Summary
我々は、マイクロスケール細胞刺激実験のために自動細胞培養と尋問プラットフォームを開発した。プラットフォームは、栽培と細胞の小集団を刺激し、分子解析のための溶解物の回収で、シンプルで汎用性の高い、かつ正確なコントロールを提供しています。プラットフォームはよく貴重な細胞および/または試薬を使用した研究に適しています。
Abstract
培養中の細胞（in vitroでの解析で ）の研究では、複雑な生物学的システムに重要な洞察を提供してきました。 in vitroでの解析でするための従来の方法と装置はよくミリリットル規模な量の細胞（≥10 5）（≥0.1ミリリットル）の多数の研究に適しています。しかしながら、関心および/またはその培養物、刺激、または処理に必要な試薬の細胞の消費を減らすために、培養規模を縮小することが必要または望ましいである多くの例がある。残念なことに、従来のアプローチでは、マイクロスケールの文化を正確かつ再現性のある操作をサポートしていないと、現在利用可能なマイクロ流体ベースの自動化されたシステムは、あまりにも複雑で、ほとんどの研究室で日常的使用のために特化されます。マイクロスケール体積 - この問題に対処するために、我々は自動化された培養物、刺激し、細胞の小集団（2,000セル100）の回収のためのシンプルかつ汎用性の高い技術プラットフォームを開発したS（1 - 20μL）。 "転送"マイクロキャピラリー（ "中央ハブを装備し、デジタルマイクロフルイディクス（DMF）デバイス、プラットフォームは、マイクロスケール培養物を、確立され維持され、刺激され、その中フィブロネクチンでコーティングされたマイクロキャピラリー（"細胞灌流チャンバー "）、のセットで構成され"）、および灌流チャンバーからのルート細胞および試薬れ、パワー灌流室と中央ハブの間の材料の輸送高精度シリンジポンプ、れると、材料の輸送を制御でき電子インターフェース、ある調整し、予め決められたスクリプトを介して自動化。例として、細菌によるチャレンジに基づい免疫細胞において誘発転写応答の研究を容易にするために、プラットフォームを使用した。プラットフォームを使用することにより、私たちは、細胞や試薬の消費量を減らす実験ツー実験の変動を最小限にするために有効で、再直接ハンズオン労働。それが与えることの利点だけでなく、そのアクセシビリティと汎用性、Oを考えるウルプラットフォームは、研究室やさまざまなアプリケーションでの使用を見出す、とだけ数量限定で提供された細胞と刺激の分析を容易にする、特に有用であることが分かるはずです。
Introduction
（in vitroでの解析では）文化の中で維持された細胞の研究では、複雑な生物学的システムと人間の健康を支配する基本的な原理と分子メカニズムに貴重な洞察を提供してきました。ペトリ皿とマイクロタイタープレートを利用して分析するための文化、刺激し、細胞の収集のための従来の方法は、ミリリットル規模な文化量の細胞（≥10 5）（≥0.1ミリリットル）の大規模な集団の研究のために設計されていた。しかし、細胞の限られた量が使用可能な多くのインスタンスが（ 例えば、初代細胞）、または細胞の小集団（ 例えば 、集団全体のセル間のばらつきを低減する）ことが望ましい、または必要な試薬を得ることが困難であるまたは高価（ 例えば精製細胞分泌因子）。このような問題が正常に培養規模を縮小することによって対処することができ、これは、 すべての消費を低減するという利点を有している試薬は、in vitroでの解析1,2 にするために必要。残念なことに、従来の装置および方法は、マイクロスケールの文化や3-11はあまりにも複雑で、ほとんどの研究室で日常的使用のために特化され、現在入手可能なマイクロ流体ベースの自動化されたシステムの正確で再現性のある操作をサポートしていません。
マイクロスケールのボリュームで（1 - 20μL） - 本稿では、自動化された文化、刺激し、細胞の小集団（2,000細胞100）の回復のためのシンプルで汎用性の高い技術プラットフォームの組み立てと使用を説明します。フィブロネクチンでコーティングされたマイクロキャピラリーが（ "細胞灌流チャンバー"モジュール）マイクロスケール文化の確立、維持、刺激のためのサイトとして機能のセット、およびデジタルマイクロフルイディクス（DMF：プラットフォーム·アーキテクチャ（ 図1）は、設計でモジュール化され"転送"マイクロキャピラリー（ "中央ハブ"モジュール）14,15路線細胞を装備）12,13デバイス灌流チャンバーへとからと試薬。 DMFは、ユーザが個々に、同時に複数の液滴に対応し、デバイスハードウェアを変更することなく操作（ すなわち、再構成試料処理列）を変更または再注文することを可能にする。その驚異的な柔軟性は、細胞培養16,17、酵素アッセイ18,19、20,21イムノアッセイ、DNA分析22,23、タンパク質処理、24,25など、幅広い用途でのキーテクノロジーとしての最近の出現で明らかであるおよび臨床検体処理。26,27地球中心ハブは、DMFデバイスに固有の柔軟性を利用し、さらに特化した周辺装置の操作のサブセット（ 例えば、細胞培養物）を実施する機会を提供微小インタフェースを追加することによってそれを増強するむしろDMFデバイス自体よりもモジュール。このように処理列車の区画もPLAの設計を簡素化TFORMアーキテクチャ（ すべての処理手順を実行することができるDMFデバイスを構築する必要がない）と新しい機能としての進化を促進するには（単に必要に応じて新たな周辺モジュールを統合）が必要です。から、交通機関へ、そして灌流チャンバー内で高精度な注射器で生成された圧力変化によって供給され、中央ハブ内の細胞と試薬の輸送はDMF装置13,28内の電極の逐次的活性化によって生成される力をエレクトロウェッティングにより駆動されるポンプ。これらの流体運動のすべては、単純な電子インターフェースを介して制御され、予め決められたスクリプトを使用して自動化されている。
代表的な例として、細菌によるチャレンジ（ 図2）により誘発された免疫細胞の転写応答の研究のためのプラットフォームの使用を示す。プラットフォーム上でこれらの実験を行うことは、私たちは、細胞の数が少ない（experimen あたり 〜1,000で動作するように有効にTAL条件）、実験·ツー·実験の変動、節約試薬、再直接ハンズオン労力を最小限に抑えます。それが与えることの利点だけでなく、そのアクセシビリティと汎用性を考えると、このプラットフォームでは、研究室や様々なアプリケーションでの使用を見つけて、限られた量で提供された細胞と刺激の分析を容易にする、特に有用であることが分かるはずです。
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Protocol
この一般的なプロトコルは、研究の多種多様なプラットフォームのアプリケーションをサポートするように設計されているが、この報告書に記載の代表研究に固有の側面は括弧内に分離されている図2プロトコルを使用して行う代表的な研究を示しています。プロトコルでは、すべての "指示する"コマンドはあらかじめ決められたスクリプトの使用を介して自動化されていることに注意してください。ステップ2、ステップ1（ステップ1.7と1.8の間に、例えば ）と並行して行うことができることにも注意して、そのステップ2.1は、多くの場合、バイパスされ（パターン化/コーティングされたDMFデバイスプレートを洗浄して再使用することができるので、ステップ5.2を参照のこと） 。
1。細胞灌流チェンバースを組み立て、移入
- コート滅菌（オートクレーブ）マイクロキャピラリー（フューズドシリカ長さ15cm;; 679μmの外径、534μmの番号）の内面無菌フィブロネクチン溶液（50μgの/ mlの30μlの）を描画するためにシリンジポンプを指示することによってフィブロネクチンと、それぞれに解決策を撤回するシリンジポンプを指示すると、マイクロキャピラリー乾燥（6時間室温（RT）を）せ、（37℃2℃時間）インキュベートし、マイクロキャピラリー。
- CapTite継手（6灌流チャンバー、8ポートシリンジポンプ）を使用して、ポリカーボネートの管（500μmの外径、100μmのID）とマルチポートシリンジポンプにチューブに各フィブロネクチンでコーティングされたマイクロキャピラリー（灌流チャンバー）を接続します。
- テープを用いて、所望の温度（37℃）に設定したヒートブロックに各灌流チャンバーの本体を固定する。
- 新鮮な増殖培地（RPMI-1640、10％FBS、500単位/ mlペニシリン、500μgの中に懸濁させ、リザーバ内の灌流チャンバーの開放端（microcentifugeチューブまたはマイクロタイタープレートウェル）を含有する細胞（P388D.1マウスマクロファージ）浸し/所望の濃度（10 6細胞/ ml）でのストレプトマイシン）。
- 十分な愛が続く各灌流チャンバーに細胞（10μlを、10 4細胞）を描画するためにシリンジポンプを指示ヒートブロックに固定部分に液体プラグ（約4.5センチ）を移動するには、r。
- 細胞は灌流チャンバーのフィブロネクチンでコーティングされた内部表面（ - 2時間37℃で1）に準拠することができます。一方、セルリザーバからの新鮮な成長培地を含む新しいタンクに潅流チャンバの開放端を転送する。
- 遵守期間の後、無駄に新鮮な培地（10μL）を撤回し、付着した以上の新しい液体プラグ（新鮮な培地）を配置するために十分な空気に従うように液体プラグ（馴化培地と付着していない細胞）を送信するためにシリンジポンプを指示細胞。
- 細胞集団は、（ - 〜1,000細胞/チャンバーの集団を生成したマイクロスケールの文化の24時間16）が十分に平衡化と拡張になるまで定期的に（毎週2時間）で培地交換（ すなわち繰り返しステップ1.7）を実施し続けています。
2。 DMFデバイスを製造し、ハブ·アーキテクチャを組み立てる
- 、この間隔は、作動電極サイズ（2.5ミリメートル2）と組み合わせた液滴量（2.5μLを定義し、金属圧縮フレームを使用して、プレート間に400μmの間隔を維持する凹部を有するポリマーキャスト14,30にDMFのプレートを固定する電極当たり ）。 DMFアセンブリは単純な手段24によって達成することができることに注意してください。
- その同族作動電極の端まで延長し、各位置決めをDMFプレート間の空間に、 - ;インサートテフロンコーティングされた転送マイクロキャピラリー（4.0センチメートル長い3.5 OD、100μmの番号360ミクロン）。
- 反対ENに各転送マイクロキャピラリー接辞CapTite金具のD。
- ITO電極に電圧を供給するための電気コネクタをかみ合わせます。電極の活性化配列は、所定のスクリプトを実行しているコンピュータ制御された電子インターフェースの使用を介して自動化されている。
- オプション：液滴の追跡を容易にするために電荷結合素子（CCD）カメラ（DCR-HC96（ソニー、日本））を備えた顕微鏡の並進ステージ（SZ-6145TR（オリンパス、日本））上に組み立てられたハブDMFを移動する31
3。 DMFハブに灌流チェンバースを接続し、細胞集団を刺激
- 培地リザーバから灌流チャンバーの開放端を取り外します（ステップ1.6を参照）、（ステップ2.4を参照）をDMFハブの転送マイクロキャピラリーの両端に貼付CapTiteフィッティングに挿入してください。
- 無駄に灌流チャンバー内の液体プラグ（馴化培地）を送信するためにシリンジポンプに指示します。
- インストオンボードリザーバから（ 大腸菌 0.1％プルロニックF127 w / vの新鮮な培地では100μg/ mlで生体粒子）刺激を描き、微小毛細血管各転送に適切な大きさの液滴（10μL）を提供するDMFハブをruct 。オンボード·リザーバは、円筒状の区画（1.5×1.5センチずつ）で構成され、配管を介してDMFハブに接続されている。
- 刺激が転送マイクロキャピラリーに差し込む描き、灌流チャンバーで細胞集団上のプラグを配置するために十分な空気に従うことをシリンジポンプに指示します。
- 刺激（ - 4時間37℃1℃）で細胞をインキュベートする。オプション：定期的に新鮮な刺激のために為替（ つまりリピートステップ3.2から3.4）。
4。刺激を終了し、解析のための細胞ライセートを回復
- オプション：ポスト刺激期間が必要な場合は、（ すなわち繰り返しステップ3.2新鮮培地に対して刺激含有液プラグを交換する- 3.4、）刺激のために新鮮な培地を代入し、インキュベートし、必要に応じて交換することを続けています。
- 洗浄バッファー（プレリュード直接溶解モジュールバッファーB）（ すなわち繰り返しステップ3.2から3.4まで、刺激のための洗浄バッファーを代入）のExchange灌流チャンバー内の液栓、となど（5分）が必要とインキュベートする。
- 為替溶解溶液（プレリュード直接溶解モジュールバッファー0.1％プルロニックF127 w / v）のための液体プラグ（バッファを洗う）（ つまりリピートステップ3.2から3.4まで、刺激のために溶解液を置換）、および必要に応じてインキュベート（5分） 。
- DMFハブに液体プラグ（細胞溶解物）を送信するためにシリンジポンプに指示します。
- DMFハブを分解し、DMFデバイス（これは液滴混合になることができますように、横向きプレートを傾けないように注意して使用して）の天板を取り外し、オフプラットフォーム分析用ピペットマンや注射器を使用して溶解物（遺伝子発現プロファイリングを収集定量PCR経由）。
5。用クリーンプラットフォームハードウェア再利用
- 、RTで10分間、10％の漂白剤（水中v / v）で、転写マイクロキャピラリーとCapTite継手を浸す脱イオン水で十分にすすぎ、窒素ガスを用いたドライ。
- RTで10分間、10％の漂白剤でDMFデバイスプレートを浸し、イソプロパノールでよくすすぎ、脱イオン水に続いて、ドライ用いて窒素ガスを10分間160℃で焼成した。
- シリンジポンプのポリカーボネートチューブ、およびDMFデバイスのポリマーキャストと圧縮フレームは、洗浄することなく再利用することができる。灌流チャンバーマイクロキャピラリーは、各実験の後に破棄されます。
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Representative Results
自動化されたプラットフォームの証明として、我々は、免疫細胞の小集団は、マイクロスケール培養で増殖させた細菌でチャレンジし、炎症促進性応答（ 図2のプラットフォーム外分析のために溶解しされた研究を行うためにそれを使用し）。
6セル灌流チャンバーの各々は、成長培地10μlに再懸濁し、10 4免疫細胞（P388D.1ネズミマクロファージ）を播種した。遵守期間（37℃で2時間、C）と培地交換した後、〜500細胞は、複製マイクロ培養（細胞キレート剤処理を介して放出され、カウントの分析を通して測定された各チャンバーの内部表面（ 図3A）、に装着のまま血球計および光顕微鏡を介して）。 2時間間隔で培地交換し、16時間、37℃でさらにインキュベーションは、チャンバーあたり 〜1,000細胞（ 図3B）（として測定番目に細胞集団を拡大上記のように反復マイクロ文化の大まかな分析、）。 6灌流チャンバー4において、細胞集団はE.でチャレンジした大腸菌 （pHrodoの生体粒子）は、成長培地に再懸濁し、そして20の感染多重度（MOI）（ すなわち、集団の各セルは、平均で、20生体粒子でチャレンジした）で供給。残りの二つのチャンバ内で、細胞集団は、モックチャレンジ（ すなわち、増殖培地のみ）を受けた。 37℃でインキュベーション℃で1時間（2細菌挑戦文化）または4時間（2細菌挑戦、そして2つはモック挑戦、文化）のためのCの後、細胞を洗浄し、溶解し、溶解物は、DMFのハブから回収された。従来のベンチスケール方法は、溶解物からcDNAを調製するために使用され、炎症性メディエーターのための転写レベルを測定する：ケモカインMIP-1β（CCL4）とRANTES（CCL5）、誘導性シクロオキシゲナーゼCOX-2（PTGS2）、およびサイトカインTNFα（TNF ）。
図4は、3つの独立して複製された実験の結果をまとめたものです。我々は、従来の培養（青いバー）で栽培し、挑戦細胞で誘発したものと本質的に同一であった炎症誘発転写応答をマウントする免疫細胞（赤いバー）マイクロスケール培養で成長し、挑戦することがわかった。また、オン·プラットフォーム（マイクロスケール）実験は、より少ない変動性（ほど小さく誤差棒によって示される）を示し、細胞と試薬の少量（ 表1）を消費する。
図1。マイクロスケール細胞刺激のための実験のための自動化されたプラットフォームの写真。
図2。マイクロスケール培養における細菌でチャレンジ免疫細胞の転写プロファイリング：代表Platform対応実験の概要。
図3。免疫細胞の写真でマウスマクロファージ（P388D.1細胞株）は10 6細胞/ mlの濃度で増殖培地中に再懸濁した。マイクロスケール灌流チャンバーに培養し 、そして10μlのは（10 4細胞）シードフィブロネクチンするために使用被覆（灌流チャンバー）マイクロキャピラリー。明視野の写真はCCDカメラ（Qimaging）を備えたMVX10顕微鏡（オリンパス）を用いて撮影した。集団サイズを測定するために、反復ミクロスケールの培養物からの細胞を、細胞ストリッパーを使用して、潅流チャンバ表面から放出トリパンブルーを用いて染色し、血球計および光学顕微鏡を用いて計数した。A. 、B.は （37℃でのインキュベーションと培地交換毎に2時間）、人口は約1,000細胞に拡大した。
図4。マイクロスケール灌流チャンバーに対して従来の船舶で培養し、刺激免疫細胞の転写プロフィール。マウスマクロファージ（P388D.1細胞株）を10 6細胞/ mlの濃度で増殖培地中に再懸濁した。従来の培養物について、50μlの（5×10 4細胞）を96ウェルマイクロタイタープレートのウェルに成長培地の種150μlのために使用された。マイクロスケールの培養のために、10μlの（10 4細胞）をシードとして利用したフィブロネクチンコーティングmicrocapilキャピラリ（灌流チャンバー）。 16時間37℃でインキュベーション後、細胞を（マイクロスケール培養当たり約5×10 4の従来の培養あたり、10〜3）でチャレンジしたE. 20の感染多重度（MOI）（つまり、文化のすべてのセルのために20生体粒子）での大腸菌は（pHrodoの生体粒子）、ネガティブコントロール（モック挑戦）文化は唯一新鮮な培地を受け取った。 37℃でさらにインキュベートした後℃で1又は4時間C、細胞を洗浄し、前奏の直接溶解モジュールから試薬を用いて溶解した。ライセートRNAは、増幅され、使用したcDNAオベーションPicoSL WTA、アジェンコートRNAClean XPを使用して精製大きい（≥200 NT）のcDNA産物、およびMIP-1β（CCL4）が転写レベルを測定するためのTaqMan定量PCRアッセイにおける鋳型として用い、これらの製品に変換されたRANTES（CCL5）、COX-2（PTGS2）、およびTNFα（TNF）、ならびにGAPDH（溶解液との間のcDNAレベルを正規化）。各定量PCRアッセイを3回行い、結果を平均した。 Eaはchの実験を独立して三回繰り返した。バーは、従来の文化では転写レベルでの平均倍に増加（青）またはネガティブコントロール（モック挑戦）文化に比べ細菌でチャレンジミクロスケール培養（赤）を、示し、エラーバーは、3つの実験で標準偏差を示している。
| 要件 | 従来の実験 | マイクロスケール実験 |
| 細胞 | 3,000,000 | 60,000 |
| 成長培地 | 2.4ミリリットル | 0.7ミリリットル |
| 生体粒子 | 200μgの | 4μgの |
| ウォッシュ＆溶解試薬 | 300μlの各 | 60μlの各 |
表1。従来の対マイクロスケール細胞刺激実験のための要件sである。数字はネズミマクロファージ（P388D.1細胞株）は、従来の6（96ウェルマイクロタイタープレート）対マイクロスケール（灌流チャンバー）培養で増殖された本報告書に記載の代表的な実験（ 図2）から引き出されている、E.でチャレンジMOI 20で大腸菌 （pHrodoの生体粒子）、および定量PCR解析のために溶解した。
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Discussion
私たちは、マイクロスケールの細胞培養と刺激実験のためのシンプルで汎用性の高い自動化されたプラットフォームを開発しました。文化サイズがさらに小さい直径のマイクロキャピラリーを使用することにより減少させることができる、プラットフォームは、私たちは小さな文化ボリュームと細胞集団- （ - 20μLと100 2,000細胞、室ごとに1）で動作するようになります。これらのスケールでの仕事はルーチン試験のコストを低減し、貴重な試薬および/または細胞の使用を必要とする可能研究を行う。プラットフォーム実行実験は、細胞や体液が自動化されたプラットフォームによって処理される精度と再現性におそらく起因少なくばらつきを示す。
プラットフォームの現在の構成は、播種、平衡、および灌流チャンバーで細胞集団の拡大のためにオフボード貯水池（マイクロチューブまたはマイクロタイタープレートウェル）から細胞やメディアを描画します。これは、間に不一致に対処するための簡単な方法である成長培地要件（上記の代表的な実験で消費される例えば 700μL）およびDMFデバイスの貯水池（24μLずつ）オンボードの容量。しかし、この構成では、2つのリザーバ（ステップ1.6）に切り替えるとDMFハブ（ステップ3.1）に灌流チャンバーを接続し、中間実験マニュアル介入を必要とする。将来の構成により半ば実験マニュアルの介入の必要性を排除し、DMFのハブを介してすべての材料のルーティングを可能にする貯水池、オンボード大容量（ 例えば 1ml）を含めることができます。
我々の実験では、プラットフォーム上で細胞の短期（<24時間）文化のみ必要。我々は、プラットフォーム上で細胞生存率は、少なくとも24時間（データは示さず）のための従来の培養物のそれに匹敵することを確認した。しかし、我々はまだ長期間にわたってプラットフォーム上で培養を維持しようとしていない。蒸発が主要な関心事ではないので、プラットフォームの潅流チャンバ及び成長培地リザーバは、部分的に閉じたシステムであり、細胞を覆う液体プラグを容易に交換媒体を介して補充される。一方、長期の培養物のpHを維持するために、それが5で成長培地リザーバを収容する必要があるかもしれ- CO 2重炭酸塩ベースのpH緩衝剤を含まない、10％CO 2雰囲気又は成長培地への切り替え。さらに、積極的に分裂している細胞の長期培養は、細胞（リリース、洗い、希釈、再シード）の継代必要となる密集度の点（灌流チャンバー内の利用可能なすべての面すなわち報道）に集団を拡大する。その他は、マイクロ流体政権3,5,6,9,17でこれを達成したし、現在の構成では、プラットフォームは、必要な操作のすべてを遂行することができるはずです。要約すると、我々はささやかな修正（主にプロトコルに、むしろハードウェアより）と当社のプラットフォームは、cであることを予想し長期的な哺乳動物細胞培養をサポートapable。従来の方法では時間がかかり、労働集約的であるため、これは特に有望な将来の方向に見えるだろう。私達の自動化プラットフォームのレパートリーに長期培養機能を追加すると、さらにそのユーザーがより生産的労働をリダイレクトすることが可能となります。
我々はこれまで少数の異なる細胞タイプ（ 例えばネズミマクロファージ細胞系RAW264.7、マウス骨髄由来マクロファージ（BMDM））を試験してきたが、プラットフォームは、実質的に任意の付着細胞の種類に対応できなければならない。いくつかのケースでは、フィブロネクチンから別の細胞外マトリックス成分（又は成分の混合物）を灌流チャンバーコーティングを変更したり、増殖培地を変更する必要があるかもしれないが、これらの変更が容易になされる。非接着細胞タイプで作業がより困難かもしれないが、細胞テザリング戦略は、同じような文脈32-34で成功している。それ笙自民はまた、複数の種類の細胞から構成される混合培養を作成することが可能、実際、プラットフォームは細胞や体液を処理すると精度が混合培養のその建設は非常に再現性があることを確認する必要があります。
刺激に関しては、水性液体プラグ内に輸送することができる事実上すべての物質は、当社のプラットフォーム5,13,16,35と互換性があります。時間の経過と共に沈降することができ、大規模または稠密粒子の場合には、定期的にリザーバ内でそれらを再懸濁するために必要であるかもしれません。過去に、我々は高濃度キャリア流体36又は単純な撹拌の使用によってこの問題に対処しているシステム（データは示さず）、我々のプラットフォーム上で実装が簡単であるべきソリューション。
これまでのところ、プラットフォーム上で培養し、刺激した細胞の特徴付け我々の顕著な特徴は、主に炎症促進性反応の定量RT-PCR解析に焦点を当てている。 tと次のステップ、包括的な分析など彼細胞集団のトランスクリプトームは、（DNAマイクロアレイや次世代シーケンシング（SGS）（ すなわち RNA - seqの37,38）を介して）、到達範囲内である、cDNAの調製工程のささやかな修正を加えて、当社のプラットフォームおよびプロトコルは、グローバルサポートの完全に可能でなければなりません転写プロファイリング研究。同様に、タンパク質レベルでの細胞集団応答の分析（ELISA、免疫沈降、質量分析、またはタンパク質マイクロアレイを介して）溶解物調製工程の変更のみを必要とするべきである。プラットフォームはまた、細胞応答のイメージングベースの分析をサポートしています。細胞は、灌流チャンバー（ 例えば、 図3）内に結像することができ、潅流チャンバモジュールの（四捨五入ではなく）平坦な表面のマイクロキャピラリーの使用は、このタイプの分析を容易にするであろう。さらに、細胞を前の潅流チャンバの播種および/ またはそれらからの解放後、DMFハブ14,15上に結像することができる。放出された細胞はまたから離れ結像することができるプラットフォーム。これまで、我々は、刺激（ 例えば、生体粒子）が互いに（データは示さず）とその形態、生存、増殖速度、および物理的相互作用を分析するために、これらの段階の全ての画像細胞に光及び蛍光顕微鏡を使用している。顕微鏡検査はまた、（蛍光色素の使用によって評価）代謝産物含量の分析を可能にするべきであり、転写活性（レポーター構築物の使用によって評価）、およびタンパク質レベル/ローカライゼーション（レポーター構築物、蛍光タンパク質融合構築物、および/または免疫細胞化学の使用によって評価）。放出された細胞は、同様にフローサイトメトリーを用いて分析することができる。これらの分析の多くは、現在のコンフィギュレーションのプラットフォームに完全に行うことができたものもあれば、DMFへの接続を介して、プラットフォームに（ 例えば参照36,39-41を参照）専門マイクロ流体ベースのモジュールのオフプラットフォームの分析や統合を必要とするであろうハブ。一緒になって、それはおそらくT思える帽子のプラットフォームは、特に非常に複雑で高価なロボットシステムを使用することによってのみ達成することができる細胞の小集団の多次元分析が可能に貴重な証明する。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
著者はDMFデバイスおよびDMFハブの設計と開発への貢献のためにロナルドF.レンツィとマイケルS. BARTSCHに感謝します。この研究は完全にサンディア国立研究所で研究所監督研究開発プログラムによってサポートされていました。サンディア国立研究所は、契約DE-AC04-94AL85000下エネルギー省の国家核安全保障管理局の米国商務省のためサンディア社、ロッキード·マーティン社の完全子会社が管理·運営、マルチプログラム研究室です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Prelude Direct Lysis Module | NuGEN | 1400-24 | |
| Trypan Blue (0.4% w/v) | GIBCO | 15250-061 | |
| Cell Stripper | Cellgro | 25-056-C1 | |
| Ovation PicoSL WTA | NuGEN | 3310-048 | |
| Agencourt RNAClean XP | Beckman Coulter Genomics | A63987 | |
| pHrodo BioParticles | Invitrogen | P35361 | |
| CCL4 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443111_m1 | |
| CCL5 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm01302428_m1 | |
| PTGS2 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00478374_m1 | |
| TNF TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443258_m1 | |
| GAPDH TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm99999915_g1 | |
| Pluronic F127 | Sigma Chemical | 2594628 | |
| Fluorinert FC-40 | Sigma Chemical | 51142-49-5 | |
| Parylene C dimer | Specialty Coating Systems | 28804-46-8 | |
| Teflon-AF | DuPont | AF1600 | |
| Polyimide tape | ULINE | S-11928 | |
| Indium tin oxide (ITO) coated glass substrates | Delta Technologies | CB-40IN-1107 | |
| DMF hub Teflon-coated fused-silica microcapillaries | Polymicro Technologies | TSU100375 | |
| Perfusion chamber microcapillaries | Polymicro Technologies | TSP530700 | |
| Tubing and microcapillary fittings | Sandia National Laboratories | ||
| Polycarbonate tubing | Paradigm Optics | CTPC100-500-5 | |
| 8-port precision syringe pump equipped with 30 mm (500 μl capacity) syringes | Hamilton Company | 54848-01 | |
| Parylene-C vapor deposition instrument | Specialty Coating Systems | PDS 2010 Labcoter 2 | |
| High-voltage function generator | Trek | 615A-1 615-3 | |
| MVX10 microscope | Olympus | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) | |
| QIClick digital CCD camera | QImaging | QIClick-F-CLR-12 | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) |
References
- Young, E. W. K., Beebe, D. J. Fundamentals of microfluidic cell culture in controlled microenvironments. Chemical Society Reviews. 39, 1036-1048 (2010).
- Yeo, L. Y., Chang, H. C., Chan, P. P. Y., Friend, J. R.
- Zhang, B., Kim, M. C., Thorsen, T., Wang, Z. A self-contained microfluidic cell culture system. Biomedical Microdevices. 11, 1233-1237 (2009).
- Skafte-Pedersen, P., et al. A self-contained, programmable microfluidic cell culture system with real-time microscopy access. Biomedical Microdevices. 14, 385-399 (2012).
- Barbulovic-Nad, I., Au, S. H., Wheeler, A. R. A microfluidic platform for complete mammalian cell culture. Lab Chip. 10, 1536-1542 (2010).
- Zhou, Y., Pang, Y., Huang, Y. Openly Accessible Microfluidic Liquid Handlers for Automated High-Throughput Nanoliter Cell Culture. Analytical Chemistry. 84, 2576-2584 (2012).
- Wang, H. Y., Bao, N., Lu, C. A microfluidic cell array with individually addressable culture chambers. Biosensors and Bioelectronics. 24, 613-617 (2008).
- Cimetta, E., Cagnin, S., Volpatti, A., Lanfranchi, G., Elvassore, N. Dynamic culture of droplet-confined cell arrays. Biotechnology Progress. 26, 220-231 (2010).
- Hung, P. J., Lee, P. J., Sabounchi, P., Lin, R., Lee, L. P. Continuous perfusion microfluidic cell culture array for high-throughput cell-based assays. Biotechnology and Bioengineering. 89, 1-8 (2005).
- King, K. R., et al. A high-throughput microfluidic real-time gene expression living cell array. Lab on a Chip. 7, 77-85 (2007).
- Gómez-Sjöberg, R., Leyrat, A. A., Pirone, D. M., Chen, C. S., Quake, S. R. Versatile, fully automated, microfluidic cell culture system. Analytical Chemistry. 79, 8557-8563 (2007).
- Wheeler, A. R. Chemistry - Putting electrowetting to work. Science. 322, 539-540 (2008).
- Gong, J., Kim, C. J. All-electronic droplet generation on-chip with real-time feedback control for EWOD digital microfluidics. Lab Chip. 8, 898-906 (2008).
- Choi, K., et al. Integration of field effect transistor-based biosensors with a digital microfluidic device for a lab-on-a-chip application. Lab Chip. 12, 1533-1536 (2012).
- Barbulovic-Nad, I., Yang, H., Park, P. S., Wheeler, A. R. Digital microfluidics for cell-based assays. Lab Chip. 8, 519-526 (2008).
- Gentilucci, L., de Marco, R., Cerisoli, L. Chemical modifications designed to improve peptide stability: incorporation of non-natural amino acids, pseudo-peptide. 16, 3185-3203 (2010).
- Miller, E. M., Wheeler, A. R. A digital microfluidic approach to homogeneous enzyme assays. Anal. Chem. 80, 1614-1619 (2008).
- Jebrail, M. J., Bartsch, M. S., Patel, K. D. Digital microfluidics: a versatile tool for applications in chemistry, biology. 12, 2452-2463 (2012).
- Ng, A. H. C., Choi, K., Luoma, R. P., Robinson, J. M., Wheeler, A. R. Digital Microfluidic Magnetic Separation for Particle-Based Immunoassays. Analytical Chemistry. 84, 8805-8812 (2012).
- Sista, R. S., et al. Heterogeneous immunoassays using magnetic beads on a digital microfluidic platform. Lab Chip. 8, 2188-2196 (2008).
- Malic, L., Veres, T., Tabrizian, M. Biochip functionalization using electrowetting-on-dielectric digital microfluidics for surface plasmon resonance imaging detection of DNA hybridization. Biosens. Bioelectron. 24, 2218-2224 (2009).
- Malic, L., Veres, T., Tabrizian, M. Nanostructured digital microfluidics for enhanced surface plasmon resonance imaging. Biosens. Bioelectron. 26, 2053-2059 (2011).
- Jebrail, M. J., Wheeler, A. R. Digital microfluidic method for protein extraction by precipitation. Anal. Chem. 81, 330-335 (2009).
- Nelson, W. C., et al. Incubated protein reduction and digestion on an electrowetting-on-dielectric digital microfluidic chip for MALDI-MS. Anal. Chem. 82, 9932-9937 (2010).
- Mousa, N. A., et al. Droplet-scale estrogen assays in breast tissue, blood, and serum. Sci. Transl. Med. 1, 1ra2 (2009).
- Jebrail, M. J., et al. A digital microfluidic method for dried blood spot analysis. Lab Chip. 11, 3218-3224 (2011).
- Choi, K., Ng, A. H. C., Fobel, R., Wheeler, A. R.
- Jebrail, M. J., et al. Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing. J. Vis. Exp. (33), e1603 (2009).
- Thaitrong, N., et al. Quality Control of Next Generation Sequencing Library through an Integrative Digital Microfluidic Platform. , Submitted (2012).
- Shin, Y. J., Lee, J. B. Machine vision for digital microfluidics. Review of Scientific Instruments. 81, (2010).
- Thornton, M., Eward, K. L., Helmstetter, C. E. Production of minimally disturbed synchronous cultures of hematopoietic cells. BioTechniques. 32, 1098-1105 (2002).
- Huang, X., Dai, W., Darzynkiewicz, Z. Enforced adhesion of hematopoietic cells to culture dish induces endomitosis and polyploidy. Cell Cycle. 4, 801-805 (2005).
- Raje, M., et al. Charged nylon membrane substrate for convenient and versatile high resolution microscopic analysis of Escherichia coli & mammalian cells in suspension culture. Cytotechnology. 51, 111-117 (2006).
- Chatterjee, D., Hetayothin, B., Wheeler, A. R., King, D. J., Garrell, R. L. Droplet-based microfluidics with nonaqueous solvents and solutions. Lab Chip. 6, 199-206 (2006).
- Perroud, T. D., et al. Microfluidic-based cell sorting of Francisella tularensis infected macrophages using optical forces. Analytical Chemistry. 80, 6365-6372 (2008).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10, 57-63 (2009).
- Malone, J. H., Oliver, B. Microarrays, deep sequencing and the true measure of the transcriptome. BMC Biology. 9, (2011).
- Wu, M., et al. Microfluidically-unified cell culture, sample preparation, imaging and flow cytometry for measurement of cell signaling pathways with single cell resolution. Lab on a Chip. 12, 2823-2831 (2012).
- Srivastava, N., et al. Fully integrated microfluidic platform enabling automated phosphoprofiling of macrophage response. Analytical Chemistry. 81, 3261-3269 (2009).
- Herr, A. E., et al. Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 5268-5273 (2007).
