Summary
Vi har utvecklat en automatiserad cellkultur och förhör plattform för mikro-skala experiment cellstimulering. Plattformen erbjuder enkel, mångsidig och exakt styrning odla och stimulera små populationer av celler, och återhämtar lysates för molekylära analyser. Plattformen lämpar sig väl för studier som använder värdefulla celler och / eller reagens.
Abstract
Studie av celler i odling (in vitro-analys) har gett viktig insikt i komplexa biologiska system. Konventionella metoder och utrustning för in vitro-analys är väl lämpade för att studera ett stort antal celler (≥ 10 5) i milliliter skala volymer (≥ 0,1 ml). Men det finns många fall där det är nödvändigt eller önskvärt att skala ner kulturen storlek för att minska förbrukningen av cellerna av intresse och / eller reagens som krävs för deras kultur, stimulans, eller bearbetning. Tyvärr stöder konventionella metoder inte exakt och reproducerbar manipulation av mikro-skala kulturer, och de microfluidicsen-baserade automatiserade system som för närvarande finns tillgängliga är alltför komplex och specialiserad för rutinmässig användning av de flesta laboratorier. För att lösa detta problem, har vi utvecklat en enkel och mångsidig teknologiplattform för automatiserad kultur, stimulans och återvinning av små populationer av celler (100 - 2000 celler) i mikroskala volyms (1 till 20 | il). Plattformen består av en uppsättning fibronektinbelagda mikrokapillärer ("cell perfusionskammare"), inom vilken mikro-skala kulturer upprättas, bevaras och stimuleras, en digital mikrofluidik (DMF)-enhet utrustad med "transfer" mikrokapillärer ("central hub "), som sträckor celler och reagenser till och från perfusionskammare, en hög precision spruta pump, som driver transport av material mellan perfusionskammare och det centrala navet, och ett elektroniskt gränssnitt som ger kontroll över transport av material, vilket är samordnas och automatiseras via förutbestämda skript. Som ett exempel använde vi en plattform för att underlätta studier av transkriptionella de reaktioner i immunceller vid utmaning med bakterier. Användning av plattformen kunde vi minska förbrukningen av celler och reagenser, minimera experiment till experiment variabilitet, och re-direkta praktiska arbete. Med tanke på de fördelar det ger, liksom dess tillgänglighet och mångsidighet, oUR plattform bör finna användning i en mängd olika laboratorier och applikationer, och visa sig särskilt användbara för att underlätta analys av celler och stimuli som finns i begränsade mängder.
Introduction
Studien av celler hålls i kultur (in vitro-analys) har gett ovärderlig inblick i de grundläggande principerna och molekylära mekanismer som styr komplexa biologiska system och människors hälsa. De konventionella metoderna för odling, stimulans, och insamling av celler för analys, som utnyttjar petriskålar och mikrotiterplattor, var utformade för studier av stora populationer av celler (≥ 10 5) i milliliter skala kulturvolymer (≥ 0,1 ml). Men det finns många fall där endast begränsade mängder celler finns tillgängliga (t.ex. primära celler), eller små populationer av celler är önskvärda (t.ex. för att reducera cell-till-cell variation bland befolkningen), eller erforderliga reagenser är svårt att få eller oöverkomligt dyr (t.ex. renade cell-utsöndrade faktorer). Sådana frågor kan framgångsrikt behandlas genom nedskalning kultur storlek, som har den extra fördelen att minska förbrukningen av allareagenser som krävs för in vitro-analys 1,2. Tyvärr, konventionell utrustning och metoder stöder inte exakt och reproducerbar manipulation av mikro-skala kulturer och de microfluidics-baserade automatiserade system tillgängliga 3-11 är alltför komplex och specialiserad för rutinmässig användning av de flesta laboratorier.
I denna rapport beskriver vi montering och användning av en enkel och mångsidig teknologiplattform för automatiserad kultur, stimulans och återvinning av små populationer av celler (100 - 2000 celler) i mikroskala volymer (1 - 20 pl). Plattformen arkitektur (figur 1) är modulärt uppbyggt: en uppsättning fibronektinbelagda mikrokapillärer ("cell perfusionskammare" modul) tjänar som plats för etablering, underhåll, och stimulering av mikro-skala kulturer, och en digital mikrofluidik (DMF ) 12,13 enheten utrustad med "transfer" mikrokapillärer ("central hub" modul) 14,15 rutter celleroch reagens till och från perfusionskammare. DMF kan användaren individuellt behandla flera droppar samtidigt och att ändra eller åter beställa manipulationer (dvs. konfigurera sampelbehandlingen tåg) utan att ändra enhetens maskinvara. Dess enorma flexibilitet är tydlig i sin växt fram som en viktig teknik i ett brett spektrum av tillämpningar, inklusive cellodling 16,17, analyser enzym 18,19, immunanalyser 20,21, DNA-analys 22,23, protein bearbetning, 24,25 och kliniskt prov bearbetning. 26,27 Vår centrala navet utnyttjar den flexibilitet inneboende till DMF-enheter, och ytterligare förbättrar det genom tillägg av microcapillary gränssnitt, vilket ger möjlighet att genomföra en delmängd av manipulationer (t.ex. cellodling) i specialiserade perifera moduler, snarare än på DMF själva enheten. Uppdelning av bearbetning tåg på detta sätt förenklar också utformningen av PLATForm arkitektur (inget behov av att bygga en DMF enhet som kan utföra alla processteg) och underlättar dess utveckling som nya funktioner krävs (enkelt integrera nya perifera moduler som behövs). Transport av celler och reagenser inom det centrala navet drivs av electrowetting krafter som genereras av sekventiell aktivering av elektroder inom DMF anordningen 13,28, transport till, från och inom perfusionskammare drivs av tryckförändringar som genereras av en hög precision spruta pump. Alla dessa flytande rörelser styrs via ett enkelt elektroniskt gränssnitt och automatiseras genom användning av förutbestämda skript.
Som ett representativt exempel visar vi användning av plattformen för studier av transkriptionella responser framkallade i immunceller vid utmaning med bakterier (figur 2). Att utföra dessa experiment på plattformen möjligt för oss att arbeta med ett litet antal celler (~ 1.000 per experimental skick), minimerar experiment till experiment variabilitet, bevara reagenser, och re-direct praktisk arbetskraft. Med tanke på de fördelar det ger, liksom dess tillgänglighet och mångsidighet, bör denna plattform finner användning i en mängd olika laboratorier och tillämpningar och visa sig särskilt användbara för att underlätta analys av celler och stimuli som finns i begränsade mängder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna allmänna protokoll är utformad för att stödja tillämpningen av plattformen till en mängd olika studier, aspekter som är specifika för den representativa studien som beskrivs i denna rapport är separerade i parentes Figur 2 visar en representativ studie som genomförts med hjälp av protokollet.. Notera att i protokollet, alla "instruerar" kommandon automatiseras genom användning av förutbestämda skript. Notera också att steg 2 kan genomföras parallellt med steg 1 (t.ex. under steg 1.7 och 1.8), och att Steg 2.1 är ofta förbi (eftersom mönstrade / bestruket DMF enhet plattorna kan tvättas och återanvändas, se steg 5.2) .
Ett. Montera och befolka Chambers Cell Perfusionsprodukter
- Coat de inre ytorna av steriliserad (autoklaverad) mikrokapillärer (kvartsglas, 679 ^ m OD, 534 ^ m id; 15 cm lång) med fibronektin, genom att instruera sprutpumpen för att rita en steril fibronektin lösning (30 pl av 50 pg / ml) in i varjemikrokapillär, inkubering (37 ° C under 2 h), instruerar sprutpumpen att dra tillbaka lösningen och låta mikrokapillärer torka (rumstemperatur (RT) under 6 h).
- Anslut varje fibronektinbelagda microcapillary (perfusionskammare) till polykarbonat slang (500 ^ OD, 100 ^ id) och slangen till multi-port sprutpump, med CapTite beslag (6 perfusionskammare, 8-port sprutpump).
- Använda tejp, säkra organet i varje perfusionskammare till ett värmeblock inställt på önskad temperatur (37 ° C).
- Sänk ned öppna ändarna av perfusionskammare i en reservoar (microcentifuge rör eller mikrotiterplattbrunn) innehållande celler (P388D.1 murina makrofager) suspenderade i färskt tillväxtmedium (RPMI-1640, 10% FBS, 500 enheter / ml penicillin, 500 | ig / ml streptomycin) vid önskad koncentration (10 6 celler / ml).
- Instruera sprutpumpen att rita celler (10 ^, 10 4 celler) i varje perfusionskammaren följt av tillräckligt AIr för att förflytta vätskan pluggen (~ 4,5 cm) till sektionen fäst vid värmeblocket.
- Låt cellerna att vidhäfta till de fibronektinbelagda innerytor perfusionskammare (37 ° C under 1 - 2 h). Under tiden överför de öppna ändarna av perfusionskammare från celler reservoaren till en ny behållare med färskt tillväxtmedium.
- Efter följsamhet period, instruera sprutpumpen att skicka de flytande pluggar (konditionerat medium och obundna celler) till avfall, återkalla färskt medium (10 pl), och följ med tillräckligt med luft för att placera de nya flytande pluggar (färskt medium) över vidhäftade celler.
- Fortsätta att genomföra medelstora börser (dvs. upprepa steg 1.7) med jämna mellanrum (var 2 tim) tills cellpopulationerna är tillräckligt jämvikt och utökad (16 - 24 tim i mikroskala genererade kultur populationer av ~ 1000 celler / kammare).
2. Tillverka DMF Device och Montera Hub Architecture
- Använda metallbågar komprimering, fixa DMF plattorna i en polymer gjutet 14,30 med fördjupningar som upprätthåller en 400 nm mellanrum mellan plattorna, detta avstånd, i kombination med aktivering elektroden storlek (2,5 mm 2), definierar droppvolymen (2,5 ^ per elektrod). Observera att DMF montering kan åstadkommas på ett enklare sätt 24.
- Infoga teflonbelagd överföring mikrokapillärer (360 ^ m OD, 100 ^ m id; 3,5-4,0 cm lång) in i utrymmet mellan de DMF plattorna, positionering av varje att sträcka sig till kanten av dess besläktade manövrering elektrod.
- Till den motsatta svd för varje överföring microcapillary anbringa en CapTite montering.
- Engagera de elektriska kontakterna för matningsspänning till ITO elektroder. Elektrod aktiveringssekvenser är automatiserade genom användning av en datorstyrd elektroniskt gränssnitt kör förutbestämda skript.
- Valfritt: Flytta monterade DMF navet på translationell skede av ett mikroskop (SZ-6145TR (Olympus, Japan)) utrustad med en charge-coupled device (CCD) kamera (DCR-HC96 (Sony, Japan)) för att underlätta spårning av droppar . 31
Tre. Anslut perfusionskammare till DMF-Hub och stimulera cellpopulationerna
- Ta bort de öppna ändarna av perfusionskammare från mediet reservoaren (se steg 1.6) och infoga dem i de CapTite beslag fästa till ändarna av överföringen mikrokapillärer av DMF navet (se steg 2.4).
- Instruera sprutpumpen för att skicka de flytande pluggarna (konditionerat medium) i perfusionskammare till avfall.
- Instruct DMF navet för att dra stimulus (E.coli biopartiklar vid 100 | ig / ml i färskt medium med 0,1% Pluronic F127 vikt / volym) från en ombord reservoar och leverera en liten droppe av lämplig storlek (10 | il) till varje överföring mikrokapillär . Den fordonsbaserade reservoarerna består av cylinderformade fack (1,5 x 1,5 cm vardera) och anslutna till DMF Hub via slang.
- Instruera sprutpumpen att dra stimulus kopplas in i överföringen mikrokapillärer, och följ med tillräckligt med luft för att placera pluggarna över cellpopulationerna i perfusionskammare.
- Inkubera cellerna med stimulus (37 ° C under 1-4 h). Valfritt: Utbyte för färskt stimulus (dvs. upprepa steg från 3,2 till 3,4) med jämna mellanrum.
4. Avsluta stimuleringen och Recover Cellysater för analys
- Valfritt: Om en post-stimulering period krävs, byta ut stimulus-innehållande flytande pluggar för färskt medium (dvs. upprepa steg från 3,2 till 3.4, Ersätta färskt medium för stimulus), och fortsätter att ruva och byta efter behov.
- Exchange vätskan pluggar i perfusionskammare för tvättbuffert (Prelude Direkt Lysis Module Buffer B) (dvs. upprepa steg från 3,2 till 3,4, varvid tvättbuffert för stimulus) och inkubera vid behov (5 min).
- Börsen de flytande pluggar (tvättbuffert) för lyslösning (Prelude Direkt Lysis Module Buffer A med 0,1% Pluronic F127 w / v) (dvs. upprepa steg från 3,2 till 3,4, varvid lys lösning för stimulus), och inkubera behövs som (5 min) .
- Instruera sprutpumpen för att skicka de flytande pluggarna (cellysat) till DMF-nav.
- Demontera DMF navet, ta bort den övre plattan av DMF-enheten (med försiktig att inte luta plattan åt sidan, eftersom detta kan resultera i droppform blandning), och samla lysaten med hjälp av en Pipetman eller spruta för off-plattform analys (profilering av genuttryck via qPCR).
Fem. Ren Plattform i metall förÅteranvända
- Sänk överföringen mikrokapillärer och CapTite beslag i 10% blekmedel (v / v i vatten) i 10 min vid RT, skölj väl med avjoniserat vatten och torka med kvävgas.
- Sänk ned DMF enheten plattorna i 10% blekmedel under 10 min vid RT, skölj väl med isopropanol följt av avjoniserat vatten, och torka med användning av kvävgas följt av bakning vid 160 ° C under 10 min.
- Sprutan pumpens polykarbonat slang, och DMF enhetens polymer rösterna och komprimering ram, kan återanvändas utan rengöring. Perfusionskammaren mikrokapillärer kastas efter varje experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som en demonstration av den automatiserade plattformen, vi använde det för att genomföra en studie där små populationer av immunceller odlades i mikroskala kulturer, utmanas med bakterier, och lyseras för off-plattform analys av pro-inflammatoriska reaktioner (figur 2 ).
Var och en av sex kammare cell perfusion ympades med 10 4 immunceller (P388D.1 murina makrofager) återsuspenderades i 10 | il av tillväxtmedium. Efter en vidhäftning period (37 ° C under 2 timmar) och ett medium utbyte förblev ~ 500 celler fäst vid de inre ytorna av varje kammare (figur 3A), mätt genom analys av replikat mikroskala kulturer (celler frigörs via kelator behandling och räknades via hemacytometer och ljusmikroskop). Ytterligare inkubering vid 37 ° C under 16 h, med medium utbyten på 2 timmars intervall, expanderade cellpopulationerna till ~ 1000 celler per kammare (figur 3B) (mätt thgrov analys av replikat mikroskala kulturer, såsom beskrivits ovan). I fyra av de sex perfusionskammare, var cellpopulationer utmanas med E. coli-bakterier (pHrodo biopartiklar), suspenderades i odlingsmedium, och levereras med en mångfald av infektion (MOI) av 20 (dvs varje cell i populationen utmanades med 20 biopartiklar i genomsnitt). I de återstående två kamrarna, fick de cellpopulationer en mock provokation (dvs. tillväxtmedium endast). Efter inkubation vid 37 ° C under 1 h (två bakterie-utmanade kulturer) eller 4 h (två bakterie-utmanade, och två mock-utmanade, kulturer), tvättades cellerna och lyserades, och lysaten utvinnas från DMF navet. Konventionella bänkskala metoder användes för att framställa cDNA från lysaten och för att mäta avskrift nivåer för inflammationsmediatorer: kemokinerna MIP-1β (CCI4) och RANTES (CCL5), inducerbar cyklooxygenas COX-2 (PTGS2), och cytokin TNFa (TNF ).
Figur 4 sammanfattar resultaten från tre oberoende replikerade experiment. Vi fann att immunceller odlade och utmanas i mikroskala kulturer (röda staplar) monterade proinflammatoriska transkriptionella svar som var väsentligen identiska med de som framkallades i celler som odlas och utmanas i konventionella odlingar (blå staplar). Dessutom visade de på-plattformen (mikro-skala) experiment mindre variabilitet (såsom anges av mindre felstaplar) och konsumeras mindre mängder celler och reagenser (tabell 1).
Figur 1. Fotografera av automatiserad plattform för Micro-Scale Experiments cellstimulering.
Figur 2. Översikt av en representant Platform-Enabled Experiment: Transcriptional Profilering av immunceller utmanade med bakterier i mikroskala kulturer.
Figur 3. Fotografier av immunceller odlas i en Micro-skala perfusionskammare. Murina makrofager (P388D.1 cellinje) resuspenderades i tillväxtmedium vid en koncentration av 10 6 celler / ml, och 10 | il (10 4 celler) användes för att ympa en fibronektin -belagd microcapillary (perfusionskammare). Ljusfält fotografier togs med en MVX10 mikroskop (Olympus) utrustad med en CCD-kamera (Qimaging). För att mäta befolkningens storlek, celler från replikera mikroskala kulturer frigörs från ytorna perfusionskammaren använder Cell Stripper, färgades med trypanblått, och räknades med en hemacytometer och ljusmikroskop. A. B. Efter 16 h av odling (inkubation vid 37 ° C med medelstora utbyten varje 2 tim), hade befolkningen expanderat till ~ 1000 celler.
Figur 4. Transkriptionella Profiler av immunceller Odlade och stimuleras med konventionella Fartyg kontra mikroskala perfusionskammare. Murina makrofager (P388D.1 cellinje) resuspenderades i tillväxtmedium vid en koncentration av 10 6 celler / ml. För konventionella kulturer, var 50 | il (5 x 10 4 celler) användes för att ympa 150 | il tillväxtmedium i en brunn i en 96-brunnars mikrotiterplatta, ty mikroskala kulturer, 10 | j, l (10 4 celler) användes för att ympa en fibronektin-belagd microcapillary (perfusionskammare). Efter inkubation vid 37 ° C under 16 timmar, cellerna (~ 5 x 10 4 per konventionell kultur, ~ 10 3 per mikro-skala kultur) utmanades med E. coli-bakterier (pHrodo biopartiklar) vid en mångfald av infektion (MOI) av 20 (dvs 20 biopartiklar för varje cell i kulturen), negativ kontroll (mock-utmanade) kulturer fick endast färskt medium. Efter ytterligare inkubation vid 37 ° C under en eller 4 h, tvättades cellerna och lyserades med användning av reagens från Prelude Direct Lysis Module. Lysate RNA amplifierades och omvandlades till cDNA med användning av Ovation PicoSL WTA, de större (≥ 200 nt) cDNA-produkter renades med användning Agencourt RNAClean XP och dessa produkter som används som mall i TaqMan qPCR analyser för att mäta avskrift nivåer för MIP-1β (CCI4), RANTES (CCL5), COX-2 (PTGS2), och TNFa (TNF), samt GAPDH (för normalisering av cDNA-nivåer mellan lysat). Varje qPCR analys utfördes i tre exemplar, och resultaten beräknas. Each experiment självständigt replikeras tre gånger. Staplarna anger genomsnittliga faldig ökning av avskrift nivåer i konventionella odlingar (blå) eller mikro-skala kulturer (röd) utmanade med bakterier, jämfört med negativ kontroll (mock-utmanade) kulturer, felstaplarna anger standardavvikelse över de tre försöken.
| Krav | Konventionell Experiment | Micro-Scale Experiment |
| Celler | 3.000.000 | 60.000 |
| Tillväxtmedium | 2,4 ml | 0,7 ml |
| Biopartiklar | 200 | ig | 4 ^ g |
| Wash & lysisreagens | 300 il vardera | 60 il vardera |
Tabell 1. Krav för konventionell kontra Micro-Scale cellstimulering Experiments. numren dras från representativa experiment som beskrivits i denna rapport (Figur 2), i vilka murina makrofager (P388D.1 cellinje) odlades i sex konventionell (96-brunnars mikrotiterplatta) kontra mikroskala (perfusionskammare) kulturer , utmanas med E. coli-bakterier (pHrodo biopartiklar) vid ett MOI av 20 och lyseras för qPCR analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har utvecklat en enkel och mångsidig automatiserad plattform för mikro-skala cellodling och experiment stimulering. Plattformen gör det möjligt för oss att arbeta med små kulturvolymer och cellpopulationer (1 - 20 l och 100 - 2.000 celler per kammare), kultur storlekar kan minskas ytterligare genom användning av mikrokapillärer av mindre diameter. Att arbeta på dessa skalor minskar kostnaderna för rutinmässiga undersökningar och gör genomförbara studier som kräver användning av dyrbara reagens och / eller celler. Plattform-utförda experiment visar också mindre variabilitet, förmodligen beroende på precision och reproducerbarhet med vilka celler och vätskor hanteras av automatiserade plattformen.
Den nuvarande utformningen av plattformen drar celler och media från off-board reservoarer (mikrorör eller mikrotiterplattbrunnar) för sådd, jämvikt, och expansion av cellpopulationer i perfusionskammare. Detta är ett enkelt sätt att ta itu med diskrepansen mellanTillväxtmedium krav (t.ex. 700 pl konsumeras i representativt experiment som beskrivs ovan) och kapaciteten av DMF-enheten är ombord reservoarer (24 pl vardera). Dock kräver denna konfiguration mid-experiment manuellt ingripande, för att växla mellan två reservoarer (Steg 1.6) och anslut perfusionskammare till DMF-hub (Steg 3.1). Framtida konfigurationer kan inkludera stor kapacitet (t.ex. 1 ml) ombord reservoarer, vilket skulle göra det möjligt för dirigering av alla material genom DMF navet, vilket eliminerar behovet av mid-experiment manuellt ingripande.
Våra experiment krävs endast kortvarig (<24 h) odling av celler på plattformen. Vi har verifierat att cellviabiliteten på plattformen är jämförbar med den i konventionella kulturer för åtminstone 24 timmar (data ej visade). Men vi har ännu inte försökt att bibehålla kulturerna på plattformen under längre tidsperioder. Avdunstning är inte ett stort problem eftersom plattformensperfusionskammare och tillväxt reservoarer medelstora är delvis slutna system och de flytande pluggar som täcker cellerna enkelt fyllas på med medelhög utbyte. Å andra sidan, för att hålla pH i långsiktiga kulturer kan det vara nödvändigt att hysa reservoarer odlingsmedium i en 5 - 10% CO 2 atmosfär eller byta till en tillväxt medium som inte innehåller en CO 2-bikarbonat baserade pH-buffert . Dessutom skulle en långsiktig odling av aktivt delande celler expanderar befolkningar till den grad confluency (dvs. täckning av alla tillgängliga ytor inom perfusionskammaren), vilket skulle göra det nödvändigt passage av cellerna (release, tvätta, späd, och re-seed) . Andra har åstadkommit detta i mikrofluidiska regimer 3,5,6,9,17 och i sin nuvarande konfiguration plattformen ska kunna utföra alla de nödvändiga manipulationer. Sammanfattningsvis räknar vi med att med måttlig modifiering (främst protokoll, snarare än hårdvara) vår plattform bör vara capable att stödja långsiktig däggdjurscellkultur. Detta verkar särskilt lovande framtida inriktning eftersom konventionella metoder är tidskrävande och arbetsintensiva, lägga en långsiktig kultur förmåga att repertoaren av vår automatiserade plattform skulle dessutom göra det möjligt för användarna att omdirigera sitt arbete mer produktivt.
Även om vi har testat endast ett fåtal olika celltyper som hittills (t.ex. murina makrofagcellinje RAW264.7, murina benmärg makrofager (BMDM)), bör plattformen kunna rymma nästan alla anhängare celltyp. I vissa fall kan det vara nödvändigt att ändra beläggningen perfusionskammaren från fibronektin till en annan extracellulär matriskomponent (eller blandning av komponenter), eller för att ändra odlingsmediet, men dessa modifikationer enkelt kan göras. Arbete med icke-vidhäftande celltyper kan vara mer utmanande, men cell tjudra strategier har varit framgångsrika i liknande sammanhang 32-34. Det should också vara möjligt att skapa blandade kulturer består av flera celltyper, ja, bör den precision med vilken plattform hanterar celler och vätskor säkerställa att byggandet av blandade kulturer är mycket reproducerbar.
När det gäller stimuli, borde nästan alla ämnen som kan transporteras i en vattenbaserad vätska plugg vara kompatibla med vår plattform 5,13,16,35. När det gäller stora eller täta partiklar, som kan lösa ut med tiden, kan det vara nödvändigt att regelbundet resuspendera dem inom de reservoarer, i det förflutna, har vi tagit upp denna fråga genom användning av hög densitet bärarfluid 36 eller en enkel agitation systemet (data ej visade), lösningar som bör vara lätta att genomföra på vår plattform.
Hittills har vår karakterisering av celler odlade och stimuleras på plattformen främst inriktat på QRT-PCR-analys av hallmark pro-inflammatoriska reaktioner. Som ett nästa steg, omfattande analys av tHan cell befolkningens transcriptome (via DNA microarrays eller generations sekvensering (SGS) (dvs. RNA-Seq 37,38)), är väl inom räckhåll, med blygsam modifiering av cDNA preparatet steg bör vår plattform och protokoll vara fullt kapabel att stödja globala transkription profilering studier. Likaså bör analysen av svaren cellpopulation på proteinnivå (via ELISA, immunoutfällning, masspektrometri, eller mikromatriser protein) kräver endast ändring av lysatet förberedelse steg. Plattformen stödjer också imaging-baserad analys av cellsvar. Celler kan avbildas inom perfusionskammaren (t.ex. figur 3), användning av platta (snarare än rundade) mikrokapillärer för perfusionskammaren modulen skulle underlätta denna typ av analys. Dessutom kan celler avbildas på DMF navet 14,15, före sådd av perfusionskammare och / eller efter avslutad dem. Frisatta cellerna också kan avbildas av avplattformen. Hittills har vi använt ljus och fluorescensmikroskopi till bildcellerna på alla dessa stadier för att analysera deras morfologi, livskraft, tillväxt takt, och fysiska samverkan med stimuli (t.ex. biopartiklar) och varandra (data visas ej). Mikroskopi bör också möjliggöra analys av metabolit innehåll (bedömas genom användning av fluorescerande färgämnen), transkriptionsaktivitet (bedömas genom användning av reporterkonstruktioner), och nivåer protein / lokalisering (bedömas genom användning av reporterkonstruktioner, fluorescerande protein konstruktioner fusion, och / eller immunocytokemi ). Frisatta cellerna skulle kunna analyseras med användning av flödescytometri samt. Många av dessa analyser kunde utföras helt på plattformen i dess nuvarande utformning, andra skulle kräva off-plattform analys eller integration av specialiserade microfluidics-baserade moduler (t.ex. se referenser 36,39-41) i plattformen via anslutningen till DMF nav. Sammantaget verkar det troligt thatt vår plattform kommer att vara värdefullt för att möjliggöra flerdimensionell analys av små populationer av celler, som annars endast kan uppnås genom användning av mycket komplicerade och dyra robotsystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna tackar Ronald F. Renzi och Michael S. Bartsch för deras bidrag till utformning och utveckling av DMF enheter och DMF nav. Denna forskning stöds fullt ut av den Riktade Laboratory Forskning och utveckling programmet vid Sandia National Laboratories. Sandia är en multi-program laboratorium förvaltas och drivs av Sandia Corporation, ett helägt dotterbolag till Lockheed Martin Corporation, för US Department of Energy National Nuclear Security Administration under kontrakt DE-AC04-94AL85000.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Prelude Direct Lysis Module | NuGEN | 1400-24 | |
| Trypan Blue (0.4% w/v) | GIBCO | 15250-061 | |
| Cell Stripper | Cellgro | 25-056-C1 | |
| Ovation PicoSL WTA | NuGEN | 3310-048 | |
| Agencourt RNAClean XP | Beckman Coulter Genomics | A63987 | |
| pHrodo BioParticles | Invitrogen | P35361 | |
| CCL4 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443111_m1 | |
| CCL5 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm01302428_m1 | |
| PTGS2 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00478374_m1 | |
| TNF TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443258_m1 | |
| GAPDH TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm99999915_g1 | |
| Pluronic F127 | Sigma Chemical | 2594628 | |
| Fluorinert FC-40 | Sigma Chemical | 51142-49-5 | |
| Parylene C dimer | Specialty Coating Systems | 28804-46-8 | |
| Teflon-AF | DuPont | AF1600 | |
| Polyimide tape | ULINE | S-11928 | |
| Indium tin oxide (ITO) coated glass substrates | Delta Technologies | CB-40IN-1107 | |
| DMF hub Teflon-coated fused-silica microcapillaries | Polymicro Technologies | TSU100375 | |
| Perfusion chamber microcapillaries | Polymicro Technologies | TSP530700 | |
| Tubing and microcapillary fittings | Sandia National Laboratories | ||
| Polycarbonate tubing | Paradigm Optics | CTPC100-500-5 | |
| 8-port precision syringe pump equipped with 30 mm (500 μl capacity) syringes | Hamilton Company | 54848-01 | |
| Parylene-C vapor deposition instrument | Specialty Coating Systems | PDS 2010 Labcoter 2 | |
| High-voltage function generator | Trek | 615A-1 615-3 | |
| MVX10 microscope | Olympus | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) | |
| QIClick digital CCD camera | QImaging | QIClick-F-CLR-12 | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) |
References
- Young, E. W. K., Beebe, D. J. Fundamentals of microfluidic cell culture in controlled microenvironments. Chemical Society Reviews. 39, 1036-1048 (2010).
- Yeo, L. Y., Chang, H. C., Chan, P. P. Y., Friend, J. R.
- Zhang, B., Kim, M. C., Thorsen, T., Wang, Z. A self-contained microfluidic cell culture system. Biomedical Microdevices. 11, 1233-1237 (2009).
- Skafte-Pedersen, P., et al. A self-contained, programmable microfluidic cell culture system with real-time microscopy access. Biomedical Microdevices. 14, 385-399 (2012).
- Barbulovic-Nad, I., Au, S. H., Wheeler, A. R. A microfluidic platform for complete mammalian cell culture. Lab Chip. 10, 1536-1542 (2010).
- Zhou, Y., Pang, Y., Huang, Y. Openly Accessible Microfluidic Liquid Handlers for Automated High-Throughput Nanoliter Cell Culture. Analytical Chemistry. 84, 2576-2584 (2012).
- Wang, H. Y., Bao, N., Lu, C. A microfluidic cell array with individually addressable culture chambers. Biosensors and Bioelectronics. 24, 613-617 (2008).
- Cimetta, E., Cagnin, S., Volpatti, A., Lanfranchi, G., Elvassore, N. Dynamic culture of droplet-confined cell arrays. Biotechnology Progress. 26, 220-231 (2010).
- Hung, P. J., Lee, P. J., Sabounchi, P., Lin, R., Lee, L. P. Continuous perfusion microfluidic cell culture array for high-throughput cell-based assays. Biotechnology and Bioengineering. 89, 1-8 (2005).
- King, K. R., et al. A high-throughput microfluidic real-time gene expression living cell array. Lab on a Chip. 7, 77-85 (2007).
- Gómez-Sjöberg, R., Leyrat, A. A., Pirone, D. M., Chen, C. S., Quake, S. R. Versatile, fully automated, microfluidic cell culture system. Analytical Chemistry. 79, 8557-8563 (2007).
- Wheeler, A. R. Chemistry - Putting electrowetting to work. Science. 322, 539-540 (2008).
- Gong, J., Kim, C. J. All-electronic droplet generation on-chip with real-time feedback control for EWOD digital microfluidics. Lab Chip. 8, 898-906 (2008).
- Choi, K., et al. Integration of field effect transistor-based biosensors with a digital microfluidic device for a lab-on-a-chip application. Lab Chip. 12, 1533-1536 (2012).
- Barbulovic-Nad, I., Yang, H., Park, P. S., Wheeler, A. R. Digital microfluidics for cell-based assays. Lab Chip. 8, 519-526 (2008).
- Gentilucci, L., de Marco, R., Cerisoli, L. Chemical modifications designed to improve peptide stability: incorporation of non-natural amino acids, pseudo-peptide. 16, 3185-3203 (2010).
- Miller, E. M., Wheeler, A. R. A digital microfluidic approach to homogeneous enzyme assays. Anal. Chem. 80, 1614-1619 (2008).
- Jebrail, M. J., Bartsch, M. S., Patel, K. D. Digital microfluidics: a versatile tool for applications in chemistry, biology. 12, 2452-2463 (2012).
- Ng, A. H. C., Choi, K., Luoma, R. P., Robinson, J. M., Wheeler, A. R. Digital Microfluidic Magnetic Separation for Particle-Based Immunoassays. Analytical Chemistry. 84, 8805-8812 (2012).
- Sista, R. S., et al. Heterogeneous immunoassays using magnetic beads on a digital microfluidic platform. Lab Chip. 8, 2188-2196 (2008).
- Malic, L., Veres, T., Tabrizian, M. Biochip functionalization using electrowetting-on-dielectric digital microfluidics for surface plasmon resonance imaging detection of DNA hybridization. Biosens. Bioelectron. 24, 2218-2224 (2009).
- Malic, L., Veres, T., Tabrizian, M. Nanostructured digital microfluidics for enhanced surface plasmon resonance imaging. Biosens. Bioelectron. 26, 2053-2059 (2011).
- Jebrail, M. J., Wheeler, A. R. Digital microfluidic method for protein extraction by precipitation. Anal. Chem. 81, 330-335 (2009).
- Nelson, W. C., et al. Incubated protein reduction and digestion on an electrowetting-on-dielectric digital microfluidic chip for MALDI-MS. Anal. Chem. 82, 9932-9937 (2010).
- Mousa, N. A., et al. Droplet-scale estrogen assays in breast tissue, blood, and serum. Sci. Transl. Med. 1, 1ra2 (2009).
- Jebrail, M. J., et al. A digital microfluidic method for dried blood spot analysis. Lab Chip. 11, 3218-3224 (2011).
- Choi, K., Ng, A. H. C., Fobel, R., Wheeler, A. R.
- Jebrail, M. J., et al. Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing. J. Vis. Exp. (33), e1603 (2009).
- Thaitrong, N., et al. Quality Control of Next Generation Sequencing Library through an Integrative Digital Microfluidic Platform. , Submitted (2012).
- Shin, Y. J., Lee, J. B. Machine vision for digital microfluidics. Review of Scientific Instruments. 81, (2010).
- Thornton, M., Eward, K. L., Helmstetter, C. E. Production of minimally disturbed synchronous cultures of hematopoietic cells. BioTechniques. 32, 1098-1105 (2002).
- Huang, X., Dai, W., Darzynkiewicz, Z. Enforced adhesion of hematopoietic cells to culture dish induces endomitosis and polyploidy. Cell Cycle. 4, 801-805 (2005).
- Raje, M., et al. Charged nylon membrane substrate for convenient and versatile high resolution microscopic analysis of Escherichia coli & mammalian cells in suspension culture. Cytotechnology. 51, 111-117 (2006).
- Chatterjee, D., Hetayothin, B., Wheeler, A. R., King, D. J., Garrell, R. L. Droplet-based microfluidics with nonaqueous solvents and solutions. Lab Chip. 6, 199-206 (2006).
- Perroud, T. D., et al. Microfluidic-based cell sorting of Francisella tularensis infected macrophages using optical forces. Analytical Chemistry. 80, 6365-6372 (2008).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10, 57-63 (2009).
- Malone, J. H., Oliver, B. Microarrays, deep sequencing and the true measure of the transcriptome. BMC Biology. 9, (2011).
- Wu, M., et al. Microfluidically-unified cell culture, sample preparation, imaging and flow cytometry for measurement of cell signaling pathways with single cell resolution. Lab on a Chip. 12, 2823-2831 (2012).
- Srivastava, N., et al. Fully integrated microfluidic platform enabling automated phosphoprofiling of macrophage response. Analytical Chemistry. 81, 3261-3269 (2009).
- Herr, A. E., et al. Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 5268-5273 (2007).
