Summary
We hebben een geautomatiseerde celkweek en verhoor platform ontwikkeld voor micro-schaal cel stimulatie experimenten. Het platform biedt eenvoudige, veelzijdige en precieze controle in het cultiveren en stimuleren van kleine populaties van cellen en het terugwinnen van lysaten voor moleculaire analyses. Het platform is geschikt voor studies die kostbare cellen en / of reagentia.
Abstract
Studie van cellen in kweek (in vitro analyse) heeft verstrekt belangrijk inzicht in complexe biologische systemen. Gebruikelijke werkwijzen en apparatuur voor in vitro analyses zijn zeer geschikt voor onderzoek van grote aantallen cellen (≥ 10 5) in milliliter volumes schaal (≥ 0,1 ml). Er zijn vele gevallen waarin het nodig of wenselijk om de schaal van cultuur maat om het verbruik van de cellen van belang en / of reagentia die nodig zijn voor hun cultuur, stimulatie of verwerking te verminderen. Helaas, conventionele benaderingen ondersteunen geen nauwkeurige en reproduceerbare manipulatie van micro-schaal culturen, en de microfluidics-based geautomatiseerde systemen die momenteel beschikbaar zijn te complex en gespecialiseerd voor routinematig gebruik door de meeste laboratoria. Om dit probleem aan te pakken, hebben we een eenvoudige en veelzijdige technologieplatform ontwikkeld voor het geautomatiseerd cultuur, stimulatie, en het herstel van kleine populaties van cellen (100 - 2000 cellen) in micro-schaal volumes (1-20 pi). Het platform omvat een set van fibronectine gecoate microcapillairen ("cell perfusiekamers"), waarin micro-schaal kweken opstellen, handhaven en gestimuleerd, een digitale microfluidics (DMF) apparaat uitgerust met een "overdracht" microcapillairen ("central hub "), welke routes cellen en reagentia en naar de perfusiekamers, een hoge precisie spuitpomp, welke bevoegdheden transport van materialen tussen de perfusiekamers en de centrale naaf, en een elektronische schakeling die de controle over vervoer van materiaal bepaalt welke gecoördineerd en geautomatiseerd via vooraf bepaalde scripts. Als voorbeeld gebruikten we het platform om het onderzoek transcriptionele respons uitgelokt in immune cellen na challenge met bacteriën vergemakkelijken. Gebruik van het platform konden we het verbruik van cellen en reagentia te verminderen, te minimaliseren experiment-to-experiment variabiliteit, en re-direct hands-on arbeid. Gezien de voordelen die het verleent, alsook de toegankelijkheid en veelzijdigheid, our platform moet gebruik vinden in diverse laboratoria en toepassingen en vooral nuttig zijn bij het vergemakkelijken analyse van cellen en stimuli die slechts in beperkte hoeveelheden.
Introduction
De studie van cellen in kweek (in vitro analyse) heeft verstrekt waardevol inzicht in de fundamentele principes en moleculaire mechanismen die complexe biologische systemen en de volksgezondheid. De conventionele methoden voor cultuur, stimulatie, en het verzamelen van cellen voor analyse, die petrischaaltjes en microtiterplaten benutten, zijn ontworpen voor onderzoek van grote populaties van cellen (≥ 10 5) in milliliter-schaal cultuur volumes (≥ 0,1 ml). Er zijn echter veel gevallen waarin slechts beperkte hoeveelheden cellen beschikbaar zijn (primaire cellen) of kleine populaties van cellen gewenst (bijv. cel-cel variabiliteit te verminderen in de populatie) of vereiste reagentia moeilijk te verkrijgen zijn of onbetaalbaar (bijv. gezuiverd cel-uitgescheiden factoren). Dergelijke kwesties met succes kan worden aangepakt door schaalverkleining cultuur grootte, die het extra voordeel van het verminderen van het verbruik van alle heeftbenodigde reagentia in vitro analyse 1,2. Helaas, conventionele apparatuur en methoden niet ondersteunen nauwkeurige en reproduceerbare manipulatie van micro-schaal culturen en de microfluidics-based geautomatiseerde systemen die momenteel beschikbaar 3-11 zijn te complex en gespecialiseerd voor routinematig gebruik door de meeste laboratoria.
In dit rapport beschrijven we de montage en het gebruik van een eenvoudige en veelzijdige technologie platform voor geautomatiseerde cultuur, stimulatie, en het herstel van kleine populaties van cellen (100 - 2000 cellen) in micro-schaal volumes (1-20 pi). Het platform architectuur (figuur 1) is modulair opgebouwd: een set van fibronectine gecoate microcapillairen ("cell perfusiekamers" module) fungeert als de plaats voor vestiging, de handhaving en stimulering van micro-schaal culturen, en een digitale microfluidics (DMF ) 12,13 apparaat uitgerust met een "transfer" microcapillairen ("centrale hub" module) 14,15 routes cellenen reagentia en naar de perfusiekamers. DMF kan de gebruiker individueel meerdere druppels tegelijk te pakken en de manipulaties (dwz herconfigureren monster verwerking treinen) te wijzigen of opnieuw te bestellen zonder de hardware-apparaat. Haar enorme flexibiliteit is duidelijk in zijn recente opkomst als een belangrijke technologie in een brede waaier van toepassingen, met inbegrip van celkweek 16,17, enzymassays 18,19, immunoassays 20,21, DNA-analyse 22,23, eiwit verwerking, 24,25 en klinisch monster verwerking. 26,27 Onze centrale hub maakt gebruik van de flexibiliteit die inherent zijn aan DMF apparaten, en verder verbetert het door de toevoeging van microcapillaire interfaces, die gelegenheid voor het uitvoeren van een subset van de manipulaties (bijvoorbeeld celkweek) in gespecialiseerde perifere biedt modules en niet op het apparaat zelf DMF. Compartimentering van de verwerking treinen op deze manier vereenvoudigt ook het ontwerp van de plaTForm architectuur (niet nodig om een DMF apparaat dat kan uitvoeren van alle processtappen te bouwen) en faciliteert de ontwikkeling daarvan als nieuwe functies zijn nodig (gewoon nieuwe perifere modules als nodig te integreren). Vervoer van cellen en reagentia in de centrale naaf wordt door electrowetting krachten opgewekt door sequentiële activering van elektroden in het apparaat DMF 13,28, transport naar, van en binnen de perfusiekamers wordt aangedreven door drukveranderingen opgewekt door een zeer nauwkeurige spuit pomp. Al deze vloeiende bewegingen worden via een eenvoudige elektronische interface en geautomatiseerd door het gebruik van vooraf bepaalde scripts.
Als representatief voorbeeld demonstreren we het gebruik van het platform voor de studie van transcriptionele respons uitgelokt in immune cellen na challenge met bacteriën (Figuur 2). Het uitvoeren van deze experimenten op het platform konden wij werken met kleine aantallen cellen (~ 1000 per experimenteletal conditie), het minimaliseren van experiment-to-experiment variabiliteit, behouden reagentia, en re-direct hands-on arbeid. Gezien de voordelen die het verleent, alsook de toegankelijkheid en veelzijdigheid, moet dit platform toepassing vinden in diverse laboratoria en toepassingen en vooral nuttig zijn bij het vergemakkelijken analyse van cellen en stimuli die slechts in beperkte hoeveelheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze algemene protocol is ontworpen om de toepassing van het platform ondersteunen vele verschillende studies, specifieke aspecten van de representatief onderzoek in dit rapport beschreven worden afgescheiden haakjes Figuur 2 illustreert een representatief onderzoek uitgevoerd met het protocol.. Merk op dat in het protocol, alle "instrueren" opdrachten worden geautomatiseerd door het gebruik van vooraf bepaalde scripts. Merk ook op dat stap 2 in parallel met stap 1 (bijv. bij stap 1.7 en 1.8) kan worden uitgevoerd, en dat stap 2.1 vaak overbrugd (omdat patroon / DMF beklede inrichting platen worden gewassen en opnieuw gebruikt, zie stap 5.2) .
1. Assembleren en Bevolk de Cel perfusiekamers
- Smeer de binnenzijde van gesteriliseerd (autoclaaf) microcapillairen (fused-silica, 679 urn od, 534 urn id, 15 cm lang) met fibronectine, door instrueren de spuitpomp een steriele fibronectine-oplossing (30 pl van 50 ug / ml) trekken in elkmicrocapillaire, incuberen (37 ° C gedurende 2 uur), instrueren de spuitpomp de oplossing opnieuw, en laten de microcapillairen droging (kamertemperatuur (KT) gedurende 6 uur).
- Sluit elke fibronectine gecoate microcapillaire (perfusie kamer) naar polycarbonaat buis (500 pm od, 100 um id) en de slang aan op de multi-poort spuitpomp, met CapTite hulpstukken (6 perfusiekamers, 8-port injectiepomp).
- Met behulp van tape, beveiligen het lichaam van elke perfusie kamer een ingesteld op gewenste temperatuur warmte-blok (37 ° C).
- Dompel de open einden van de perfusiekamers in een reservoir (microcentifuge buis of microtiter putje) bevattende cellen (P388D.1 murine macrofagen) gesuspendeerd in vers kweekmedium (RPMI-1640, 10% FBS, 500 eenheden / ml penicilline, 500 ug / ml streptomycine) en gewenste concentratie (10 6 cellen / ml).
- Instrueer de injectiepomp aan cellen (10 pl, 10 4 cellen) te trekken in elk perfusiekamer gevolgd door genoeg air aan de vloeibare plug (~ 4,5 cm) te verplaatsen naar het deel bevestigd aan de hitte blok.
- Laat de cellen hechten aan de met fibronectine beklede binnenzijde van de perfusiekamers (37 ° C gedurende 1-2 uur). Intussen dragen de open einden van de perfusiekamers uit de cellen reservoir in nieuw reservoir met vers groeimedium.
- Na de hechting periode, instrueren de spuit pomp om de vloeistof pluggen (geconditioneerde media en losse cellen) te sturen naar afval, trekken vers medium (10 pl), en volg met genoeg lucht om de nieuwe vloeistof stekkers (vers medium) te positioneren over de aangehouden cellen.
- Blijven uitvoeren medium beurzen (dwz herhaal stap 1.7) met regelmatige tussenpozen (elke 2 uur) totdat de celpopulaties voldoende evenwicht gebracht en uitgebreid (16-24 uur van micro-schaal cultuur gegenereerd populaties van ~ 1000 cellen / kamer).
2. Fabriceren de DMF Device en Monteer de Hub Architecture
- Met metalen compressie frames, bevestig de DMF platen in een polymeer gegoten 14,30 uitsparingen die een 400 urn afstand tussen de platen te behouden, deze afstand in combinatie met de bediening grootte van de elektrode (2,5 mm2), de druppel volume (2,5 pl per elektrode). Merk op dat DMF samenstel kan worden bereikt door eenvoudige middelen 24.
- Insert Teflon beklede overdracht microcapillairen (360 urn od, 100 urn id, 3,5-4,0 cm lang) in de ruimte tussen de platen DMF, positioneren elk uitstrekken naar de rand van het verwante bediening elektrode.
- Naar de tegenovergestelde nld van elke overdracht microcapillaire aanbrengen van een CapTite fitting.
- Schakel de elektrische aansluitingen aan de voedingsspanning aan de ITO elektroden. Elektrode activeringssequenties worden geautomatiseerd door het gebruik van een computer-gestuurde elektronische interface actief voorafbepaalde scripts.
- Optioneel: Verplaats de geassembleerde DMF naaf op de translationele fase van een microscoop (SZ-6145TR (Olympus, Japan)) voorzien van een charge-coupled device (CCD) camera (DCR-HC96 (Sony, Japan)) te vergemakkelijken het volgen van druppels . 31
3. Sluit de perfusiekamers aan de DMF Hub en Stimuleren van de celpopulaties
- Verwijder de open einden van de perfusiekamers uit het medium reservoir (zie stap 1.6) en plaats ze in de CapTite inrichting aangebracht op de uiteinden van de overdracht van de microcapillairen DMF naaf (zie Stap 2.4).
- Instrueer de spuit pomp om de vloeistof pluggen (geconditioneerde media) in de perfusiekamers om afval te sturen.
- Instruct de DMF-hub om stimulus te tekenen (E. coli BioParticles bij 100 ug / ml in vers medium met 0,1% Pluronic F127 w / v) van een on-board reservoir en leveren een druppel van de juiste grootte (10 pl) aan elke overdracht microcapillaire . De aan boord reservoirs bestaan uit cilindervormige compartimenten (1.5 x 1.5 cm elk) en via slangen verbonden met de hub DMF.
- Instrueer de injectiepomp te stellen de stimulus wordt aangesloten op de overdracht microcapillairen, en volg met genoeg lucht om de stekkers te positioneren over de celpopulaties in de perfusiekamers.
- Incubeer de cellen met stimulus (37 ° C gedurende 1-4 uur). Optioneel: Exchange voor verse stimulus (dwz herhaal dan de stappen 3,2-3,4) op regelmatige tijdstippen.
4. Beëindigen Stimulatie en Recover cellysaten voor Analysis
- Optioneel: Als een post-stimulatie periode nodig is, wisselen de stimulus-bevattende vloeistof stekkers voor vers medium (dwz Herhaal stap 3,2-3.4, Vervangen vers medium voor stimulus), en blijven broeden en uit te wisselen als dat nodig is.
- Exchange de vloeistof pluggen in de perfusiekamers voor wasbuffer (Prelude Direct Lysis Buffer Module B) (of herhaal stappen 3,2-3,4, vervangen wasbuffer voor stimulus) en incubeer indien nodig (5 min).
- Exchange de vloeistof pluggen (wasbuffer) voor lysis oplossing (Prelude Direct Lysis Buffer Module A met 0,1% Pluronic F127 w / v) (dwz herhaal stappen 3,2-3,4, vervangen lysis oplossing stimulus) en incubeer indien nodig (5 min) .
- Vraag de spuitpomp de vloeistof pluggen (cellysaten) naar de naaf DMF.
- Demonteer de DMF-hub, verwijder de bovenplaat van de DMF-apparaat (met behulp van zorg niet aan de plaat zijwaarts kantelen, want dit kan resulteren in een druppeltje mengen), en het verzamelen van de lysaten met een Pipetman of spuit voor off-platform analyse (genexpressieprofilering via qPCR).
5. Schoon Platform Hardware voorHergebruik
- Dompel de overdracht microcapillairen en CapTite armaturen in 10% bleekwater (v / v in water) gedurende 10 min bij RT, goed spoelen met gedemineraliseerd water, en droog met behulp van stikstofgas.
- Dompel het DMF inrichting platen in 10% bleekmiddel gedurende 10 min bij kamertemperatuur, spoelen met isopropanol gevolgd door gedeïoniseerd water en droog met stikstofgas gevolgd door bakken bij 160 ° C gedurende 10 minuten.
- De spuitpomp is polycarbonaat buizen, en DMF apparaat polymeer gegoten en compressie frame kunnen worden hergebruikt zonder reiniging. De perfusie kamer microcapillairen worden na elk experiment weggegooid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Als een demonstratie van de geautomatiseerde platform, we gebruikten het voor het uitvoeren van een studie waarin kleine populaties van immuuncellen werden gekweekt in micro-schaal culturen, uitgedaagd met bacteriën, en gelyseerd voor off-platform analyse van pro-inflammatoire reacties (figuur 2 ).
Elk van zes cel perfusiekamers werd geënt met 10 4 immuuncellen (P388D.1 murine macrofagen) geresuspendeerd in 10 pl groeimedium. Na een periode hechting (37 ° C gedurende 2 uur) en een medium uitwisseling, ~ 500 cellen bleven aan de binnenzijde van elke kamer (figuur 3A), gemeten door analyse van herhaalde microschaal kweken (cellen vrijkomt door chelerend behandeling en geteld via hemacytometer en lichtmicroscopie). Verdere incubatie bij 37 ° C gedurende 16 uur met medium uitwisselingen op 2 uur intervallen, breidde de celpopulaties ~ 1000 cellen per kamer (figuur 3B) (gemeten thgrove analyse van herhaalde microschaal culturen zoals hierboven beschreven). In vier van de zes perfusiekamers werden de celpopulaties uitgedaagd met E. coli (pHrodo BioParticles), geresuspendeerd in groeimedium en afgeleverd bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 20 (dat wil zeggen elke cel in de populatie werd uitgedaagd met 20 BioParticles, gemiddeld). In de resterende twee kamers, ontving de celpopulaties een mock uitdaging (de groei enige medium). Na incubatie bij 37 ° C gedurende 1 uur (twee bacterie-uitgedaagd kweken) of 4 uur (twee bacteriën beperking, en twee mock beperking, kweken), werden de cellen gewassen en gelyseerd, en de lysaten teruggewonnen uit het DMF hub. Conventionele bench-scale methoden werden gebruikt voor het bereiden cDNA uit de lysaten, en transcript te meten voor ontstekingsmediatoren: Chemokinen MIP-1β (CCL4) en RANTES (CCL5), induceerbare cyclo COX-2 (PTGS2), en cytokine TNF (TNF ).
Figuur 4 vat de resultaten van drie onafhankelijke experimenten herhaald. We vonden dat immuuncellen gegroeid en uitgedaagd in micro-schaal culturen (rode balken) gemonteerde pro-inflammatoire transcriptie reacties die in wezen identiek zijn aan deze die in cellen gekweekt en uitgedaagd in conventionele culturen (blauwe staven) waren. Bovendien is het op het platform (micro-schaal) experimenten toonden minder variabiliteit (zoals aangegeven door kleinere foutbalken) en verbruikt kleinere hoeveelheid cellen en reagentia (tabel 1).
Figuur 1. Foto van Automated Platform voor Micro-Scale cel stimulatie Experiments.
Figuur 2. Overzicht van een vertegenwoordiger van Platform-Enabled Experiment: Transcriptioneel Profilering van immuuncellen Uitgedaagd met Bacteriën in Micro-Scale Culturen.
Figuur 3. Foto van gekweekte immuuncellen in een micro-schaal Perfusie kamer. Muriene macrofagen (P388D.1 cellijn) werden geresuspendeerd in groeimedium bij een concentratie van 10 6 cellen / ml en 10 pi (10 4 cellen) gebruikt om zaad een fibronectine gecoate microcapillaire (perfusie kamer). Bright-field foto's werden genomen met behulp van een MVX10 microscoop (Olympus) uitgerust met een CCD-camera (Qimaging). Naar grootte van de populatie te meten, werden cellen van repliceren micro-schaal culturen vrijgelaten uit de perfusie kamer oppervlakken met Cell Stripper, gekleurd met behulp trypaanblauw en geteld met behulp van een hemacytometer en lichtmicroscoop. A. B. Na 16 uur cultuur (incubatie bij 37 ° C met uitwisselingen medium elke 2 uur) was de populatie uitgebreid tot ~ 1000 cellen.
Figuur 4. Transcriptionele profielen van gekweekte immuuncellen en gestimuleerd in conventionele Schepen versus Micro-schaal Perfusie Chambers. Muriene macrofagen (P388D.1 cellijn) werden geresuspendeerd in groeimedium bij een concentratie van 10 6 cellen / ml. Voor conventionele kweken werden 50 gl (5 x 10 4 cellen) gebruikt om zaad 150 pi groeimedium in een putje van een 96-well microtiterplaat, voor microsystemen cultures, 10 pl (10 4 cellen) werden gebruikt om zaad een fibronectine beklede microcapillary (perfusie kamer). Na incubatie bij 37 ° C gedurende 16 uur werden de cellen (5 x 10 ~ 4 per conventionele kweek, 10 ~ 3 per micro-schaal kweek) geprovoceerd met E. coli (pHrodo BioParticles) bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 20 (dat wil zeggen, 20 BioParticles voor elke cel in de kweek), negatieve controle (mock-uitgedaagd) cultures kreeg alleen vers medium. Na verdere incubatie bij 37 ° C gedurende 1 of 4 uur werden de cellen gewassen en gelyseerd met reagentia van het Prelude Direct Lysis Module. Lysate RNA werd versterkt en omgezet naar cDNA met Ovation PicoSL WTA, de grotere (≥ 200 nt) cDNA producten gezuiverd met behulp van Agencourt RNAClean XP, en deze producten gebruikt als template in TaqMan qPCR assays om transcript te meten voor MIP-1β (CCL4), RANTES (CCL5), COX-2 (PTGS2) en TNFa (TNF), en GAPDH (voor normalisatie van cDNA niveaus tussen lysaten). Elk qPCR assay werd in drievoud uitgevoerd en de resultaten gemiddeld. Each experiment werd driemaal herhaald onafhankelijk. Balken geven de gemiddelde voudige toename transcript niveaus in gebruikelijke kweken (blauw) of micro-schaal kweken (rood) uitgedaagd met bacteriën, in vergelijking met de negatieve controle (mock-uitgedaagd) culturen error bars geven de standaarddeviatie in de drie experimenten.
| Eis | Conventionele Experiment | Micro-Scale Experiment |
| Cellen | 3000000 | 60000 |
| Growth Medium | 2.4 ml | 0,7 ml |
| BioParticles | 200 ug | 4 ug |
| Wash & Lysis reagentia | 300 pl elk | 60 pi elk |
Tabel 1. Eisen voor Conventionele versus Micro-Scale cel stimulatie Experiments. Numbers zijn afkomstig uit de representatieve experiment in dit rapport beschreven (figuur 2), waarbij muizen macrofagen (P388D.1 cellijn) werden gekweekt in zes conventionele (96-well microtiterplaat) versus micro-schaal (perfusie kamer) culturen , uitgedaagd met E. coli bacteriën (pHrodo BioParticles) bij een MOI van 20, en gelyseerd voor qPCR analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hebben een eenvoudige en veelzijdige geautomatiseerd platform voor micro-schaal celcultuur en stimulatie experimenten ontwikkeld. Het platform stelt ons in staat om te werken met kleine volumes cultuur en celpopulaties (1 - 20 pl en 100 - 2000 cellen, per kamer); cultuur maten kan verder worden verminderd door gebruik te maken van microcapillairen van kleinere diameter. Werken bij deze schalen reduceert de routine studies en maakt mogelijk studies dat het gebruik van kostbare reagentia en / of cellen vereisen. Platform uitgevoerde experimenten geven ook minder variabiliteit, waarschijnlijk door de nauwkeurigheid en de reproduceerbaarheid waarmee cellen en vloeistoffen worden behandeld door het automatische platform.
De huidige configuratie van het platform trekt cellen en media van off-board reservoirs (microcentrifugebuisjes of microtiterplaatputjes) voor het zaaien, evenwicht, en uitbreiding van celpopulaties in de perfusiekamers. Dit is een eenvoudige manier om de mismatch tussen de pakkengroeimedium voorschriften (bijv. 700 ui verbruikt in de representatieve experiment hierboven beschreven) en de capaciteit van de inrichting is in DMF boord reservoirs (24 pi elk). Echter, deze configuratie noodzakelijk mid-experiment handmatig ingrijpen, om te schakelen tussen twee reservoirs (Stap 1.6) en sluit de perfusiekamers aan de DMF-hub (Stap 3.1). Toekomstige configuraties kunnen zijn grote capaciteit (bijv. 1 ml) on-board reservoirs, die in staat zou stellen routering van alle materialen door de DMF-hub, zodat er geen noodzaak voor mid-experiment handmatige interventie.
Onze experimenten vereist alleen op korte termijn (<24 uur) cultuur van cellen op het platform. We hebben vastgesteld dat cellevensvatbaarheid op het platform is vergelijkbaar met die in gebruikelijke kweken tenminste 24 uur (gegevens niet getoond). Echter, er is nog getracht kweken op het platform blijven voor langere tijd. Verdamping geen groot probleem, omdat het platformperfusiekamers en groeimedium reservoirs zijn gedeeltelijk gesloten systemen en de vloeistof pluggen die de cellen zijn gemakkelijk bijgevuld via medium wisselen. Anderzijds wordt de pH op lange termijn kweken handhaven moet het groeimedium reservoirs huis in een 5 mm bedraagt - 10% CO2 atmosfeer of schakel naar een groeimedium dat geen een CO 2-bicarbonaat gebaseerde pH buffer . Daarnaast zou op lange termijn de cultuur van actief delende cellen populatie uit te breiden naar het punt van confluentie (dwz dekking van alle beschikbare oppervlakken binnen de perfusie kamer), die noodzakelijk zou passage van de cellen (release, wassen, verdunnen, en re-zaad) . Anderen hebben dit bereikt in microfluïdische regimes 3,5,6,9,17 en in zijn huidige configuratie van het platform moet in staat zijn om alle van de vereiste manipulaties. Samengevat, verwachten we dat met een bescheiden wijziging (voornamelijk aan protocollen, in plaats van hardware) ons platform moeten worden capable van de ondersteuning op lange termijn zoogdiercelkweek. Dit zou een bijzonder veelbelovende toekomstige richting lijken omdat de conventionele methoden zijn tijdrovend en arbeidsintensief, het toevoegen van een langdurige cultuur mogelijkheid om het repertoire van onze geautomatiseerde platform zou verder in staat zijn gebruikers opnieuw te richten hun arbeid productiever.
Hoewel we slechts een paar verschillende celtypen tot nu toe (bv. muizen macrofaagcellijn RAW264.7; muizen beenmerg afgeleide macrofagen (BMDM)) hebben getest, moet het platform in staat om vrijwel alle aanhangend celtype tegemoet. In sommige gevallen kan het noodzakelijk zijn de perfusie kamer coating verandert van fibronectine aan andere extracellulaire matrixcomponent (of mengsel van bestanddelen), of het groeimedium veranderen, maar deze veranderingen zijn gemakkelijk gemaakt. Werken met niet-klevende celtypes zou kunnen zijn meer uitdagend, maar cel tethering strategieën zijn succesvol geweest in vergelijkbare contexten 32-34. Het shoULD ook mogelijk om gemengde kweken uit meerdere celtypen maken, ja, moet de precisie waarmee het platform handgrepen cellen en vloeistoffen zorgen dat de bouw van gemengde culturen zeer reproduceerbaar.
Met betrekking tot de stimuli, moet vrijwel elke stof die in een waterige vloeistof plug kan worden vervoerd compatibel is met onze platform 5,13,16,35 zijn. Bij grote en dichte deeltjes kan verwijderd regelen tijd, kan het noodzakelijk zijn ze periodiek resuspenderen in de reservoirs, in het verleden, hebben we dit probleem aangepakt door het gebruik van high-density dragervloeistof 36 of eenvoudige agitatie systeem (gegevens niet getoond), oplossingen die eenvoudig te implementeren op ons platform moet worden.
Tot nu toe heeft onze karakterisering van cellen gekweekt en gestimuleerd op het platform vooral gericht op qRT-PCR analyse van kenmerkende pro-inflammatoire responsen. Als volgende stap, uitgebreide analyse van tHij transcriptome celpopulatie's (via DNA microarrays of Generation Sequencing (SGS) (dwz RNA-Seq 37,38)), is goed binnen bereik; met een bescheiden aanpassing van de cDNA voorbereiding stap, moet ons platform en protocollen volledig in staat de ondersteuning wereldwijde zijn transcriptionele profilering studies. Evenzo moet de analyse van celpopulatie responsen op eiwitniveau (via ELISA, immunoprecipitatie, massaspectrometrie, of eiwit microarrays) enige wijziging van het lysaat bereidingsstappen vereisen. Het platform ondersteunt ook imaging-gebaseerde analyse van cel responsen. Cellen kunnen worden afgebeeld in de perfusiekamer (bijvoorbeeld figuur 3) gebruik van vaste-oppervlak (in plaats van afgerond) microcapillairen de perfusie kamer module zou dit type analyse te vergemakkelijken. Daarnaast kunnen cellen worden afgebeeld op de naaf DMF 14,15 vóór het zaaien van de perfusiekamers en / of na het verlaten van hen. Vrijgegeven cellen kan ook worden afgebeeld off vanhet platform. Tot nu toe hebben we gebruikte licht en fluorescentie microscopie afbeeldingscellen op al deze stadia om hun morfologie, levensvatbaarheid, proliferatiesnelheid en fysische interacties analyseren stimuli (bijv. BioParticles) en met elkaar (data niet getoond). Microscopie moet de analyse van het metaboliet inhoud JavaScript (bepaald door het gebruik van fluorescerende kleurstoffen), transcriptionele activiteit (bepaald door het gebruik van reporter constructen) en eiwitniveaus / lokalisatie (bepaald door het gebruik van reporter constructen, fluorescent eiwit fusie constructen en / of immunocytochemie ). Vrijgegeven cellen kunnen worden geanalyseerd met flowcytometrie ook. Veel van deze analyses kan volledig worden uitgevoerd op het platform in de huidige configuratie andere off-platformanalyses of integratie van gespecialiseerde microfluidics-based modules vereisen (zie bijvoorbeeld referenties 36,39-41) in het platform via een koppeling met DMF hub. Samengevat lijkt het waarschijnlijk thoed ons platform zal waardevol blijken in staat te stellen multi-dimensionale analyse van kleine populaties van cellen, die anders alleen kan worden bereikt door het gebruik van zeer complexe en dure robotsystemen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Ronald F. Renzi en Michael S. Bartsch voor hun bijdrage aan het ontwerp en de ontwikkeling van DMF apparaten en de DMF-hub. Dit onderzoek werd volledig ondersteund door het Laboratorium Geregisseerd Research en Development programma bij Sandia National Laboratories. Sandia is een multi-programma laboratorium beheerd en geëxploiteerd door Sandia Corporation, een volledige dochteronderneming van Lockheed Martin Corporation, voor de US Department of Energy's National Nuclear Security Administration onder contract DE-AC04-94AL85000.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Prelude Direct Lysis Module | NuGEN | 1400-24 | |
| Trypan Blue (0.4% w/v) | GIBCO | 15250-061 | |
| Cell Stripper | Cellgro | 25-056-C1 | |
| Ovation PicoSL WTA | NuGEN | 3310-048 | |
| Agencourt RNAClean XP | Beckman Coulter Genomics | A63987 | |
| pHrodo BioParticles | Invitrogen | P35361 | |
| CCL4 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443111_m1 | |
| CCL5 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm01302428_m1 | |
| PTGS2 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00478374_m1 | |
| TNF TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443258_m1 | |
| GAPDH TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm99999915_g1 | |
| Pluronic F127 | Sigma Chemical | 2594628 | |
| Fluorinert FC-40 | Sigma Chemical | 51142-49-5 | |
| Parylene C dimer | Specialty Coating Systems | 28804-46-8 | |
| Teflon-AF | DuPont | AF1600 | |
| Polyimide tape | ULINE | S-11928 | |
| Indium tin oxide (ITO) coated glass substrates | Delta Technologies | CB-40IN-1107 | |
| DMF hub Teflon-coated fused-silica microcapillaries | Polymicro Technologies | TSU100375 | |
| Perfusion chamber microcapillaries | Polymicro Technologies | TSP530700 | |
| Tubing and microcapillary fittings | Sandia National Laboratories | ||
| Polycarbonate tubing | Paradigm Optics | CTPC100-500-5 | |
| 8-port precision syringe pump equipped with 30 mm (500 μl capacity) syringes | Hamilton Company | 54848-01 | |
| Parylene-C vapor deposition instrument | Specialty Coating Systems | PDS 2010 Labcoter 2 | |
| High-voltage function generator | Trek | 615A-1 615-3 | |
| MVX10 microscope | Olympus | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) | |
| QIClick digital CCD camera | QImaging | QIClick-F-CLR-12 | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) |
References
- Young, E. W. K., Beebe, D. J. Fundamentals of microfluidic cell culture in controlled microenvironments. Chemical Society Reviews. 39, 1036-1048 (2010).
- Yeo, L. Y., Chang, H. C., Chan, P. P. Y., Friend, J. R.
- Zhang, B., Kim, M. C., Thorsen, T., Wang, Z. A self-contained microfluidic cell culture system. Biomedical Microdevices. 11, 1233-1237 (2009).
- Skafte-Pedersen, P., et al. A self-contained, programmable microfluidic cell culture system with real-time microscopy access. Biomedical Microdevices. 14, 385-399 (2012).
- Barbulovic-Nad, I., Au, S. H., Wheeler, A. R. A microfluidic platform for complete mammalian cell culture. Lab Chip. 10, 1536-1542 (2010).
- Zhou, Y., Pang, Y., Huang, Y. Openly Accessible Microfluidic Liquid Handlers for Automated High-Throughput Nanoliter Cell Culture. Analytical Chemistry. 84, 2576-2584 (2012).
- Wang, H. Y., Bao, N., Lu, C. A microfluidic cell array with individually addressable culture chambers. Biosensors and Bioelectronics. 24, 613-617 (2008).
- Cimetta, E., Cagnin, S., Volpatti, A., Lanfranchi, G., Elvassore, N. Dynamic culture of droplet-confined cell arrays. Biotechnology Progress. 26, 220-231 (2010).
- Hung, P. J., Lee, P. J., Sabounchi, P., Lin, R., Lee, L. P. Continuous perfusion microfluidic cell culture array for high-throughput cell-based assays. Biotechnology and Bioengineering. 89, 1-8 (2005).
- King, K. R., et al. A high-throughput microfluidic real-time gene expression living cell array. Lab on a Chip. 7, 77-85 (2007).
- Gómez-Sjöberg, R., Leyrat, A. A., Pirone, D. M., Chen, C. S., Quake, S. R. Versatile, fully automated, microfluidic cell culture system. Analytical Chemistry. 79, 8557-8563 (2007).
- Wheeler, A. R. Chemistry - Putting electrowetting to work. Science. 322, 539-540 (2008).
- Gong, J., Kim, C. J. All-electronic droplet generation on-chip with real-time feedback control for EWOD digital microfluidics. Lab Chip. 8, 898-906 (2008).
- Choi, K., et al. Integration of field effect transistor-based biosensors with a digital microfluidic device for a lab-on-a-chip application. Lab Chip. 12, 1533-1536 (2012).
- Barbulovic-Nad, I., Yang, H., Park, P. S., Wheeler, A. R. Digital microfluidics for cell-based assays. Lab Chip. 8, 519-526 (2008).
- Gentilucci, L., de Marco, R., Cerisoli, L. Chemical modifications designed to improve peptide stability: incorporation of non-natural amino acids, pseudo-peptide. 16, 3185-3203 (2010).
- Miller, E. M., Wheeler, A. R. A digital microfluidic approach to homogeneous enzyme assays. Anal. Chem. 80, 1614-1619 (2008).
- Jebrail, M. J., Bartsch, M. S., Patel, K. D. Digital microfluidics: a versatile tool for applications in chemistry, biology. 12, 2452-2463 (2012).
- Ng, A. H. C., Choi, K., Luoma, R. P., Robinson, J. M., Wheeler, A. R. Digital Microfluidic Magnetic Separation for Particle-Based Immunoassays. Analytical Chemistry. 84, 8805-8812 (2012).
- Sista, R. S., et al. Heterogeneous immunoassays using magnetic beads on a digital microfluidic platform. Lab Chip. 8, 2188-2196 (2008).
- Malic, L., Veres, T., Tabrizian, M. Biochip functionalization using electrowetting-on-dielectric digital microfluidics for surface plasmon resonance imaging detection of DNA hybridization. Biosens. Bioelectron. 24, 2218-2224 (2009).
- Malic, L., Veres, T., Tabrizian, M. Nanostructured digital microfluidics for enhanced surface plasmon resonance imaging. Biosens. Bioelectron. 26, 2053-2059 (2011).
- Jebrail, M. J., Wheeler, A. R. Digital microfluidic method for protein extraction by precipitation. Anal. Chem. 81, 330-335 (2009).
- Nelson, W. C., et al. Incubated protein reduction and digestion on an electrowetting-on-dielectric digital microfluidic chip for MALDI-MS. Anal. Chem. 82, 9932-9937 (2010).
- Mousa, N. A., et al. Droplet-scale estrogen assays in breast tissue, blood, and serum. Sci. Transl. Med. 1, 1ra2 (2009).
- Jebrail, M. J., et al. A digital microfluidic method for dried blood spot analysis. Lab Chip. 11, 3218-3224 (2011).
- Choi, K., Ng, A. H. C., Fobel, R., Wheeler, A. R.
- Jebrail, M. J., et al. Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing. J. Vis. Exp. (33), e1603 (2009).
- Thaitrong, N., et al. Quality Control of Next Generation Sequencing Library through an Integrative Digital Microfluidic Platform. , Submitted (2012).
- Shin, Y. J., Lee, J. B. Machine vision for digital microfluidics. Review of Scientific Instruments. 81, (2010).
- Thornton, M., Eward, K. L., Helmstetter, C. E. Production of minimally disturbed synchronous cultures of hematopoietic cells. BioTechniques. 32, 1098-1105 (2002).
- Huang, X., Dai, W., Darzynkiewicz, Z. Enforced adhesion of hematopoietic cells to culture dish induces endomitosis and polyploidy. Cell Cycle. 4, 801-805 (2005).
- Raje, M., et al. Charged nylon membrane substrate for convenient and versatile high resolution microscopic analysis of Escherichia coli & mammalian cells in suspension culture. Cytotechnology. 51, 111-117 (2006).
- Chatterjee, D., Hetayothin, B., Wheeler, A. R., King, D. J., Garrell, R. L. Droplet-based microfluidics with nonaqueous solvents and solutions. Lab Chip. 6, 199-206 (2006).
- Perroud, T. D., et al. Microfluidic-based cell sorting of Francisella tularensis infected macrophages using optical forces. Analytical Chemistry. 80, 6365-6372 (2008).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10, 57-63 (2009).
- Malone, J. H., Oliver, B. Microarrays, deep sequencing and the true measure of the transcriptome. BMC Biology. 9, (2011).
- Wu, M., et al. Microfluidically-unified cell culture, sample preparation, imaging and flow cytometry for measurement of cell signaling pathways with single cell resolution. Lab on a Chip. 12, 2823-2831 (2012).
- Srivastava, N., et al. Fully integrated microfluidic platform enabling automated phosphoprofiling of macrophage response. Analytical Chemistry. 81, 3261-3269 (2009).
- Herr, A. E., et al. Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 5268-5273 (2007).
