Summary
Vi har udviklet en automatiseret cellekultur og forhør platform for mikro-skala cellestimulering eksperimenter. Platformen tilbyder enkel, alsidig og præcis kontrol i at dyrke og stimulere små populationer af celler, og inddrive lysater til molekylær analyser. Platformen er velegnet til undersøgelser, der anvender værdifulde celler og / eller reagenser.
Abstract
Undersøgelse af celler i kultur (in vitro analyse) har givet vigtig indsigt i komplekse biologiske systemer. Konventionelle metoder og udstyr til in vitro-analysen er velegnede til at studere af et stort antal celler (≥ 10 5) i milliliter-skala volumener (≥ 0,1 ml). Men der er mange tilfælde, hvor det er nødvendigt eller ønskeligt at nedskalere kultur størrelse at reducere forbruget af cellerne af interesse og / eller reagenser, der er nødvendige for deres kultur, stimulation eller forarbejdning. Desværre har konventionelle metoder understøtter ikke præcis og reproducerbar manipulation af mikro-skala kulturer og MicroFluidics-baserede automatiske systemer øjeblikket er til rådighed, er for kompleks og specialiseret til rutinemæssig brug af de fleste laboratorier. For at løse dette problem, har vi udviklet en enkel og alsidig teknologiplatform til automatiseret kultur, stimulation, og inddrivelse af små populationer af celler (100 - 2.000 celler) i mikro-skala volumens (1 - 20 ul). Platformen består af et sæt af fibronectin-belagt microcapillaries ("celle perfusion kamre"), inden for hvilke mikro-skala kulturer er etableret, vedligeholdes og stimuleres, en digital microfluidics (DMF)-enhed udstyret med "overførsel" microcapillaries ("central hub "), som ruter celler og reagenser til og fra perfusion kamre, et høj præcision sprøjte pumpe, hvilke beføjelser transport af materialer mellem perfusion kamre og den centrale hub og en elektronisk grænseflade, som giver kontrol over transport af materialer, som er koordineres og automatiseret via forudbestemte scripts. Som et eksempel brugte vi platformen til at lette undersøgelse af transskriptionelle responser fremkaldt i immunceller ved udfordring med bakterier. Brug af platformen muligt for os at reducere forbruget af celler og reagenser, minimerer eksperiment-til-eksperimentet variabilitet, og re-direkte hands-on arbejdskraft. I betragtning af de fordele, det giver, samt dets tilgængelighed og alsidighed, our platform skulle finde anvendelse i en bred vifte af laboratorier og applikationer, og bevise især nyttig i at lette analysen af celler og stimuli, der er tilgængelige i begrænsede mængder.
Introduction
Studiet af celler opretholdt i kultur (in vitro analyse) har givet et uvurderligt indblik i de grundlæggende principper og molekylære mekanismer, der gælder komplekse biologiske systemer og menneskers sundhed. De traditionelle metoder til kultur, stimulation, og indsamling af celler til analyse, der udnytter petriskåle og mikrotiterplader, var designet til undersøgelse af store populationer af celler (≥ 10 5) i milliliter-skala kulturvolumener (≥ 0,1 ml). Men der er mange tilfælde, hvor der kun begrænsede mængder af celler er tilgængelige (f.eks primære celler), eller små populationer af celler er ønskelige (fx at reducere celle-til-celle variation i befolkningen), eller krævede reagenser er vanskelige at opnå eller uoverkommeligt dyrt (f.eks rensede celle-secernerede faktorer). Sådanne spørgsmål kan med held behandles af nedtrapning kultur størrelse, som har den ekstra fordel at reducere forbruget af allereagenser kræves for in vitro-analyse 1,2. Desværre konventionelt udstyr og metoder understøtter ikke præcis og reproducerbar manipulation af mikro-skala kulturer og MicroFluidics-baserede automatiske systemer øjeblikket er til rådighed 3-11 er for komplekse og specialiserede til rutinemæssig brug af de fleste laboratorier.
I denne rapport beskriver vi montering og brug af en enkel og alsidig teknologiplatform til automatiseret kultur, stimulation, og inddrivelse af små populationer af celler (100 - 2.000 celler) i mikro-skala mængder (1 - 20 ul). Platformen arkitektur (figur 1) er modulopbygget: et sæt af fibronectin-belagt microcapillaries ("celle perfusion kamre" module) tjener som stedet for etablering, vedligeholdelse og stimulering af mikro-skala kulturer og en digital microfluidics (DMF ) 12,13 enhed udstyret med "overførsel" microcapillaries ("central hub"-modulet) 14,15 ruter cellerog reagenser til og fra perfusion kamre. DMF giver brugeren mulighed for individuelt at tage flere dråber samtidigt og til at ændre eller genbestille manipulationer (dvs. omkonfigurere prøve forarbejdning tog) uden at ændre enhedens hardware. Dens enorme fleksibilitet er tydelig i sin nye rolle som en nøgleteknologi i en bred vifte af applikationer, herunder cellekultur 16,17, enzymassays 18,19, immunobestemmelser 20,21, DNA-analyse 22,23, protein behandling, 24,25 og klinisk prøvebehandling. 26,27 Vores centrale hub drager fordel af fleksibiliteten til DMF-enheder, og yderligere forbedrer det ved tilsætning af mikrokapillær grænseflader, som giver mulighed for at foretage en delmængde af manipulationer (f.eks cellekultur) i specialiserede perifere moduler, snarere end på DMF enheden selv. Opdeling af forarbejdning tog på denne måde forenkler også design af plaTForm arkitektur (ikke nødvendigt at bygge en DMF enhed, der kan udføre alle procestrin) og letter dets udvikling som nye funktioner er påkrævet (simpelthen integrere nye perifere moduler som nødvendigt). Transport af celler og reagenser inden for det centrale knudepunkt drives af electrowetting kræfter, der genereres ved sekventiel aktivering af elektroder i DMF-enhed 13,28, transport til, fra og inden for de perfusion kamre er drevet af trykændringer genereret af en høj præcision sprøjte pumpen. Alle disse flydende bevægelser styres via en enkel elektronisk grænseflade og automatiseret ved brug af forudbestemte scripts.
Som et repræsentativt eksempel, viser vi brug af platformen for studiet af transkriptionelle responser fremkaldt hos immunceller ved udfordring med bakterier (figur 2). Udføre disse eksperimenter på platformen muligt for os at arbejde med et lille antal celler (~ 1.000 pr eksperital betingelse), minimerer eksperiment-til-eksperimentet variabilitet spare reagenser, og re-direct hands-on arbejdskraft. I betragtning af de fordele, det giver, samt dets tilgængelighed og alsidighed, bør denne platform finde brug i en bred vifte af laboratorier og applikationer og bevise især nyttig i at lette analysen af celler og stimuli, der er tilgængelige i begrænsede mængder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne generelle protokol er designet til at understøtte anvendelsen af platformen til en bred vifte af undersøgelser aspekter specifikke for repræsentativ undersøgelse beskrevet i denne rapport er adskilt i parentes Figur 2 illustrerer en repræsentativ undersøgelse udført ved hjælp af protokollen.. Bemærk, at der i protokollen, er alle "instruere" kommandoer automatiseret ved brug af forudbestemte scripts. Bemærk også, at trin 2 kan udføres parallelt med trin 1 (fx under trin 1.7 og 1.8), og at trin 2.1 er ofte forbigås (fordi mønstrede / belagt DMF enhed pladerne kan vaskes og genbruges, se trin 5.2) .
1.. Saml og befolker Cell Perfusion Chambers
- Coat de indre overflader af steriliseret (autoklaveret) microcapillaries (kvartsglas, 679 um OD, 534 um id; 15 cm lang) med fibronectin, ved at instruere sprøjtepumpen at tegne en steril fibronectin opløsning (30 ml 50 ug / ml) i hvermikrokapillær, inkubering (37 ° C i 2 timer), instruerer sprøjtepumpen for at trække opløsningen, og lade microcapillaries tørre (stuetemperatur (RT) i 6 timer).
- Tilslut hver fibronektin-belagt microcapillary (perfusionskammer) til polycarbonat slange (500 um od, 100 um id) og slangen til multi-port sprøjtepumpe, ved hjælp CapTite fittings (6 perfusion kamre, 8-port sprøjte pumpe).
- Brug tape, kroppen af hver perfusionskammer sikre en varmeblok indstillet til den ønskede temperatur (37 ° C).
- Fordyb de åbne ender af perfusion kamre i et reservoir (microcentifuge rør eller mikrotiterpladebrønd) indeholder celler (P388D.1 murine makrofager) suspenderet i frisk vækstmedium (RPMI-1640, 10% FBS, 500 enheder / ml penicillin, 500 ug / ml streptomycin) ved ønskede koncentration (10 6 celler / ml).
- Instruere sprøjtepumpens at trække celler (10 pi, 10 4 celler) i hver perfusionskammer efterfulgt af nok air for at flytte den væskeformige prop (~ 4,5 cm) til sektion fastgjort til varmeblokken.
- Lad cellerne til at overholde de fibronectin-overtrukne indvendige overflader af perfusion kamre (37 ° C til 1 - 2 timer). I mellemtiden overføre de åbne ender af perfusion kamre fra cellerne reservoiret til en ny reservoir indeholdende frisk vækstmedium.
- Efter tilslutning periode instruere sprøjtepumpen til at sende de flydende propper (konditionerede medier og separate celler) til spilde, trække frisk medium (10 ul), og følg med nok luft til at placere de nye flydende propper (frisk medium) over klæbet celler.
- Fortsætte med at udføre medium udvekslinger (dvs. gentage trin 1.7) med jævne mellemrum (hver 2 time), indtil cellepopulationerne er tilstrækkeligt ligevægt og udvidet (fra 16 til 24 timers mikro-skala kultur genereret populationer af ~ 1.000 celler / kammer).
2.. Fabrikere DMF Device og Saml Hub Architecture
- Brug af metal kompression rammer, DMF plader fastsætte i en polymer støbt 14,30 med udsparinger, der opretholder en 400 um afstand mellem pladerne, denne afstand, kombineret med aktivering elektrode størrelse (2,5 mm 2), definerer dråbe volumen (2,5 pi per elektrode). Bemærk, at DMF samling kan opnås ved enklere midler 24.
- Indsæt teflonbelagt transfer microcapillaries (360 um OD, 100 um id, 3,5-4,0 cm lang) ind i rummet mellem DMF pladerne, positionering hver at udvide til kanten af dets beslægtede aktivering elektrode.
- Til den modsatte end for hver overførsel microcapillary anbringe et CapTite fitting.
- Engager de elektriske stik til at forsyningsspændingen til ITO elektroder. Elektrode aktivering sekvenser er automatiseret ved brug af en computer-kontrollerede elektroniske grænseflade kører forudbestemte scripts.
- Valgfrit: Flyt den samlede DMF navet på translationel fase af et mikroskop (SZ-6145TR (Olympus, Japan)) udstyret med en CCD-enhed (CCD) kamera (DCR-HC96 (Sony, Japan)) for at lette sporing af dråber . 31.
3.. Slut perfusionen Chambers til DMF Hub og stimulere cellepopulationerne
- Fjern de åbne ender af perfusion kamre fra mediet reservoir (se trin 1.6) og indsætte dem i de CapTite fittings fastgjort til enderne af overdragelsen microcapillaries af DMF nav (se trin 2.4).
- Instruere sprøjtepumpens at sende de flydende propper (konditionerede medier) i perfusion kamre at spilde.
- Instruct DMF hub at trække stimulus (E. coli biopartikler ved 100 ug / ml i frisk medium med 0,1% Pluronic F127 w / v) fra en on-board reservoir og levere en dråbe af passende størrelse (10 ul) til hver overførsel microcapillary . De ombord reservoirer består af cylindriske-formede rum (1,5 x 1,5 cm hver) og forbundet til DMF Hub via en slange.
- Instruer sprøjtepumpen at trække stimulus sættes i overdragelsen microcapillaries, og følg med nok luft til at placere stikkene over cellepopulationer i perfusion kamre.
- Inkubér cellerne med stimulus (37 ° C til 1 - 4 timer). Valgfrit: Exchange for frisk stimulus (dvs. du gentage trin 3,2-3,4) med regelmæssige mellemrum.
4.. Afslut Stimulation og Recover cellelysater til analyse
- Valgfrit: Hvis en post-stimulation er nødvendig, registreres udveksle stimulus-indeholder flydende propper til frisk medium (dvs. du gentage trin 3,2-3.4, Erstatte frisk medium til stimulus), og fortsætte med at inkubere og udveksle efter behov.
- Exchange de flydende propper i perfusion kamre til vaskebuffer (Prelude Direct Lysis Module Buffer B) (dvs. du gentage trin 3,2-3,4, erstatte vaskebuffer for stimulus) og inkuberes efter behov (5 min).
- Exchange de flydende stik (vask buffer) til lyseopløsning (Prelude Direkte Lysis Modul Buffer A med 0,1% Pluronic F127 w / v) (dvs. du gentage trin 3,2-3,4, erstatte lyseopløsning for stimulus) og inkuberes efter behov (5 min) .
- Instruere sprøjtepumpens at sende de flydende propper (cellelysater) til DMF hub.
- Skil DMF hub, fjerne det øverste plade af DMF enheden (ved hjælp af pas på ikke at vippe pladen sidelæns, da dette kan resultere i dråbe blanding), og indsamle de lysaterne en Pipetman eller sprøjte for off-platform analyser (genekspressionsprofilering via qPCR).
5.. Clean Platform Hardware tilGenbrug
- Fordyb overførslen microcapillaries og CapTite fittings i 10% blegemiddel (v / v i vand) i 10 minutter ved stuetemperatur, skylles godt med deioniseret vand, og tør anvendelse af nitrogengas.
- Fordyb DMF enheden pladerne i 10% blegemiddel i 10 minutter ved stuetemperatur, skylles godt med isopropanol efterfulgt af deioniseret vand, og tør anvendelse af nitrogengas efterfulgt af bagning ved 160 ° C i 10 min.
- Sprøjten pumpens polycarbonat slanger og DMF enhedens polymer støbt og kompression frame, kan genbruges uden rengøring. Perfusionskammeret microcapillaries kasseres efter hvert eksperiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som en demonstration af den automatiske platform, brugte vi det til at gennemføre en undersøgelse, hvor små populationer af immunceller blev dyrket i mikro-skala kulturer udfordres med bakterier, og lyseret for off-platform analyse af pro-inflammatoriske responser (figur 2 ).
Hver af seks celle perfusion kamre blev podet med 10 4 immunceller (P388D.1 murine makrofager) resuspenderes i 10 pi vækstmedium. Efter en tilslutning periode (37 ° C i 2 timer) og et medium udveksling forblev ~ 500 celler fastgjort til de indre overflader af hvert kammer (fig. 3A), som målt ved analyse af gentagne mikroskala kulturer (celler frigivet via chelator behandling og tælles via hæmacytometer og lysmikroskopi). Yderligere inkubering ved 37 ° C i 16 timer, med medium udvekslinger på 2 hr intervaller, udvidet cellepopulationerne til ~ 1000 celler pr kammer (figur 3B) (som målt thru analyse af gentagne mikroskala kulturer, som beskrevet ovenfor). I fire af de seks perfusion kamre blev cellepopulationer udfordret med E. colibakterier (pHrodo biopartikler), resuspenderet i vækstmedium, og leveres ved en multiplicitet af infektion (MOI) på 20 (dvs. hver celle i populationen blev udfordret med 20 biopartikler, i gennemsnit). I de resterende to kamre, modtog cellepopulationer en mock udfordring (dvs. vækstmedium alene). Efter inkubation ved 37 ° C i 1 time (to bakterier-udfordret kulturer) eller 4 timer (to bakterier-udfordret, og to mock-udfordret, kulturer), blev cellerne vasket og lyseret, og lysaterne udvundet fra DMF hub. Konventionelle bench-skala metoder blev anvendt til at fremstille cDNA fra lysaterne og måle transkriptniveauer til inflammatoriske mediatorer: chemokiner MIP-1β (CCl4) og RANTES (CCL5), inducerbare cyclooxygenase COX-2 (PTGS2), og cytokin TNFa (TNF ).
Figur 4 sammenfatter resultaterne fra tre uafhængigt replikeret eksperimenter. Vi fandt, at immunceller dyrket og udfordret i mikro-skala kulturer (røde søjler) monteret pro-inflammatoriske transkriptionelle reaktioner, der var væsentlige identiske med dem fremkaldt i celler dyrket og udfordret i konventionelle kulturer (blå søjler). Desuden på-platform (mikro-skala) forsøg viste mindre variation (som angivet ved mindre fejllinjer) og forbrugt mindre mængder af celler og reagenser (tabel 1).
Figur 1. Fotografi af Automatiseret platform for mikroskala cellestimulering Experiments.
Figur 2. Overblik over en repræsentant Platform-aktiveret Eksperiment: Transcriptional Profilering af immunceller udfordret med Bakterier i mikroskala Cultures.
Figur 3. Fotografier af immunceller dyrket i en Micro-skala perfusionskammer. Murine makrofager (P388D.1 cellelinie) blev resuspenderet i vækstmedium i en koncentration på 10 6 celler / ml, og 10 pi (10 4 celler), der anvendes til frø en fibronectin -belagt microcapillary (perfusionskammer). Bright-field fotografierne blev taget ved hjælp af et MVX10 mikroskop (Olympus) udstyret med en CCD-kamera (Qimaging). For at måle befolkningens størrelse, blev celler fra replikere mikro-skala kulturer frigivet fra perfusionskammeret overflader ved hjælp af Cell Stripper, farves ved hjælp trypanblå, og tælles ved hjælp af en hæmacytometer og lys mikroskop. A. B. Efter 16 timer af kultur (inkubation ved 37 ° C med medium udvekslinger hver 2 timer) var befolkningen vokset til ~ 1.000 celler.
Figur 4.. Transkriptionelle Profiler af Immune celler dyrket og stimuleret med konventionelle fartøjer versus mikroskala Perfusion Chambers. Murine makrofager (P388D.1 cellelinie) blev resuspenderet i vækstmedium i en koncentration på 10 6 celler / ml. Ved konventionelle kulturer, blev 50 gl (5 x 10 4 celler), der anvendes til udsæd 150 pi vækstmedium i en brønd på en 96-brønds mikrotiterplade, for mikro-skala kulturer, 10 mikroliter (10 4 celler) blev anvendt til frø en fibronectin-belagt microcapillary (perfusionskammer). Efter inkubation ved 37 ° C i 16 timer blev cellerne (~ 5 x 10 4 pr konventionel kultur, ~ 10 3 pr mikro-skala kultur) udfordret med E. colibakterier (pHrodo biopartikler) ved en flerhed af infektion (MOI) på 20 (dvs. 20 biopartikler for hver celle i kulturen), negativ kontrol (mock-udfordrede) kulturer modtog kun friske medier. Efter yderligere inkubation ved 37 ° C i 1 eller 4 timer blev cellerne vasket og lyseret under anvendelse af reagenser fra Prelude Direkte lysis modul. Lysate RNA blev forstærket og omdannes til cDNA ved hjælp Ovation PicoSL WTA, større (≥ 200 nt) cDNA produkter renset ved hjælp Agencourt RNAClean XP og disse produkter, der anvendes som skabelon i TaqMan qPCR assays til at måle transkriptniveauer for MIP-1β (CCI4) RANTES (CCL5), COX-2-(PTGS2), og TNFa (TNF), samt GAPDH (til normalisering af cDNA niveauer mellem lysater). Hver qPCR assay blev udført i tre eksemplarer, og resultaterne beregnes. EaCH eksperiment blev uafhængigt gentaget tre gange. Bjælker angiver gennemsnitlige fold stigning i transkriptniveauer i konventionelle kulturer (blå) eller mikro-skala kulturer (rød) udfordret med bakterier, sammenlignet med negativ kontrol (mock-udfordrede) kulturer fejlsøjler angiver standardafvigelsen på tværs af de tre eksperimenter.
| Krav | Konventionel Experiment | Micro-Scale Experiment |
| Celler | 3.000.000 | 60.000 |
| Vækstmedium | 2,4 ml | 0,7 ml |
| Biopartikler | 200 ug | 4 ug |
| Wash & Lysis Reagenser | 300 pi hver | 60 ul hver |
Tabel 1. Krav til Konventionel versus Micro-Scale Cell Stimulation Experiments. numre er trukket fra repræsentativt eksperiment beskrevet i denne rapport (figur 2), hvor murine makrofager (P388D.1 cellelinje) blev dyrket i seks konventionelle (96 brønde mikrotiterplade) versus mikro-skalaen (perfusionskammer) kulturer , udfordret med E. colibakterier (pHrodo biopartikler) ved en MOI på 20, og lyseret til qPCR analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har udviklet en enkel og alsidig automatiseret platform for mikroskala cellekultur og stimulering eksperimenter. Platformen gør det muligt for os at arbejde med små mængder kultur og celle populationer (1 - 20 ul og 100 - 2.000 celler per kammer), kultur størrelser kunne yderligere reduceret ved brug af microcapillaries af mindre diameter. Arbejde på disse skalaer reducerer omkostningerne til rutinemæssige undersøgelser og gør gennemførlige undersøgelser, der kræver brug af ædle reagenser og / eller celler. Platform-gennemførte eksperimenter viser også mindre variabilitet, formentlig på grund af den præcision og reproducerbarhed med hvilke celler og væsker håndteres af den automatiske platform.
Den aktuelle konfiguration af platformen trækker celler og medier fra off-board reservoirer (mikrocentrifugerør eller mikrotiterpladebrøndene) til såning, ligevægt, og udvidelse af cellepopulationer i perfusion kamre. Dette er en enkel måde at løse misforholdet mellemvækstmediumprøver krav (f.eks 700 gl forbruges i repræsentativt eksperiment beskrevet ovenfor) og kapaciteten af DMF enheden er om bord reservoirer (24 pi hver). Men denne konfiguration nødvendiggør mid-eksperiment manuel intervention, for at skifte mellem to reservoirer (trin 1.6) og tilslut perfusion kamre DMF nav (trin 3.1). Fremtidige konfigurationer kunne omfatte stor kapacitet (fx 1 ml) om bord reservoirer, hvilket ville gøre det muligt for routing af alle materialer gennem DMF hub, hvilket eliminerer behovet for mid-eksperiment manuel indgriben.
Vores eksperimenter kræves kun kortvarig (<24 timer) dyrkning af celler på platformen. Vi har bekræftet, at cellelevedygtighed på platformen er sammenlignelig med konventionelle kulturer i mindst 24 timer (data ikke vist). Vi har imidlertid endnu ikke forsøgt at opretholde kulturer på platformen i længere perioder. Fordampning er ikke et stort problem, fordi platformensperfusion kamre og vækstmediumprøver reservoirer er delvist lukkede systemer, og de flydende propper dækker cellerne let genopfyldes via medium udveksling. På den anden side er det for at opretholde pH i langvarige kulturer kan være nødvendigt at huse de vækstmediumprøver reservoirer i en 5 - 10% CO2-atmosfære eller skifte til et vækstmedium, der ikke omfatter en CO 2-bicarbonat baserede pH-buffer . Desuden vil langvarig kultur aktivt delende celler udvide befolkningerne til det punkt sammenflydning (dvs. dækning af alle tilgængelige overflader inden perfusionskammeret), som ville nødvendiggøre passage af cellerne (release, vask, fortynde, og re-seed) . Andre har opnået dette i microfluidic regimer 3,5,6,9,17 og dens aktuelle konfiguration platformen bør være i stand til at udføre alle de nødvendige manipulationer. Sammenfattende forventer vi, at med beskedne modifikation (primært protokoller, snarere end hardware) vores platform bør være capable understøtte langsigtet pattedyrcellekultur. Dette synes en særligt lovende fremtidige retning, fordi konventionelle metoder er tidskrævende og arbejdskrævende, tilføje en langsigtet kultur evne til repertoire vores automatiske platform vil yderligere at sætte sine brugere til at omdirigere deres arbejdskraft mere produktivt.
Selvom vi har testet kun nogle få forskellige celletyper således langt (f.eks murine makrofag cellelinie RAW264.7, murine knoglemarv afledte makrofager (BMDM)), bør platformen kunne rumme praktisk talt enhver klæbende celletype. I nogle tilfælde kan det være nødvendigt at ændre perfusionskammeret belægning fra fibronectin til en anden ekstracellulær matrix-komponent (eller blanding af bestanddele), eller at ændre vækstmediet, men disse ændringer er lette at foretage. Arbejde med ikke-klæbende celletyper kunne være mere udfordrende, men celle tøjring strategier har været en succes i lignende sammenhænge 32-34. Det should også være muligt at skabe blandede kulturer bestående af flere celletyper, ja, bør den præcision, hvormed platformen håndterer celler og væsker sikre, at opførelsen af blandede kulturer er meget reproducerbar.
Med hensyn til stimuli, bør stort set ethvert stof, der kan transporteres i en vandig væske stik være foreneligt med vores platform 5,13,16,35. I tilfælde af store eller tætte partikler, som kan bundfældes med tiden, kan det være nødvendigt periodisk opblande dem inden for reservoirer i fortiden, har vi behandlet dette emne ved brug af high-density bærevæske 36 eller en simpel omrøring systemet (data ikke vist), løsninger, som skal være let at gennemføre på vores platform.
Hidtil har vores karakterisering af celler dyrket og stimuleret på platformen primært fokuseret på QRT-PCR-analyse af kendetegnende pro-inflammatoriske reaktioner. Som et næste skridt, omfattende analyse af tHan celle befolknings transkriptom (via DNA microarrays eller generation sekventering (SGS) (dvs. RNA-Seq 37,38)), er inden for rækkevidde, med beskeden ændring af cDNA forberedelse skridt bør vores platform og protokoller fuldt ud i stand til at understøtte global transkriptionelle profilering undersøgelser. Tilsvarende bør analyse af cellepopulationen responser på proteinniveauet (via ELISA, immunpræcipitation, massespektrometri eller protein microarrays) kun kræver modifikation af lysatet fremstillingstrin. Platformen understøtter også imaging-baseret analyse af celle respons. Celler kan afbildes i perfusionskammeret (f.eks figur 3), anvendelse af flade (snarere end afrundet) microcapillaries for perfusionskammeret modulet vil lette denne type analyse. Derudover kan celler afbildes på DMF nav 14,15, før podning af perfusion kamre og / eller efter frigivelse fra dem. Frigivne celler kan også blive afbildet ud afplatformen. Hidtil har vi brugt lys og fluorescens mikroskopi til billede celler på alle disse faser for at analysere deres morfologi, levedygtighed, formering sats, og fysiske samspil med stimuli (f.eks biopartikler) samt hinanden (data ikke vist). Mikroskopi bør også muliggøre analyse af metabolit indhold (vurderet ved anvendelse af fluorescerende farvestoffer), transkriptionel aktivitet (vurderet ved anvendelse af reporterkonstruktioner), og protein niveauer / lokalisering (vurderet ved anvendelse af reporter-konstruktioner, fluorescerende protein fusion figurer, og / eller immunocytokemi ). Frigivne celler kunne analyseres ved anvendelse af flowcytometri samt. Mange af disse analyser kunne udføres udelukkende på platformen i dens aktuelle konfiguration, mens andre vil kræve off-platform analyse eller integration af specialiserede mikrofluidik-baserede moduler (se f.eks Referencer 36,39-41) i platformen via forbindelse til DMF hub. Taget sammen, forekommer det sandsynligt that vores platform vil vise sig værdifulde i muliggør multi-dimensional analyse af små populationer af celler, som ellers kun kan opnås ved brug af meget komplekse og dyre robotsystemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne takker Ronald F. Renzi og Michael S. Bartsch for deres bidrag til udformning og udvikling af DMF enheder og DMF hub. Denne forskning var fuldt støttet af Laboratory Directed Forskning og Udvikling programmet på Sandia National Laboratories. Sandia er en multi-program laboratorium ledes og drives af Sandia Corporation, et helejet datterselskab af Lockheed Martin Corporation, for det amerikanske Department of Energy National Nuclear Security Administration under kontrakt DE-AC04-94AL85000.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Prelude Direct Lysis Module | NuGEN | 1400-24 | |
| Trypan Blue (0.4% w/v) | GIBCO | 15250-061 | |
| Cell Stripper | Cellgro | 25-056-C1 | |
| Ovation PicoSL WTA | NuGEN | 3310-048 | |
| Agencourt RNAClean XP | Beckman Coulter Genomics | A63987 | |
| pHrodo BioParticles | Invitrogen | P35361 | |
| CCL4 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443111_m1 | |
| CCL5 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm01302428_m1 | |
| PTGS2 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00478374_m1 | |
| TNF TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443258_m1 | |
| GAPDH TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm99999915_g1 | |
| Pluronic F127 | Sigma Chemical | 2594628 | |
| Fluorinert FC-40 | Sigma Chemical | 51142-49-5 | |
| Parylene C dimer | Specialty Coating Systems | 28804-46-8 | |
| Teflon-AF | DuPont | AF1600 | |
| Polyimide tape | ULINE | S-11928 | |
| Indium tin oxide (ITO) coated glass substrates | Delta Technologies | CB-40IN-1107 | |
| DMF hub Teflon-coated fused-silica microcapillaries | Polymicro Technologies | TSU100375 | |
| Perfusion chamber microcapillaries | Polymicro Technologies | TSP530700 | |
| Tubing and microcapillary fittings | Sandia National Laboratories | ||
| Polycarbonate tubing | Paradigm Optics | CTPC100-500-5 | |
| 8-port precision syringe pump equipped with 30 mm (500 μl capacity) syringes | Hamilton Company | 54848-01 | |
| Parylene-C vapor deposition instrument | Specialty Coating Systems | PDS 2010 Labcoter 2 | |
| High-voltage function generator | Trek | 615A-1 615-3 | |
| MVX10 microscope | Olympus | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) | |
| QIClick digital CCD camera | QImaging | QIClick-F-CLR-12 | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) |
References
- Young, E. W. K., Beebe, D. J. Fundamentals of microfluidic cell culture in controlled microenvironments. Chemical Society Reviews. 39, 1036-1048 (2010).
- Yeo, L. Y., Chang, H. C., Chan, P. P. Y., Friend, J. R.
- Zhang, B., Kim, M. C., Thorsen, T., Wang, Z. A self-contained microfluidic cell culture system. Biomedical Microdevices. 11, 1233-1237 (2009).
- Skafte-Pedersen, P., et al. A self-contained, programmable microfluidic cell culture system with real-time microscopy access. Biomedical Microdevices. 14, 385-399 (2012).
- Barbulovic-Nad, I., Au, S. H., Wheeler, A. R. A microfluidic platform for complete mammalian cell culture. Lab Chip. 10, 1536-1542 (2010).
- Zhou, Y., Pang, Y., Huang, Y. Openly Accessible Microfluidic Liquid Handlers for Automated High-Throughput Nanoliter Cell Culture. Analytical Chemistry. 84, 2576-2584 (2012).
- Wang, H. Y., Bao, N., Lu, C. A microfluidic cell array with individually addressable culture chambers. Biosensors and Bioelectronics. 24, 613-617 (2008).
- Cimetta, E., Cagnin, S., Volpatti, A., Lanfranchi, G., Elvassore, N. Dynamic culture of droplet-confined cell arrays. Biotechnology Progress. 26, 220-231 (2010).
- Hung, P. J., Lee, P. J., Sabounchi, P., Lin, R., Lee, L. P. Continuous perfusion microfluidic cell culture array for high-throughput cell-based assays. Biotechnology and Bioengineering. 89, 1-8 (2005).
- King, K. R., et al. A high-throughput microfluidic real-time gene expression living cell array. Lab on a Chip. 7, 77-85 (2007).
- Gómez-Sjöberg, R., Leyrat, A. A., Pirone, D. M., Chen, C. S., Quake, S. R. Versatile, fully automated, microfluidic cell culture system. Analytical Chemistry. 79, 8557-8563 (2007).
- Wheeler, A. R. Chemistry - Putting electrowetting to work. Science. 322, 539-540 (2008).
- Gong, J., Kim, C. J. All-electronic droplet generation on-chip with real-time feedback control for EWOD digital microfluidics. Lab Chip. 8, 898-906 (2008).
- Choi, K., et al. Integration of field effect transistor-based biosensors with a digital microfluidic device for a lab-on-a-chip application. Lab Chip. 12, 1533-1536 (2012).
- Barbulovic-Nad, I., Yang, H., Park, P. S., Wheeler, A. R. Digital microfluidics for cell-based assays. Lab Chip. 8, 519-526 (2008).
- Gentilucci, L., de Marco, R., Cerisoli, L. Chemical modifications designed to improve peptide stability: incorporation of non-natural amino acids, pseudo-peptide. 16, 3185-3203 (2010).
- Miller, E. M., Wheeler, A. R. A digital microfluidic approach to homogeneous enzyme assays. Anal. Chem. 80, 1614-1619 (2008).
- Jebrail, M. J., Bartsch, M. S., Patel, K. D. Digital microfluidics: a versatile tool for applications in chemistry, biology. 12, 2452-2463 (2012).
- Ng, A. H. C., Choi, K., Luoma, R. P., Robinson, J. M., Wheeler, A. R. Digital Microfluidic Magnetic Separation for Particle-Based Immunoassays. Analytical Chemistry. 84, 8805-8812 (2012).
- Sista, R. S., et al. Heterogeneous immunoassays using magnetic beads on a digital microfluidic platform. Lab Chip. 8, 2188-2196 (2008).
- Malic, L., Veres, T., Tabrizian, M. Biochip functionalization using electrowetting-on-dielectric digital microfluidics for surface plasmon resonance imaging detection of DNA hybridization. Biosens. Bioelectron. 24, 2218-2224 (2009).
- Malic, L., Veres, T., Tabrizian, M. Nanostructured digital microfluidics for enhanced surface plasmon resonance imaging. Biosens. Bioelectron. 26, 2053-2059 (2011).
- Jebrail, M. J., Wheeler, A. R. Digital microfluidic method for protein extraction by precipitation. Anal. Chem. 81, 330-335 (2009).
- Nelson, W. C., et al. Incubated protein reduction and digestion on an electrowetting-on-dielectric digital microfluidic chip for MALDI-MS. Anal. Chem. 82, 9932-9937 (2010).
- Mousa, N. A., et al. Droplet-scale estrogen assays in breast tissue, blood, and serum. Sci. Transl. Med. 1, 1ra2 (2009).
- Jebrail, M. J., et al. A digital microfluidic method for dried blood spot analysis. Lab Chip. 11, 3218-3224 (2011).
- Choi, K., Ng, A. H. C., Fobel, R., Wheeler, A. R.
- Jebrail, M. J., et al. Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing. J. Vis. Exp. (33), e1603 (2009).
- Thaitrong, N., et al. Quality Control of Next Generation Sequencing Library through an Integrative Digital Microfluidic Platform. , Submitted (2012).
- Shin, Y. J., Lee, J. B. Machine vision for digital microfluidics. Review of Scientific Instruments. 81, (2010).
- Thornton, M., Eward, K. L., Helmstetter, C. E. Production of minimally disturbed synchronous cultures of hematopoietic cells. BioTechniques. 32, 1098-1105 (2002).
- Huang, X., Dai, W., Darzynkiewicz, Z. Enforced adhesion of hematopoietic cells to culture dish induces endomitosis and polyploidy. Cell Cycle. 4, 801-805 (2005).
- Raje, M., et al. Charged nylon membrane substrate for convenient and versatile high resolution microscopic analysis of Escherichia coli & mammalian cells in suspension culture. Cytotechnology. 51, 111-117 (2006).
- Chatterjee, D., Hetayothin, B., Wheeler, A. R., King, D. J., Garrell, R. L. Droplet-based microfluidics with nonaqueous solvents and solutions. Lab Chip. 6, 199-206 (2006).
- Perroud, T. D., et al. Microfluidic-based cell sorting of Francisella tularensis infected macrophages using optical forces. Analytical Chemistry. 80, 6365-6372 (2008).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10, 57-63 (2009).
- Malone, J. H., Oliver, B. Microarrays, deep sequencing and the true measure of the transcriptome. BMC Biology. 9, (2011).
- Wu, M., et al. Microfluidically-unified cell culture, sample preparation, imaging and flow cytometry for measurement of cell signaling pathways with single cell resolution. Lab on a Chip. 12, 2823-2831 (2012).
- Srivastava, N., et al. Fully integrated microfluidic platform enabling automated phosphoprofiling of macrophage response. Analytical Chemistry. 81, 3261-3269 (2009).
- Herr, A. E., et al. Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 5268-5273 (2007).
