Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

פלטפורמה אוטומטית צדדי לניסויים בגירוי תא מיקרו בקנה מידה

Published: August 6, 2013 doi: 10.3791/50597
Automatic Translation
1, 2, 2,3, 4, 2
1Department of Systems Biology, Sandia National Laboratories, 2Department of Biotechnology and Bioengineering, Sandia National Laboratories, 3Canon U.S. Life Sciences, 4Department of Advanced Systems Engineering and Deployment, Sandia National Laboratories

Summary

אנחנו פיתחו תרבות תא אוטומטית וחקירת פלטפורמה לניסויי גירוי תא מיקרו בקנה מידה. הפלטפורמה מציעה שליטה פשוטה, תכליתית, ומדויקת בטיפוח ועידוד אוכלוסיות קטנות של תאים, ומחל lysates לניתוחים מולקולריים. הפלטפורמה מתאימה גם למחקרים המשתמשים בתאים ו / או חומרים כימיים יקרים.

Abstract

מחקר של תאים בתרבית (בניתוח חוץ גופית) סיפקה תובנה חשובה לתוך מערכות ביולוגיות מורכבות. שיטות וציוד קונבנציונליות לניתוח במבחנה מתאימות גם ללמוד ממספר גדול של תאים (≥ 10 5) בכמויות בקנה מידת מ"ל (≥ 0.1 מ"ל). עם זאת, ישנם מקרים רבים שבהם הוא נחוץ או רצוי להקטין גודל התרבות כדי להפחית את הצריכה של התאים של ריבית ו / או חומרים כימיים הנדרשים לתרבות שלהם, גירוי, או עיבוד. למרבה הצער, גישות קונבנציונליות אינן תומכות במניפולציה מדויקת ושחזור של תרבויות מיקרו בקנה מידה, ואת המערכות האוטומטיות מבוססות מיקרופלואידיקה הזמינות כרגע הם מורכבות ומיוחדים לשימוש שגרתי על ידי רוב המעבדות מדי. כדי לטפל בבעיה זו, פיתחנו פלטפורמה טכנולוגית פשוטה ותכליתית לתרבות אוטומטית, גירוי, והתאוששות של אוכלוסיות קטנות של תאים (100 - 2000 תאים) בנפח מיקרו בקנה מידהs (1 - 20 μl). הפלטפורמה מורכבת מסדרה של microcapillaries פיברונקטין מצופה ("תאי זלוף תא"), שבתוכה תרבויות מיקרו בקנה מידה שהוקמה, מתוחזק, והמגורה; התקן דיגיטלי מיקרופלואידיקה (DMF) לבוש עם "העברה" microcapillaries ("מוקד המרכזי "), שבו תאי מסלולים וריאגנטים ומתאי זלוף; משאבת מזרק דיוק גבוה, אשר סמכויות הובלה של חומרים בין תאי זלוף והמוקד המרכזי; וממשק אלקטרוני המספק שליטה על הובלה של חומרים, שהוא תיאם ואוטומטי באמצעות תסריטים שנקבעו מראש. כדוגמה, השתמשנו בפלטפורמה כדי להקל על מחקר של תגובות תעתיק שהושרו בתאי מערכת חיסונית על אתגר עם חיידקים. שימוש בפלטפורמה אפשרה לנו להפחית את הצריכה של תאים ריאגנטים, למזער את שונות ניסוי לניסוי, ומחדש ישירות הידיים על עבודה. לאור היתרונות שהיא מעניקה, כמו גם הנגישות שלה ורבגוניות, oפלטפורמת ur צריכה למצוא שימוש במגוון רחב של מעבדות ויישומים, ולהיות שימושית במיוחד בהנחיית ניתוח של תאים וגירויים שאינם זמינים בכמויות מוגבלות בלבד.

Introduction

המחקר של תאים נשמר בתרבות (בניתוח חוץ גופית) סיפקה תובנה רבת ערך לעקרונות היסוד והמנגנונים מולקולריים השולטים במערכות ביולוגיות מורכבות ועל בריאות אדם. את השיטות המקובלות לתרבות, גירוי, ואוסף של תאים לניתוח, אשר מנצלים צלחות פטרי וצלחות microtiter, נועדו למחקר של אוכלוסיות גדולות של תאים (≥ 10 5) בכרכי תרבות מ"ל בקנה מידה (≥ 0.1 מ"ל). עם זאת, ישנם מקרים רבים שבהם רק כמויות מוגבלות של תאים זמינות (תאים ראשוניים לדוגמה), או אוכלוסיות קטנות של תאים רצויים (לדוגמה, כדי להפחית את התא אל תא השתנות פני האוכלוסייה), או חומרים כימיים הנדרשים הם קשים להשגה או יקר מדי (למשל גורמים מטוהרים תא מופרש). בעיות מסוג זה יכול להיות מטופל בהצלחה על ידי שינוי קנה מידה למטה גודל התרבות, שבו יש לו היתרון נוסף של הפחתת הצריכה של כלחומרים כימיים הנדרשים לניתוח ב1,2 המבחנה. לרוע המזל, ציוד ושיטות קונבנציונליים אינם תומכים במניפולציה מדויקת ושחזור של תרבויות בקנה מידת מיקרו והמערכות האוטומטיות מבוססות מיקרופלואידיקה הזמינות כרגע 3-11 הם מורכבים ומיוחדים לשימוש שגרתי על ידי רוב המעבדות מדי.

בדו"ח זה, אנו מתארים הרכבה ושימוש בפלטפורמה טכנולוגית פשוטה ותכליתית לתרבות אוטומטית, גירוי, והתאוששות של אוכלוסיות קטנות של תאים (100 - 2000 תאים) בכמויות בקנה מידת מיקרו (1 - 20 μl). ארכיטקטורת הפלטפורמה (איור 1) היא מודולרי בעיצוב: קבוצה של פיברונקטין מצופה microcapillaries ("תאי זלוף סלולריים" מודול) משמש כאתר להקמה, תחזוקה, וגירוי של תרבויות מיקרו בקנה מידה; ומיקרופלואידיקה דיגיטלית (DMF ) מכשיר 12,13 לבוש עם "העברה" microcapillaries (מודול "המרכזי רכזת") 14,15 תאי מסלוליםוריאגנטים ומתאי זלוף. DMF מאפשר למשתמש לטפל בנפרד טיפות מרובות בו זמנית ולשנות מחדש או להזמין את המניפולציות (רכבות עיבוד מדגם להגדיר מחדש כלומר) מבלי לשנות את חומרת המכשיר. הגמישות העצומה שלו באה לידי ביטוי בהופעה האחרונה שלה כטכנולוגיה מרכזית במגוון רחב של יישומים, כולל תא תרבות 16,17, מבחני אנזים 18,19, 20,21 immunoassays, ה-DNA ניתוח 22,23, עיבוד חלבון, 24,25 ועיבוד דגימה קליני. 26,27 המוקד המרכזי שלנו מנצל את הגמישות המובנית למכשירי DMF, ומשפר עוד יותר אותו באמצעות תוספת של ממשקי microcapillary, אשר מספק הזדמנות לבצע את משנה של מניפולציות (תרבית תאים לדוגמה) בהיקפי מיוחד מודולים, ולא על המכשיר עצמו. DMF מידור של רכבות עיבוד בדרך זו גם מפשט את התכנון של PLAtform ארכיטקטורה (אין צורך לבנות מכשיר DMF שיכול לבצע את כל פעולות העיבוד) ומאפשר ההתפתחות שלה כפונקציות חדשות נדרשות (פשוט לשלב מודולים חדשים פריפריה בהתאם לצורך). הובלה של תאים ריאגנטים בתוך המוקד המרכזי היא מונע על ידי כוחות חשמלית הנוצרים על ידי הפעלה רציפה של אלקטרודות בתוך מכשיר DMF 13,28; תחבורה ל, מ, ובתוך תאי זלוף הוא מופעל על ידי שינויים בלחץ שנוצרו על ידי מזרק דיוק גבוה משאבה. כל תנועות של נוזלים אלה נשלטים באמצעות ממשק אלקטרוני פשוט ואוטומטי באמצעות שימוש בסקריפטים שנקבעו מראש.

כדוגמה מייצגת, אנחנו מדגימים את השימוש בפלטפורמה למחקר של תגובות תעתיק שהושרו בתאי מערכת חיסונית על אתגר עם חיידקים (איור 2). ביצוע ניסויים אלה על הפלטפורמה אפשר לנו לעבוד עם מספר קטן של תאים (~ 1,000 לניסיונימצב טל), למזער את שונות ניסוי לניסוי, ריאגנטים לשמר, ומחדש ישירים הידיים על העבודה. לאור היתרונות שהיא מעניקה, וכן הנגישות והצדדי שלה, פלטפורמה זו צריכה למצוא שימוש במגוון רחב של מעבדות ויישומים ולהוכיח שימושי במיוחד בהנחיית ניתוח של תאים וגירויים הזמינים רק בכמויות מוגבלות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

פרוטוקול כללי זו נועד לתמוך ביישום של הפלטפורמה למגוון רחב של מחקרים; היבטים ספציפיים למחקר הנציג תואר בדו"ח זה מופרדים בסוגר איור 2 ממחיש מחקר נציג מתבצע באמצעות הפרוטוקול.. יצוין, כי בפרוטוקול, כל פקודות "להורות" הן אוטומטיות באמצעות שימוש בסקריפטים שנקבעו מראש. שימו לב גם שניתן לבצע את שלב 2 במקביל עם שלב 1 (לדוגמה, במהלך שלבי 1.7 ו -1.8), ובשלב זה הוא לעתים קרובות עקף 2.1 (כי ניתן לכבס צלחות מכשיר DMF דוגמת / מצופים ושימוש חוזר; ראה שלב 5.2) .

1. להרכיב ולאכלס את צ'יימברס הזילוף הסלולרי

  1. מעיל המשטחים הפנימיים של עיקור microcapillaries (autoclaved) (סיליקה התמזגו-; 679 מיקרומטר OD, id מיקרומטר 534; אורך 15 ס"מ) עם פיברונקטין, על ידי מורה משאבת המזרק לצייר פתרון פיברונקטין סטרילי (30 μl של 50 מיקרוגרם / מ"ל) לכל אחדmicrocapillary, דוגרים (37 מעלות צלזיוס במשך שעה 2), מורה למשאבת המזרק למשוך את הפתרון, ולתת יבשים microcapillaries (טמפרטורת חדר (RT) עבור 6 שעות).
  2. חבר אחד (חדר זלוף) microcapillary פיברונקטין מצופה לצינורות פוליקרבונט (500 מיקרומטר OD, id מיקרומטר 100) וצינורות למשאבת מזרק יציאות מרובות, תוך שימוש באבזרי CapTite (6 תאי זלוף, 8 יציאות משאבת מזרק).
  3. באמצעות קלטת, לאבטח את גופו של כל תא זלוף לגוש חום המוגדר לטמפרטורה רצויה (37 מעלות צלזיוס).
  4. לטבול את הקצוות הפתוחים של תאי זלוף במאגר (צינור microcentifuge או microtiter צלחת היטב) (תאים המכילים P388D.1 מקרופאגים העכבריים) המושעים במדיום גידול טרי (RPMI-1640, 10% FBS, 500 יחידות / מיליליטר פניצילין, 500 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מ"ל) בריכוז רצוי (10 6 תאים / מ"ל).
  5. להורות למשאבת המזרק לצייר תאים (10 μl, 10 4 תאים) לתוך כל חדר זלוף אחריו מספיק AIR כדי להעביר את התקע הנוזלי (~ 4.5 ס"מ) לסעיף מאובטח לגוש החום.
  6. אפשר התאים לדבוק במשטחי הפנים פיברונקטין מצופים של תאי זלוף (37 מעלות צלזיוס למשך 2 - 1 שעה). בינתיים, להעביר את הקצוות הפתוחים של תאי זלוף ממאגר התאים למאגר חדש המכיל מדיום גידול טרי.
  7. לאחר תקופת הדבקות, להורות למשאבת המזרק לשלוח את האטמים הנוזליים (תקשורת ממוזגות ותאים פנויים) לבזבז, לסגת בינונית טרי (10 μl), ופעל עם מספיק אוויר כדי למקם את האטמים הנוזליים החדשים (בינונית טרי) על דבק תאים.
  8. המשך לבצע חילופי בינונית (כלומר חזור על שלב 1.7) במרווחי זמן קבועים (כל שעה 2) עד שאוכלוסיות התאים הן מספיק equilibrated ומורחבים (16 - 24 שעות של אוכלוסיות שנוצרו תרבות מיקרו בקנה מידה של כ -1,000 תאים / קאמרית).

2. לפברק התקני DMF ולהרכיב אדריכלות Hub

    14,29, דפוס את צלחת תחתית מכשיר DMF עם ארבעים ושש תחמוצת אינדיום בדיל (איטו) אלקטרודות (נהגים של אגל actuation) על ידי photolithography ותחריט, ואת מעיל עם 5 מיקרומטר של Parylene-C ו -50 ננומטר של טפלון AF. טופס הצלחת העליונה של מכשיר DMF על ידי ציפוי מצע זכוכית איטו unpatterned עם טפלון AF, כאמור לעיל.
  1. שימוש במסגרות דחיסת מתכת, לתקן את צלחות DMF ליציקת פולימר 14,30 עם גומחות, כי לשמור על מרווח בין 400 מיקרומטר בין הלוחות; מרווח זה, בשילוב עם גודל אלקטרודה actuation (2.5 מ"מ 2), מגדיר את נפח הטיפה (2.5 μl לאלקטרודה). שים לב שיכולה להיות מושלמת DMF הרכבה באמצעים פשוטים יותר 24.
  2. הוספה מצופה טפלון ההעברה microcapillaries (360 מיקרומטר OD, id מיקרומטר 100; 3.5-4.0 סנטימטר) אל תוך החלל בין לוחות DMF, מיצוב כל אחד להארכה לקצה האלקטרודה actuation מאותו המקור שלה.
  3. לen ההפךד של כל העברה להדביק microcapillary הולם CapTite.
  4. להעסיק את המחברים החשמליים לאספקת מתח לאלקטרודות איטו. רצפי הפעלת האלקטרודה הם אוטומטיים באמצעות שימוש בממשק אלקטרוני מבוקר מחשב פועל תסריטים שנקבעו מראש.
  5. אופציונלי: העבר את רכזת DMF התאסף על הבמה translational של מיקרוסקופ (SZ-6145TR (אולימפוס, יפן)) מצוידת במכשיר תשלום מצמיד (CCD) מצלמה (DCR-HC96 (סוני, יפן)) כדי להקל על המעקב של טיפות 31.

3. חברו את צ'יימברס הזילוף לרכזת DMF ולעורר את אוכלוסיות התאים

  1. הסר את הקצוות הפתוחים של תאי זלוף מהמאגר הבינוני (ראה שלב 1.6) ולהכניס אותם לתוך אבזרי CapTite מודבקים לקצות microcapillaries העברת רכזת DMF (ראה שלב 2.4).
  2. להורות למשאבת המזרק לשלוח את האטמים הנוזליים (תקשורת ממוזגות) בתאי זלוף לבזבז.
  3. Instruct רכזת DMF לצייר גירוי (E. coli BioParticles ב 100 מיקרוגרם / מ"ל במדיום טרי עם 0.1% Pluronic F127 w / V) ממאגר על לוח ולספק טיפה בגודל המתאים (10 μl) לכל העברה microcapillary . המאגרים על הלוח מורכבים מתאים בצורת גלילית (1.5 x 1.5 ס"מ כל אחת) ומחוברים לרכזת DMF דרך צינורות.
  4. להורות למשאבת המזרק כדי לצייר את הגירוי מתחבר לmicrocapillaries ההעברה, ופעל עם מספיק אוויר כדי למקם את האטמים על אוכלוסיות תאים בתאי זלוף.
  5. דגירה התאים עם גירוי (37 מעלות צלזיוס למשך 4 - 1 שעה). אופציונלי: Exchange לגירוי טרי (כלומר חזור על פעולות 3.2-3.4) במרווחי זמן קבועים.

4. לסיים את גירוי ולשחזר lysates תא לניתוח

  1. אופציונלי: אם נדרש תקופה שלאחר גירוי, להחליף את אטמי הנוזל המכיל-גירוי למדיום חדש (חזור על שלבים כלומר 3.2-30.4, החלפת מדיום חדש לגירוי), ותמשיך לדגור ולהחליף במידת הצורך.
  2. להחליף את התקעים הנזילים בתאי זלוף לחיץ לשטוף (הצפת מודול תמוגה ישירה פרלוד ב) (כלומר חזור על פעולות 3.2-3.4, החלפת חיץ לשטוף לגירוי), ודגירה לפי צורך (5 דקות).
  3. להחליף את התקעים הנוזליים (לשטוף חיץ) לפתרון תמוגה (חיץ מודול תמוגה ישירה פרלוד עם 0.1% Pluronic F127 w / V) (כלומר חזור על פעולות 3.2-3.4, החלפת פתרון תמוגה לגירוי), ודגירה לפי הצורך (5 דקות) .
  4. להורות למשאבת המזרק לשלוח את האטמים הנוזליים (lysates תא) לרכזת DMF.
  5. לפרק את רכזת DMF, להסיר את הצלחת העליונה של מכשיר DMF (באמצעות טיפול לא כדי להטות את הצלחת הצידה, כמו זה יכול לגרום לטיפת ערבוב), ולאסוף את lysates באמצעות Pipetman או מזרק לניתוח פלטפורמה (את פרופיל ביטוי גנטי דרך qPCR).

5. פלטפורמת חומרה נקיות עבורלהשתמש שוב

  1. לטבול microcapillaries ההעברה ואבזרי CapTite באקונומיקת 10% (V / V במים) במשך 10 דקות ב RT, לשטוף היטב עם מים deionized, ויבש באמצעות גז חנקן.
  2. לטבול את צלחות מכשיר DMF באקונומיקת 10% במשך 10 דקות ב RT, יש לשטוף היטב עם isopropanol ואחריו המים deionized, ושימוש בגז חנקן יבש ואחרי האפייה ב 160 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  3. צינור פוליקרבונט של משאבת המזרק, וצוות שחקני הפולימר של מכשיר DMF ומסגרת דחיסה, יכולים להיות שימוש חוזרים בלי ניקוי. זלוף קאמרי microcapillaries מבוטלים לאחר כל ניסוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כהדגמה של הפלטפורמה האוטומטית, השתמשנו בו כדי לבצע את המחקר שבו אוכלוסיות קטנות של תאים חיסוניים גדלו בתרבויות בקנה מידת מיקרו, תיגר עם חיידקים, וlysed לניתוח את הפלטפורמה של תגובות פרו דלקתיות (איור 2 ).

כל אחד משישה תאי זלוף סלולריים נזרע עם 10 4 תאי מערכת חיסון (מקרופאגים P388D.1 עכבריים) resuspended ב10 μl של מדיום גידול. לאחר תקופה דבקות (37 מעלות צלזיוס במשך שעה 2) ומטבע בינוני, ~ 500 תאים נשארו מחוברים למשטחים הפנימיים של תא אחד (איור 3 א), כפי שנמדדו באמצעות ניתוח של תרבויות microscale לשכפל (תאים שוחררו דרך טיפול chelator ונספרו דרך hemacytometer ומיקרוסקופ אור). דגירה נוספת על 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות, עם חילופים בינוניים ב 2 מרווחי HR, הרחיבה את אוכלוסיות תאים ל ~ 1,000 תאים לכל תא (איור 3 ב) (כפי שנמדד על ה ניתוח גס של תרבויות microscale לשכפל, כמתואר לעיל). בארבע מתוך ששת תאי זלוף, אוכלוסיות התאים היו תיגר עם א ' חיידקי קולי (BioParticles pHrodo), resuspended במדיום גידול, ונמסרו על ריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 20 (כלומר, כל תא באוכלוסייה היה לערער עם 20 BioParticles, בממוצע). בשני החדרים הנותרים, את אוכלוסיות התאים קיבל אתגר מדומה (כלומר מדיום גידול בלבד). לאחר דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 (שתי תרבויות חיידקים תיגר) או 4 שעות (שני חיידקים מאותגרים, ושתיים מדומה תיגר, תרבויות), התאים נשטפו וlysed, ואת lysates התאושש מהרכזת DMF. שיטות ספסל בקנה מידה קונבנציונליות היו משמשת להכנת cDNA מlysates, וכדי למדוד את רמות תעתיק למתווכי דלקת: chemokines MIP-1β (CCl4) וטווחים (CCL5), מתנהלת cyclooxygenase COX-2 (PTGS2), וציטוקינים (TNF TNFα ).

> איור 4 מסכם את התוצאות משלושה ניסויים משוכפלים באופן עצמאי. מצאנו כי תאי מערכת חיסון גדלו ולערער בתרבויות בקנה מידת מיקרו (פסים אדומים) רכובים תגובות תעתיק פרו דלקתיות שהיו למעשה זהים לאלה שהושרו בתאים שגודלו ולערער בתרבויות קונבנציונליות (סורגים כחולים). יתר על כן, על פלטפורמת מיקרו (בקנה מידה) הניסויים הראו פחות השתנות (כפי שצוין על ידי ברים שגיאה קטנים יותר) וצורכים כמויות קטנות יותר של תאים וחומרים כימיים (טבלת 1).

איור 1
איור 1. תצלום של פלטפורמה אוטומטית לניסויים בגירוי תא קנה מידה מיקרו.

איור 2
איור 2. סקירה כללית של פלטפורמת ניסוי-Enabled נציג: פרופיל תעתיק של תאים חיסוניים תיגר עם חיידקים בתרבויות בקנה מידה מייקר.

איור 3
איור 3. תמונות של תאים חיסוניים בתרבית תא זלוף מיקרו בקנה מידה. מקרופאגים Murine (שורת תאי P388D.1) היו resuspended במדיום גידול בריכוז של 10 6 תאים / מ"ל, ו10 μl (10 4 תאים) המשמשים לזרע פיברונקטין מצופה microcapillary (תא זלוף). תמונות בהירות שדה נלקחו באמצעות מיקרוסקופ MVX10 (אולימפוס) מצויד במצלמת CCD (Qimaging). כדי למדוד את גודל אוכלוסייה, תאים מתרבויות בקנה מידה מייקר לשכפל שוחררו ממשטחי חדר זלוף באמצעות חשפנית סלולרי, מוכתמים באמצעות trypan כחול, ונספר באמצעות hemacytometer ומיקרוסקופ אור. א ב 'לאחר 16 שעות של התרבות (דגירה על 37 מעלות צלזיוס עם חילופים בינוניים 2 כל HR), האוכלוסייה התרחבה ל ~ 1,000 תאים.

איור 4
איור 4. פרופילי תעתיק של תאים חיסוניים בתרבית ומגורה בכלים קונבנציונליים מול צ'יימברס זילוף מיקרו בקנה מידה. מקרופאגים Murine (שורת תאי P388D.1) היו resuspended במדיום גידול בריכוז של 10 6 תאים / מ"ל. לתרבויות קונבנציונליות, 50 μl (5 x 10 4 תאים) שמשו לזרע μl 150 של מדיום גידול בטוב של צלחת microtiter 96 היטב; לתרבויות מיקרו בקנה מידה, 10 μl (10 4 תאים) שמשו לזרע microcapil פיברונקטין מצופהלארי (תא זלוף). לאחר דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות, התאים (~ 5 x 10 4 לתרבות הקונבנציונלית, ~ 10 3 לכל תרבות בקנה מידה מייקר) היו תיגר עם א ' חיידקי קולי (BioParticles pHrodo) בריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 20 (כלומר, 20 BioParticles לכל תא בתרבות); ביקורת שלילית (מדומה תיגר) תרבויות קיבל רק תקשורת טריות. לאחר דגירה נוספת על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 או 4, התאים נשטפו וlysed באמצעות ריאגנטים ממודול תמוגה ישיר פרלוד. Lysate רנ"א היה מוגבר והמיר לcDNA באמצעות Ovation PicoSL WTA, (≥ 200 NT) את מוצרי cDNA הגדולים מטוהרים באמצעות Agencourt RNAClean XP, ומוצרים אלה משמשים כתבנית במבחני qPCR TaqMan למדוד רמות התמליל לMIP-1β (CCl4), RANTES (CCL5), מעכבי COX-2 (PTGS2), וTNFα (TNF), כמו גם GAPDH (לנורמליזציה של רמות cDNA בין lysates). כל assay qPCR בוצע בשלושה עותקים, והתוצאות בממוצע. Eaניסוי חזר על עצמו באופן עצמאי פרק שלוש פעמים. ברים מצביעים על עלייה הממוצעת של פי רמות תמליל בתרבויות קונבנציונליות (כחול) או תרבויות מיקרו בקנה מידה (אדום) תיגר עם חיידקים, בהשוואה לביקורת שלילית (מדומה תיגר) תרבויות; ברים שגיאה מציינים סטיית התקן על פני שלושת הניסויים.

דרישה ניסוי קונבנציונלי ניסוי בקנה מידה מייקר
תאים 3,000,000 60,000
צמיחה בינונית 2.4 מ"ל 0.7 מ"ל
BioParticles 200 מיקרוגרם 4 מיקרוגרם
ריאגנטים שטפי & תמוגה 300 μl כל 60 μl כל

טבלת מס '1. דרישות לניסוי גירוי תא קונבנציונלי לעומת קנה מידה מיקרוS. מספרים שאובים מניסוי הנציג שתואר בדו"ח זה (איור 2), שבה מקרופאגים העכבריים (שורת תאי P388D.1) גדלו בשש (צלחת microtiter 96 גם) קונבנציונלית לעומת קנה המידה מיקרו (חדר זלוף) תרבויות , אתגר עם א ' חיידקי קולי (BioParticles pHrodo) במשרד פנים של 20, וlysed לניתוח qPCR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פיתחנו פלטפורמה אוטומטית פשוטה ותכליתית לתרבית תאים בקנה מידה מייקר ניסויים וגירוי. הפלטפורמה מאפשרת לנו לעבוד עם כמויות קטנות תרבות ואוכלוסיות תאים (1 - 20 μl ו100 - 2,000 תאים, לכל תא); גדלי התרבות יכולים להיות מופחתים עוד יותר באמצעות שימוש בmicrocapillaries של קוטר קטן יותר. עובדים בקני מידה אלה מפחית את עלות לימודים שגרתי ועושה מחקרים אפשריים הדורשים שימוש בחומרים כימי ו / או תאים יקרים. ניסויים שבוצעו בפלטפורמה גם להראות פחות השתנות, ככל הנראה בשל הדיוק והשחזור שבו תאים ונוזלי מטופלות על ידי הפלטפורמה האוטומטית.

התצורה הנוכחית של הפלטפורמה שואבת את התאים ותקשורת מהמאגרים מחוץ ללוח (צינורות microcentrifuge או בארות צלחת microtiter) לזריעה, איזון, והרחבה של אוכלוסיות תאים בתאי זלוף. זוהי דרך פשוטה לטפל בחוסר ההתאמה ביןדרישות מדיום גידול (700 μl נצרך בניסוי שתואר לעיל הנציג לדוגמה) ואת יכולתו של המכשיר זה DMF על לוח מאגרים (24 μl כל אחד). עם זאת, תצורה זו מחייבת התערבות ידנית באמצע הניסוי, כדי לעבור בין שני מאגרים (שלב 1.6) ולחבר את תאי זלוף לרכזת DMF (שלב 3.1). תצורות עתידיות יכולה לכלול קיבולת גדולה (למשל 1 מ"ל) על לוח מאגרים, שיאפשר ניתוב של כל החומרים דרך רכזת DMF, ובכך למנוע צורך בהתערבות הידנית באמצע הניסוי.

הניסויים שלנו נדרשו רק התרבות (<24 שעות) לטווח הקצר של תאים על הרציף. יש לנו וידאנו שתא כדאיות על הפלטפורמה דומה לזו בתרבויות קונבנציונליות עבור לפחות 24 שעות (מידע לא מוצג). עם זאת, עדיין לא ניסינו לשמור על תרבויות הפלטפורמה לתקופות זמן ארוכות יותר. אידוי הוא לא דאגה עיקרית של הפלטפורמה כיתאי זלוף ומאגרי מדיום גידול הם מערכות סגורות באופן חלקי והתקעים הנוזליים המכסים את התאים מתחדש בקלות באמצעות החלפה בינונית. מצד השני, כדי לשמור על רמת חומציות בטווח ארוך תרבויות ייתכן שיהיה צורך לשכן את מאגרי מדיום גידול ב5 - 10% אווירת CO 2 או לעבור למדיום גידול שאינו כוללת חיץ pH מבוסס 2-CO יקרבונט . בנוסף, התרבות ארוכת טווח של תאים המתחלקים באופן פעיל תרחיב את האוכלוסיות לנקודת confluency (כלומר כיסוי של כל המשטחים הזמינים בתוך תא זלוף), אשר תחייב passaging של התאים (שחרור, לשטוף, לדלל, ומחדש זרע) . אחרים עשו זאת בmicrofluidic משטרים 3,5,6,9,17 ובתצורה הנוכחית שלה הפלטפורמה צריכה להיות מסוגל לבצע את כל המניפולציות הנדרשות. לסיכום, אנו צופים כי עם שינוי צנוע (בעיקר לפרוטוקולים, ולא חומרה) הפלטפורמה שלנו צריכה להיות גapable של תמיכה בתרבות תא היונקים לטווח ארוך. זה היה נראה כיוון עתידי מבטיח במיוחד בגלל שיטות מקובלות הן זמן רב ועבודה אינטנסיבית; הוספת יכולת תרבות לטווח ארוך לרפרטואר של הפלטפורמה האוטומטית שלנו היה עוד לאפשר למשתמשים שלה כדי לכוון מחדש את העבודה שלהם בצורה פרודוקטיבית יותר.

למרות שאנו צריכים לבדוק רק כמה תאים מסוגים שונים ובכך רחוק (קו למשל עכברי מקרופאג תא RAW264.7; מקרופאגים מח עצם Murine הנגזרים (BMDM)), הפלטפורמה צריכה להיות מסוגלת להכיל כמעט כל סוג תא חסיד. במקרים מסוימים, ייתכן שיהיה צורך לשנות את ציפוי תא זלוף מפיברונקטין למרכיב מטריקס אחר (או תערובת של מרכיבים), או כדי לשנות את מדיום הגידול, אך נעשים שינויים אלה בקלות. עבודה עם סוגי תאים שאינם חסיד יכולה להיות יותר מאתגר, אבל אסטרטגיות קשירה סלולריים להיות מוצלחת בהקשרים דומים 32-34. זה should גם שיהיה אפשר ליצור תרבויות מעורבות מורכבות מסוגי תאים רבים, ואכן, הדיוק שבו הפלטפורמה מטפלת בתאים ונוזלים צריך להבטיח כי הבנייה של תרבויות המעורבות היא מאוד לשחזור.

בכל קשורים לגירויים, כמעט כל חומר שיכול להיות מועבר בתוך התוספת נוזל מימית צריך להיות תואם עם הפלטפורמה שלנו 5,13,16,35. במקרה של חלקיקים גדולים או צפופים, אשר יכול להתיישב על פני זמן, זה עשוי להיות נחוץ כדי resuspend אותם מעת לעת בתוך המאגרים, בעבר, יש לנו לטפל בבעיה זו באמצעות שימוש בנוזל הספק בצפיפות גבוהה 36 או תסיסה פשוטה מערכת (מידע לא מוצג), פתרונות שאמורות להיות קלים ליישום על הפלטפורמה שלנו.

עד כה, האפיון של תאים בתרבית ומגורה על הפלטפורמה שלנו מתמקד בעיקר בניתוח qRT-PCR של תגובות פרו דלקתי סימן ההיכר. כצעד, ניתוח מקיף הבא של tהוא transcriptome של תא האוכלוסייה (באמצעות מערכי DNA או דור רצף (SGS) (כלומר RNA-Seq 37,38)), גם בהישג היד; עם שינוי צנוע של שלב הכנת cDNA, הפלטפורמה והפרוטוקולים שלנו צריכה להיות מסוגלת לתמוך באופן מלא בעולם מחקרי אפיון תעתיק. בדומה לכך, הניתוח של תגובות תא אוכלוסייה ברמת החלבון (באמצעות ELISA, immunoprecipitation, ספקטרומטריית מסה, או microarrays חלבון) צריך לדרוש שינוי רק משלבי הכנת lysate. הפלטפורמה תומכת גם ניתוח של תגובות תא מבוסס הדמיה. תאים יכולים להיות צילמו בתוך חדר זלוף (איור 3 למשל); שימוש על פני השטח שטוח (ולא מעוגלים) microcapillaries למודול תא זלוף יקל ניתוח מסוג זה. בנוסף, ניתן הדמיה בתאי רכזת DMF 14,15, לפני זריעה של התאים ו / או לאחר שחרור מהם זלוף. תאים שפורסמו יכולים להיות גם צילמו את שלהפלטפורמה. עד כה, השתמשנו במיקרוסקופ אור וקרינה לתאי תמונה בכל אחד מהשלבים האלה כדי לנתח המורפולוגיה שלהם, כדאיות, קצב התפשטות, ואינטראקציות פיסיות עם גירויים (למשל BioParticles) ושני (מידע לא מוצג). מיקרוסקופית גם צריך לאפשר ניתוח של תוכן המטבוליט (הוערך באמצעות שימוש בצבעי ניאון), פעילות תעתיק (הוערך באמצעות שימוש בכתב בונה), ורמות חלבון / לוקליזציה (הוערך באמצעות שימוש בכתב בונה, בונת היתוך חלבון פלואורסצנטי, ו / או immunocytochemistry ). תאים שפורסמו יכולים להיות מנותחים באמצעות cytometry הזרימה גם כן. רבים מניתוחים אלו יכולים להתבצע אך ורק על הפלטפורמה בתצורה הנוכחית שלה, ואילו אחרים היו דורשים ניתוח או ביטול פלטפורמת אינטגרציה של מודולים מבוססי מיקרופלואידיקה מיוחדים (לדוגמה ראה הפניות 36,39-41) לפלטפורמה באמצעות חיבור לDMF רכזת. יחדיו, זה נראה לא סבירכובע הפלטפורמה שלנו תהיה להוכיח את הערך המאפשר ניתוח רב ממדים של אוכלוסיות קטנות של תאים, אשר אחרת יכול להיות מושגת רק באמצעות שימוש במערכות רובוטיות מאוד מורכבות ויקרות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

המחברים מודים רונלד פ רנזי ומייקל ס Bartsch על תרומתם לעיצוב והפיתוח של מכשירי DMF ורכזת DMF. מחקר זה נתמך באופן מלא על ידי מעבדת מחקר בימוי ותכנית פיתוח במעבדות הלאומית Sandia. Sandia היא מעבדה תכנית רבת מנוהלת ומופעלת על ידי חברת Sandia, חברה בת בבעלות מלאה של החברה לוקהיד מרטין, למחלקה הלאומי לביטחון הגרעיני של מנהל האנרגיה האמריקנית תחת חוזה DE-AC04-94AL85000.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Prelude Direct Lysis Module NuGEN 1400-24
Trypan Blue (0.4% w/v) GIBCO 15250-061
Cell Stripper Cellgro 25-056-C1
Ovation PicoSL WTA NuGEN 3310-048
Agencourt RNAClean XP Beckman Coulter Genomics A63987
pHrodo BioParticles Invitrogen P35361
CCL4 TaqMan qRT-PCR assay Applied Biosystems Mm00443111_m1
CCL5 TaqMan qRT-PCR assay Applied Biosystems Mm01302428_m1
PTGS2 TaqMan qRT-PCR assay Applied Biosystems Mm00478374_m1
TNF TaqMan qRT-PCR assay Applied Biosystems Mm00443258_m1
GAPDH TaqMan qRT-PCR assay Applied Biosystems Mm99999915_g1
Pluronic F127 Sigma Chemical 2594628
Fluorinert FC-40 Sigma Chemical 51142-49-5
Parylene C dimer Specialty Coating Systems 28804-46-8
Teflon-AF DuPont AF1600
Polyimide tape ULINE S-11928
Indium tin oxide (ITO) coated glass substrates Delta Technologies CB-40IN-1107
DMF hub Teflon-coated fused-silica microcapillaries Polymicro Technologies TSU100375
Perfusion chamber microcapillaries Polymicro Technologies TSP530700
Tubing and microcapillary fittings Sandia National Laboratories
Polycarbonate tubing Paradigm Optics CTPC100-500-5
8-port precision syringe pump equipped with 30 mm (500 μl capacity) syringes Hamilton Company 54848-01
Parylene-C vapor deposition instrument Specialty Coating Systems PDS 2010 Labcoter 2
High-voltage function generator Trek 615A-1 615-3
MVX10 microscope Olympus Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub)
QIClick digital CCD camera QImaging QIClick-F-CLR-12 Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Young, E. W. K., Beebe, D. J. Fundamentals of microfluidic cell culture in controlled microenvironments. Chemical Society Reviews. 39, 1036-1048 (2010).
  2. Yeo, L. Y., Chang, H. C., Chan, P. P. Y., Friend, J. R. Microfluidic devices for bioapplications. Small. 7, 12-48 (2011).
  3. Zhang, B., Kim, M. C., Thorsen, T., Wang, Z. A self-contained microfluidic cell culture system. Biomedical Microdevices. 11, 1233-1237 (2009).
  4. Skafte-Pedersen, P., et al. A self-contained, programmable microfluidic cell culture system with real-time microscopy access. Biomedical Microdevices. 14, 385-399 (2012).
  5. Barbulovic-Nad, I., Au, S. H., Wheeler, A. R. A microfluidic platform for complete mammalian cell culture. Lab Chip. 10, 1536-1542 (2010).
  6. Zhou, Y., Pang, Y., Huang, Y. Openly Accessible Microfluidic Liquid Handlers for Automated High-Throughput Nanoliter Cell Culture. Analytical Chemistry. 84, 2576-2584 (2012).
  7. Wang, H. Y., Bao, N., Lu, C. A microfluidic cell array with individually addressable culture chambers. Biosensors and Bioelectronics. 24, 613-617 (2008).
  8. Cimetta, E., Cagnin, S., Volpatti, A., Lanfranchi, G., Elvassore, N. Dynamic culture of droplet-confined cell arrays. Biotechnology Progress. 26, 220-231 (2010).
  9. Hung, P. J., Lee, P. J., Sabounchi, P., Lin, R., Lee, L. P. Continuous perfusion microfluidic cell culture array for high-throughput cell-based assays. Biotechnology and Bioengineering. 89, 1-8 (2005).
  10. King, K. R., et al. A high-throughput microfluidic real-time gene expression living cell array. Lab on a Chip. 7, 77-85 (2007).
  11. Gómez-Sjöberg, R., Leyrat, A. A., Pirone, D. M., Chen, C. S., Quake, S. R. Versatile, fully automated, microfluidic cell culture system. Analytical Chemistry. 79, 8557-8563 (2007).
  12. Wheeler, A. R. Chemistry - Putting electrowetting to work. Science. 322, 539-540 (2008).
  13. Gong, J., Kim, C. J. All-electronic droplet generation on-chip with real-time feedback control for EWOD digital microfluidics. Lab Chip. 8, 898-906 (2008).
  14. Choi, K., et al. Integration of field effect transistor-based biosensors with a digital microfluidic device for a lab-on-a-chip application. Lab Chip. 12, 1533-1536 (2012).
  15. Barbulovic-Nad, I., Yang, H., Park, P. S., Wheeler, A. R. Digital microfluidics for cell-based assays. Lab Chip. 8, 519-526 (2008).
  16. Gentilucci, L., de Marco, R., Cerisoli, L. Chemical modifications designed to improve peptide stability: incorporation of non-natural amino acids, pseudo-peptide. 16, 3185-3203 (2010).
  17. Miller, E. M., Wheeler, A. R. A digital microfluidic approach to homogeneous enzyme assays. Anal. Chem. 80, 1614-1619 (2008).
  18. Jebrail, M. J., Bartsch, M. S., Patel, K. D. Digital microfluidics: a versatile tool for applications in chemistry, biology. 12, 2452-2463 (2012).
  19. Ng, A. H. C., Choi, K., Luoma, R. P., Robinson, J. M., Wheeler, A. R. Digital Microfluidic Magnetic Separation for Particle-Based Immunoassays. Analytical Chemistry. 84, 8805-8812 (2012).
  20. Sista, R. S., et al. Heterogeneous immunoassays using magnetic beads on a digital microfluidic platform. Lab Chip. 8, 2188-2196 (2008).
  21. Malic, L., Veres, T., Tabrizian, M. Biochip functionalization using electrowetting-on-dielectric digital microfluidics for surface plasmon resonance imaging detection of DNA hybridization. Biosens. Bioelectron. 24, 2218-2224 (2009).
  22. Malic, L., Veres, T., Tabrizian, M. Nanostructured digital microfluidics for enhanced surface plasmon resonance imaging. Biosens. Bioelectron. 26, 2053-2059 (2011).
  23. Jebrail, M. J., Wheeler, A. R. Digital microfluidic method for protein extraction by precipitation. Anal. Chem. 81, 330-335 (2009).
  24. Nelson, W. C., et al. Incubated protein reduction and digestion on an electrowetting-on-dielectric digital microfluidic chip for MALDI-MS. Anal. Chem. 82, 9932-9937 (2010).
  25. Mousa, N. A., et al. Droplet-scale estrogen assays in breast tissue, blood, and serum. Sci. Transl. Med. 1, 1ra2 (2009).
  26. Jebrail, M. J., et al. A digital microfluidic method for dried blood spot analysis. Lab Chip. 11, 3218-3224 (2011).
  27. Choi, K., Ng, A. H. C., Fobel, R., Wheeler, A. R. Digital microfluidics. Annual Review of Analytical Chemistry. 5, 413-440 (2012).
  28. Jebrail, M. J., et al. Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing. J. Vis. Exp. (33), e1603 (2009).
  29. Thaitrong, N., et al. Quality Control of Next Generation Sequencing Library through an Integrative Digital Microfluidic Platform. , Submitted (2012).
  30. Shin, Y. J., Lee, J. B. Machine vision for digital microfluidics. Review of Scientific Instruments. 81, (2010).
  31. Thornton, M., Eward, K. L., Helmstetter, C. E. Production of minimally disturbed synchronous cultures of hematopoietic cells. BioTechniques. 32, 1098-1105 (2002).
  32. Huang, X., Dai, W., Darzynkiewicz, Z. Enforced adhesion of hematopoietic cells to culture dish induces endomitosis and polyploidy. Cell Cycle. 4, 801-805 (2005).
  33. Raje, M., et al. Charged nylon membrane substrate for convenient and versatile high resolution microscopic analysis of Escherichia coli & mammalian cells in suspension culture. Cytotechnology. 51, 111-117 (2006).
  34. Chatterjee, D., Hetayothin, B., Wheeler, A. R., King, D. J., Garrell, R. L. Droplet-based microfluidics with nonaqueous solvents and solutions. Lab Chip. 6, 199-206 (2006).
  35. Perroud, T. D., et al. Microfluidic-based cell sorting of Francisella tularensis infected macrophages using optical forces. Analytical Chemistry. 80, 6365-6372 (2008).
  36. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10, 57-63 (2009).
  37. Malone, J. H., Oliver, B. Microarrays, deep sequencing and the true measure of the transcriptome. BMC Biology. 9, (2011).
  38. Wu, M., et al. Microfluidically-unified cell culture, sample preparation, imaging and flow cytometry for measurement of cell signaling pathways with single cell resolution. Lab on a Chip. 12, 2823-2831 (2012).
  39. Srivastava, N., et al. Fully integrated microfluidic platform enabling automated phosphoprofiling of macrophage response. Analytical Chemistry. 81, 3261-3269 (2009).
  40. Herr, A. E., et al. Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 5268-5273 (2007).

Tags

Bioengineering גיליון 78 הנדסה ביו רפואית ביולוגיה תאית ביולוגיה מולקולרית מיקרוביולוגיה ביופיזיקה ביוכימיה ננוטכנולוגיה מזעור microtechnology טכניקות תרבית תאים מיקרופלואידיקה אינטראקציות בין מאכסן לפתוגן תרבית תאים אוטומטית גירוי תא בתגובת תא תאי תאים אינטראקציות מיקרופלואידיקה דיגיטלי אינטגרציה מיקרוסיסטמס תרבית תאים
פלטפורמה אוטומטית צדדי לניסויים בגירוי תא מיקרו בקנה מידה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sinha, A., Jebrail, M. J., Kim, H.,… More

Sinha, A., Jebrail, M. J., Kim, H., Patel, K. D., Branda, S. S. A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments. J. Vis. Exp. (78), e50597, doi:10.3791/50597 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter