nanostructured digital microfluidics for enhanced surface plasmon resonance imaging. Biosens. Bioelectron. 26, 2053-2059 (2011).
- Jebrail, M. J., Wheeler, A. R. Digital microfluidic method for protein extraction by precipitation. Anal. Chem. 81, 330-335 (2009).
- Nelson, W. C., et al. Incubated protein reduction and digestion on an electrowetting-on-dielectric digital microfluidic chip for MALDI-MS. Anal. Chem. 82, 9932-9937 (2010).
- Mousa, N. A., et al. Droplet-scale estrogen assays in breast tissue, blood, and serum. Sci. Transl. Med. 1, 1ra2 (2009).
- Jebrail, M. J., et al. A digital microfluidic method for dried blood spot analysis. Lab Chip. 11, 3218-3224 (2011).
- Choi, K., Ng, A. H. C., Fobel, R., Wheeler, A. R.
- Jebrail, M. J., et al. Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing. J. Vis. Exp. (33), e1603 (2009).
- Thaitrong, N., et al. Quality Control of Next Generation Sequencing Library through an Integrative Digital Microfluidic Platform. , Submitted (2012).
- Shin, Y. J., Lee, J. B. Machine vision for digital microfluidics. Review of Scientific Instruments. 81, (2010).
- Thornton, M., Eward, K. L., Helmstetter, C. E. Production of minimally disturbed synchronous cultures of hematopoietic cells. BioTechniques. 32, 1098-1105 (2002).
- Huang, X., Dai, W., Darzynkiewicz, Z. Enforced adhesion of hematopoietic cells to culture dish induces endomitosis and polyploidy. Cell Cycle. 4, 801-805 (2005).
- Raje, M., et al. Charged nylon membrane substrate for convenient and versatile high resolution microscopic analysis of Escherichia coli & mammalian cells in suspension culture. Cytotechnology. 51, 111-117 (2006).
- Chatterjee, D., Hetayothin, B., Wheeler, A. R., King, D. J., Garrell, R. L. Droplet-based microfluidics with nonaqueous solvents and solutions. Lab Chip. 6, 199-206 (2006).
- Perroud, T. D., et al. Microfluidic-based cell sorting of Francisella tularensis infected macrophages using optical forces. Analytical Chemistry. 80, 6365-6372 (2008).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10, 57-63 (2009).
- Malone, J. H., Oliver, B. Microarrays, deep sequencing and the true measure of the transcriptome. BMC Biology. 9, (2011).
- Wu, M., et al. Microfluidically-unified cell culture, sample preparation, imaging and flow cytometry for measurement of cell signaling pathways with single cell resolution. Lab on a Chip. 12, 2823-2831 (2012).
- Srivastava, N., et al. Fully integrated microfluidic platform enabling automated phosphoprofiling of macrophage response. Analytical Chemistry. 81, 3261-3269 (2009).
- Herr, A. E., et al. Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 5268-5273 (2007).
