Summary
Мы разработали автоматизированную культуре клеток и допроса платформы для микро-масштабе экспериментов стимуляции клеток. Платформа предлагает простые, универсальный и точный контроль в выращивании и стимулирования небольших популяциях клеток и восстановление лизаты для молекулярного анализа. Платформа хорошо подходит для исследования, которые используют драгоценные клетки и / или реагентов.
Abstract
Изучение клеток в культуре (в пробирке анализа) предоставил важное понимание сложных биологических систем. Обычные методы и оборудование для анализа в пробирке хорошо подходят для изучения большого количества клеток (≥ 10 5) в миллилитре масштабе объемы (≥ 0,1 мл). Однако существует много случаев, когда это необходимо или желательно уменьшать размер культура сократить потребление интересующих клеток и / или реагенты, необходимые для их культуры, стимуляции или обработки. К сожалению, традиционные подходы не поддерживают точные и воспроизводимые манипуляции микро-масштабе культур и микрофлюидики основе автоматизированных систем в настоящее время являются слишком сложными и специализированными для рутинного использования в большинстве лабораторий. Чтобы решить эту проблему, мы разработали простой и универсальной технологической платформы для автоматизированного культуры, стимулирование и восстановление малых популяциях клеток (100 - 2000 клеток) в микро-масштабе объемс (1 - 20 мкл). Платформа состоит из набора фибронектина покрытием микрокапиллярах ("ячейки перфузии камеры"), в пределах которой микро-масштабе культур установлено, сохраняется, и стимулировали; цифровой микрофлюидики (ДМФ) устройство оснащено "передача" микрокапиллярах ("центрального узла »), который маршрутов клеток и реагентов к и от перфузии камеры; высокоточных шприцевой насос, который приводит транспортировки материалов между перфузии камеры и центральным узлом, и электронный интерфейс, который обеспечивает контроль над транспортировки материалов, которые скоординированы и автоматизированы с помощью заранее определенных сценариев. В качестве примера мы использовали платформу для облегчения изучения транскрипционной реакции, индуцируемые в иммунных клетках на заражение бактериями. Использование платформы позволило нам сократить потребление клетками и реагенты, свести к минимуму эксперимент до эксперимента изменчивость, и перенаправляют практический труд. Учитывая преимущества, что оно придает, а также его доступности и универсальности, оур платформа должна найти применение в самых различных лабораторий и приложений, а также оказаться особенно полезны в облегчении анализа клеток и стимулов, которые доступны только в ограниченных количествах.
Introduction
Изучение клетки поддерживали в культуре (в пробирке анализа) предоставил бесценный понимании фундаментальных принципов и молекулярных механизмов, регулирующих сложные биологические системы и здоровье человека. Обычных методов культуры, стимулирование, и сбор клеток для анализа, которые используют чашки Петри и планшеты для микротитрования, были разработаны для изучения больших популяций клеток (≥ 10 5) в миллилитре масштабе объемов культуры (≥ 0,1 мл). Тем не менее, есть много случаев, в которых только ограниченное количество клеток доступны (например, первичные клетки) или небольшой популяции клеток желательно (например, для уменьшения клетка-клетка изменчивость среди населения) или необходимых реагентов трудно получить или слишком дорого (например, очищенные клетки секретируемых факторов). Такие вопросы могут быть успешно решены путем масштабирования вниз культуре размера, который имеет дополнительное преимущество снижения потребления всехреагенты для анализа в 1,2 пробирке. К сожалению, обычные оборудование и методы, не поддерживают точные и воспроизводимые манипуляции микро-масштабе культур и микрофлюидики основе автоматизированных систем в настоящее время 3-11, слишком сложны и специализированные для рутинного использования в большинстве лабораторий.
В этом докладе мы описываем сборку и использование простой и универсальной технологической платформы для автоматизированного культуры, стимулирование и восстановление малых популяциях клеток (100 - 2000 клеток) в микро-масштабе объемы (1 - 20 мкл). Архитектура платформы (рис. 1) имеет модульную структуру: набор фибронектина покрытием микрокапиллярам ("ячейки перфузии камеры" модуль) служит в качестве площадки для установления, поддержания и стимулирования микро-масштабе культур и цифровые микрофлюидики (DMF ) 12,13 Устройство оснащено "передача" микрокапиллярам ("центральный узел" модуль) 14,15 маршрутах клеткии реагенты, и из перфузии камеры. DMF позволяет пользователю индивидуально адресации нескольких капель и одновременно изменить или изменить порядок манипуляций (т.е. перенастроить поездов обработки образцов) без изменения аппаратного устройства. Его огромную гибкость проявляется в его недавнее появление как ключевая технология в широком диапазоне применений, включая клеточную культуру 16,17, 18,19 ферментные тесты, иммунологические 20,21, 22,23 анализа ДНК, белков переработки, 24,25 и клинической обработки образца. 26,27 Наш центральный узел использует гибкость присущие ДМФА устройств, а также дополнительно усиливает его посредством добавления микрокапиллярных интерфейса, который предоставляет возможность осуществлять подмножество манипуляции (например, клеточная культура) в специализированных периферийных модулей, а не на устройстве ДМФА себя. Компартментализацией обработки поездов на этом пути также упрощает конструкцию плаTForm архитектуры (не нужно строить DMF устройство, которое может выполнять все этапы обработки) и облегчает его эволюцию как новые функции требуется (просто интегрировать новые периферийные модули по мере необходимости). Транспорт клеток и реагентов в пределах центрального узла обусловлен электросмачивания сил, возникающих при последовательной активации электродов в устройстве DMF 13,28; транспорта в, из и в пределах перфузии камеры питается от изменения давления порожденных высокоточных шприца насосе. Все эти жидкости движения управляется с помощью простой электронный интерфейс и автоматизирован посредством использования заранее определенных сценариев.
В качестве иллюстративного примера, мы демонстрируют использование платформы для изучения транскрипционной реакции, индуцируемые в иммунных клетках на заражение бактериями (рис. 2). Проведение этих экспериментов на платформе позволило нам работать с небольшим количеством клеток (~ 1000 в экспериментальныхТаль условие), свести к минимуму эксперимента до эксперимента изменчивости, экономии реагентов и перенаправить практический труд. Учитывая преимущества, что оно придает, а также его доступности и универсальности, эта платформа должна найти применение в самых различных лабораторий и приложений и быть особенно полезно в облегчении анализа клеток и стимулов, которые доступны только в ограниченных количествах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот общий протокол предназначен для поддержки применения платформы для самых разнообразных исследований; аспекты, характерные для представителем исследовании, описанном в этом докладе отделяются в скобках Фиг.2 иллюстрирует представитель исследований, проведенных с использованием протокола.. Следует отметить, что в протоколе, все "указания" команды автоматизированы посредством использования заранее определенных сценариев. Обратите внимание на то, что шаг 2 может осуществляться параллельно с этапом 1 (например, во время шагов 1.7 и 1.8), и этот шаг 2,1 часто обходили (потому узорные / покрытие пластин DMF устройства можно мыть и использовать повторно, см. шаг 5.2) .
1. Соберите и заполнения палат Сотовые перфузии
- Нанести на внутренней поверхности стерилизованных (автоклаве) микрокапиллярах (из кварцевого стекла; 679 мкм ОД, идентификатор 534 мкм, 15 см в длину) с фибронектином, посредством инструктирования шприцевой насос, чтобы привлечь стерильного раствора фибронектина (30 мкл 50 мкг / мл) в каждыймикрокапиллярных, инкубации (37 ° С в течение 2 часов), поручив шприцевой насос, чтобы вывести решение, и позволяя микрокапиллярам сухие (комнатной температуре (RT) в течение 6 ч).
- Подключите каждый фибронектина покрытием микрокапиллярных (перфузии камеры) для поликарбоната труб (диаметр 500 мкм, 100 мкм ID) и трубки к многоходовой шприцевой насос, используя CapTite гарнитуры (6 перфузии камеры, 8-портовый шприцевой насос).
- Использование ленты крепления кузова перфузия каждой камеры в нагревательный блок установлен на желаемую температуру (37 ° C).
- Погружают открытые концы перфузии камеры в резервуар (трубка microcentifuge или планшет для микротитрования а), содержащий клеток (P388D.1 мышиных макрофагах) суспендируют в свежей питательной среды (RPMI-1640, 10% FBS, 500 единиц / мл пенициллина, 500 мкг / мл стрептомицина) в необходимой концентрации (10 6 клеток / мл).
- Поручить шприцевой насос, чтобы привлечь клетки (10 мкл, 10 4 клеток) в каждую камеру перфузии последующим достаточно А.И.т, чтобы переместить жидкость пробка (~ 4,5 см), в секцию прикреплена к нагревательный блок.
- Разрешить клетки придерживаться фибронектина покрытием внутренних поверхностей перфузии камеры (37 ° C в течение 1 - 2 ч). В то же время передачи открытые концы перфузии камеры из резервуара клетки на новый резервуар, содержащий свежую среду роста.
- После присоединения периода инструктировать шприцевой насос для отправки жидкого пробки (кондиционированных сред и неприкрепленной клетки) в отходы, снять свежую среду (10 мкл), а затем с достаточно воздуха, чтобы расположить новую жидкость пробки (свежей среды) в течение придерживались клетках.
- Продолжайте выполнять средние обмены (т.е. повторите шаг 1.7) через регулярные промежутки времени (каждые 2 часа), пока клеточные популяции не является достаточно уравновешенной и расширенный (16 - 24 ч микро-масштабе культуры генерируется популяций ~ 1000 клеток / камера).
2. Изготовление DMF устройств и собрать Hub Architecture
- Использование металлических конструкций сжатие, зафиксировать ДМФА пластин в литой полимер 14,30 с углублениями, которые поддерживают 400 мкм расстояние между пластинами; этот интервал, в сочетании с размером приведение в действие электрод (2,5 мм 2), определяющий объем капли (2,5 мкл на электрод). Следует отметить, что ДМФ сборка может быть выполнена более простыми средствами 24.
- Вставка тефлоновым покрытием передачи микрокапиллярах (360 мкм ОД, 100 мкм идентификатор, 3,5 - 4,0 см) в пространство между пластинами ДМФА, позиционирование каждого распространяться на краю его родственные электрод приведения в действие.
- На противоположной END каждой передаче микрокапиллярных прикрепить CapTite Место.
- Включите электрические разъемы подачи напряжения на электроды ITO. Электрод последовательности активации автоматизированы путем использования управляемых компьютером электронный интерфейс работает заранее определенных сценариев.
- Дополнительно: Переместить собраны DMF ступицу на стадии поступательного микроскопом (SZ-6145TR (Olympus, Япония)), снабженный прибор с зарядовой связью (ПЗС) камеры (DCR-HC96 (Sony, Япония)) для облегчения отслеживания капель 31.
3. Подключите перфузии палат в Хаб DMF и стимулируют клеточные популяции
- Удалить открытые концы перфузии камеры из среды резервуар (см. шаг 1.6) и вставить их в CapTite фитинги, прикрепленные к концам передачи микрокапиллярах концентратора ДМФА (см. шаг 2.4).
- Поручить шприцевой насос для отправки жидкого пробки (кондиционированные среды) в перфузионной камеры для отходов.
- Ин-тruct концентратор ДМФА рисовать стимул (E.coli BioParticles в концентрации 100 мкг / мл в свежей среде с 0,1% Pluronic F127 вес / объем) от бортового резервуара и доставлять капли соответствующего размера (10 мкл) в каждой передаче микрокапиллярных . Бортовой резервуаров состоят из цилиндрических отсеков (1,5 х 1,5 см каждый) и подключенный к концентратору ДМФА через трубопровод.
- Поручить шприцевой насос, чтобы привлечь стимулом подключается к передаче микрокапиллярам, и следовать с достаточно воздуха, чтобы позиционировать пробки на клеточных популяций в перфузионной камеры.
- Инкубируйте клетки с стимула (37 ° С в течение 1 - 4 ч). Дополнительно: Обмен на свежий стимул (т.е. повторите шаги 3.2-3.4) на регулярной основе.
4. Завершить Стимуляция и восстановление клеточных лизатов анализа
- Необязательно: Если после периода стимуляции требуется, обменять стимул жидкости, содержащей разъемы для свежей средой (т.е. повторите шаги 3,2 - 30,4, заменяя свежую среду для стимула), и продолжают инкубировать и обменивать по мере необходимости.
- Биржа жидкости пробки в перфузионной камеры для промывочного буфера (буфера прелюдия Прямая модуль Лизис B) (то есть повторить шаги 3.2 - 3.4, заменяя промывочного буфера для стимула), и инкубируют при необходимости (5 мин).
- Биржа жидкости пробки (промывочный буфер) для лизирующего раствора (прелюдия Прямая буфера для лизиса модуль с 0,1% Pluronic F127 вес / об) (т.е. повторите шаги 3,2 - 3,4, заменяя лизирующего раствора для стимула), и инкубируют при необходимости (5 мин) .
- Поручить шприцевой насос для отправки жидкой пробки (клеточные лизаты) к ступице ДМФ.
- Разберите ступицу DMF, снимите верхнюю панель устройства DMF (используя осторожны, чтобы не наклонить пластину в сторону, так как это может привести к капле перемешивания), и собирать лизатов использованием Pipetman или шприц для офф-платформа анализа (профилирования экспрессии генов с помощью количественной ПЦР).
5. Чистый аппаратную платформу дляПовторное использование
- Погрузите передачи микрокапиллярам CapTite и арматуры в 10% отбеливателя (V / V в воде) в течение 10 минут при комнатной температуре, хорошо промыть деионизированной водой и сухой с использованием газообразного азота.
- Погружают ДМФА пластины в устройстве 10% отбеливателя в течение 10 мин при комнатной температуре, хорошо промыть изопропанол последующим деионизированной водой и сушат с использованием газообразного азота последующей выпечки при 160 ° С в течение 10 мин.
- Поликарбонатной трубки шприцевой насос, а полимер устройства ДМФА броска и сжатие кадра, могут быть повторно использованы без очистки. Перфузии камеры микрокапиллярам отбрасываются после каждого эксперимента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В качестве демонстрации автоматизированную платформу, мы использовали его для проведения исследования, в котором небольшие популяции иммунных клеток выращивали в микро-масштабе культур, зараженных бактериями, и лизируют для офф-платформа анализа про-воспалительных реакций (рис. 2 ).
Каждый из шести камер клетки перфузии засевали 10 4 иммунные клетки (P388D.1 мышиных макрофагах) ресуспендировали в 10 мкл среды для роста. После соблюдение периода (37 ° С в течение 2 час) и теплообменной среды, ~ 500 клеток остаются прикрепленными к внутренней поверхности каждой камере (фиг. 3А), измеренные с помощью анализа повторных микромасштабной культур (клетки, выпущенный через хелатирующий агент лечение и подсчитывали через гемацитометра и световой микроскопии). Далее инкубации при 37 ° С в течение 16 ч, со средним обмены с интервалом в 2 часа, расширенный клеточных популяций до ~ 1000 клеток на камеру (фигура 3В) (как измерено йГрубый анализ повторных микромасштабной культур, как описано выше). В четырех из шести камер перфузии, клеточные популяции зараженных E. бактерии кишечной палочки (pHrodo BioParticles), ресуспендировали в ростовой среде, и оглашено на множественности заражения (МВД) 20 (то есть каждая ячейка в популяции был брошен вызов с 20 BioParticles, в среднем). В остальных двух камер, клеточных популяций получили макет проблема (т.е. питательной среде только). После инкубации при 37 ° С в течение 1 часа (два бактерий вызов культуры) или 4 часов (два бактерий вызов, и два макета вызов, культуры), клетки промывают и лизируют, и лизаты восстановлены из ступицы ДМФ. Обычные лабораторные методы были использованы для подготовки кДНК из лизатов, а также измерять уровни транскриптов медиаторов воспаления: хемокинов MIP-1β (CCl4) и RANTES (CCL5), индуцибельным циклооксигеназы ЦОГ-2 (PTGS2) и цитокина ФНО (TNF ).
рисунке 4 приведены результаты трех независимо реплицировать экспериментов. Мы обнаружили, что иммунные клетки, выращенные и оспорены в микро-масштабе культур (красные полосы), установленный провоспалительных транскрипционные ответы, которые были в основном идентичны тем, которые вызвали в клетках, выращенных и оспорены в обычных культурах (синие полосы). Кроме того, на платформе (микро-масштабе) Эксперименты показали меньшую изменчивость (как указано меньше барах ошибка) и потребляется меньшее количество клеток и реагентов (табл. 1).
Рисунок 1. Фотография автоматизированная платформа для микро-масштабе Эксперименты стимуляции клеток.
Рисунок 2. Обзор представитель платформы с поддержкой Эксперимент: транскрипционный анализ профиля клеток иммунной заражали Бактерии в микро-масштабе культур.
Рисунок 3. Фотографии иммунных клеток, культивированных в микро-масштабе перфузии палаты. Мышиных макрофагов (P388D.1 линии клеток) ресуспендировали в ростовой среде при концентрации 10 6 клеток / мл, и 10 мкл (10 4 клеток) использовали для засева фибронектина покрытием микрокапиллярных (перфузии камеры). Светлое поле фотографии, сделанные с использованием MVX10 микроскопа (Olympus), оснащенных ПЗС-камерой (Qimaging). Для измерения численности населения, клетки от повторных микро-масштабе культур были освобождены из перфузии камеры поверхностей с помощью мобильного зачистки, окрашивали трипановым синим, и подсчет с использованием гемоцитометра и светового микроскопа. А. B. После 16 ч культуры (инкубации при 37 ° С при средние обмены каждые 2 ч), население расширился до ~ 1000 клеток.
Рисунок 4. Транскрипции Профили иммунных клеток, культивированных и вынужденное в обычных судах против микро-масштабе палат перфузии. Мышиных макрофагов (P388D.1 линии клеток) ресуспендировали в ростовой среде при концентрации 10 6 клеток / мл. Для обычных культурах, 50 мкл (5 × 10 4 клеток) использовали для засева 150 мкл питательной среды на лунку 96-луночного планшета для микротитрования; для микро-масштабе культур, 10 мкл (10 4 клеток) использовали для семян фибронектин покрытием microcapilЛари (перфузии камеры). После инкубации при 37 ° С в течение 16 часов, клетки (~ 5 × 10 4 на обычных культуры, ~ 10 3 в микро-масштабе культура) заражали E. бактерии кишечной палочки (pHrodo BioParticles) при множественности заражения (МВД) 20 (то есть, 20 BioParticles для каждой клетки в культуре); отрицательный контроль (макет вызов) культуры получили только свежую среду. После дальнейшей инкубации при 37 ° С в течение 1 и 4 ч клетки промывают и лизируют с использованием реагентов из прелюдия Прямая модуль лизиса. Лизата РНК усиливается и преобразуется в кДНК с использованием Ovation PicoSL ВТА, тем больше (≥ 200 нт) кДНК продукты очищали с использованием Agencourt RNAClean XP, и эти продукты используют в качестве матрицы в TaqMan анализы количественной ПЦР измерить уровни транскриптов MIP-1β (CCl4) RANTES (CCL5), COX-2 (PTGS2) и ФНО (ФНО), а также GAPDH (для нормализации кДНК уровнях между лизатов). Каждый анализ количественной ПЦР проводили в трех повторах, результаты усредняли. ЕаCH эксперимент самостоятельно повторяют три раза. Бары указывают среднее кратное увеличение уровней транскриптов в обычных культур (синий) или микро-масштабе культур (красный) заражали бактерий по сравнению с отрицательным контролем (макет вызов) культур; ошибок указывают стандартное отклонение по трем экспериментам.
| Требование | Стандартном эксперименте | Микро-масштабе эксперимент |
| Клетки | 3000000 | 60000 |
| Средний рост | 2,4 мл | 0,7 мл |
| BioParticles | 200 мкг | 4 мкг |
| Wash & Лизиса Реагенты | 300 мкл | 60 мкл каждого |
Таблица 1. Требования к Сопоставление общепринятой и микро-масштабе эксперимент Стимуляция сотовыхс. номера взяты от представителя эксперимента, описанного в этом отчете (рис. 2), в котором мышиных макрофагов (P388D.1 клеточной линии) выращивали в шести обычным (96-луночный планшет для микротитрования) по сравнению с микро-масштабе (перфузии камеры) культуры , зараженных E. бактерии кишечной палочки (pHrodo BioParticles) при МВД 20, и лизируют для количественной ПЦР анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы разработали простой и универсальной автоматизированной платформы для микро-масштабе культуре клеток и стимуляции экспериментов. Платформа позволяет нам работать с небольшими объемами культуры и клеточных популяций (1 - 20 мкл и 100 - 2000 клеток, в камере); культуры размеров может быть снижен за счет использования микрокапиллярам меньшего диаметра. Рабочие на этих масштабах снижает стоимость рутинных исследований и делает возможным исследованиях, связанных с использованием драгоценных реагентов и / или клеток. Платформа выполненных экспериментов также показывают меньше изменчивость, по-видимому из-за точность и воспроизводимость, с которой клетки и жидкости обрабатываются автоматизированной платформы.
Текущую конфигурацию платформы ничьих клетки и средств массовой информации из внебиржевых резервуаров (микроцентрифужные микротитровальные труб или планшета) для посева, уравновешивания и расширения клеточных популяций в перфузионной камеры. Это простой способ решения проблемы несбалансированности междупитательной среде требования (например, 700 мкл, потребляемой в репрезентативного эксперимента описано выше) и емкость устройства ДМФА это бортовой резервуаров (24 мкл каждый). Тем не менее, эта конфигурация требует середине эксперимента ручного вмешательства, для переключения между двумя резервуарами (шаг 1.6) и подключите перфузии камеры к концентратору DMF (шаг 3.1). Будущие конфигурации может включать большой емкости (например, 1 мл) бортовой резервуаров, что позволит маршрутизации всех материалов через концентратор ДМФА, тем самым устраняя необходимость в середине эксперимента ручного вмешательства.
Наши эксперименты необходимы только краткосрочные (<24 ч) культуре клеток на платформе. Мы проверили, что жизнеспособность клеток на платформе сравнима с таковой в обычных культур в течение по крайней мере 24 часов (данные не показаны). Тем не менее, мы еще не пытались поддерживать культур на платформе течение более длительных периодов времени. Испарение не является серьезной проблемой, так как платформыперфузии камеры и резервуары питательной среде частично закрытые системы и жидкой пробки покрытие клетки можно легко пополнить через теплообменной среды. С другой стороны, для поддержания рН в долгосрочных культурах это может быть необходимо для размещения резервуаров питательной среде в 5 - 10% CO 2 в атмосферу, либо перейти в ростовой среде, которая не включает CO 2 бикарбоната основе буфера, рН . Кроме того, долгосрочные культуры активно делящиеся клетки будет расширяться населения до точки слияния (т.е. покрытие всех доступных поверхностях внутри перфузии камеры), которая потребует пассажи клеток (релиз, мыть, развести, и повторно семян) . Другие добились этого в режимах микрожидкостной 3,5,6,9,17 и в его текущей конфигурации платформа должна быть в состоянии выполнять все необходимые манипуляции. Таким образом, мы ожидаем, что при скромной модификации (в первую очередь для протоколов, а не аппаратно) наша платформа должна быть Capable поддержки долгосрочного культуре клеток млекопитающих. Казалось бы, это считается самой перспективной в направлении, потому что обычные методы требуют больших затрат времени и трудоемких; добавления долгосрочных культуры возможность репертуаре наших автоматизированную платформу еще больше позволяют своим пользователям перенаправить их труд более продуктивно.
Хотя мы проверяли только несколько различных типов клеток до сих пор (например, мышиных клеточных линий макрофагов RAW264.7; мышиных костного мозга макрофагов (BMDM)), платформа должна быть в состоянии удовлетворить практически любой тип клеток приверженцем. В некоторых случаях может возникнуть необходимость изменить покрытие перфузии камеры от фибронектина с другой компонент внеклеточной матрицы (или смеси компонентов) или изменить ростовой среды, но эти модификации можно легко установить. Работа с неадгезивные типов клеток может быть более сложным, но стратегии ячейки привязывать добились успеха в подобных контекстах 32-34. Это шоУКГ также возможно создание смешанных культур состоит из нескольких типов клеток, более того, точность, с которой платформа обрабатывает клетки и жидкости должны гарантировать, что строительство смешанных культур является высокой воспроизводимостью.
Что касается стимулов, практически любое вещество, которое можно транспортировать в водном вилка жидкость должна быть совместима с нашей платформы 5,13,16,35. В случае больших или плотные частицы, которые могут осаждаться в течение долгого времени, это может быть необходимо периодически вновь суспендируют их в резервуарах, в прошлом, то эта проблема решается за счет использования высокой плотности несущей жидкости 36 или простым перемешиванием Система (данные не показаны), решений, которые должны быть легко реализовать на нашей платформе.
До сих пор нашей характеристики культивированных клеток и стимулировали на платформе в основном ориентируется на Qrt-PCR анализ отличительной чертой провоспалительных ответов. В качестве следующего шага, всесторонний анализ тОн транскриптома клеточной популяции (через ДНК-микрочипов или поколения последовательности (SGS) (то есть РНК-Seq 37,38)), находится в пределах досягаемости; со скромной модификации кДНК шаг подготовки, наши платформы и протоколы должны быть полностью способны поддерживать глобальную транскрипционные исследования профилирования. Кроме того, анализ ответов клеточной популяции на уровне белка (посредством ELISA, иммунопреципитации, масс-спектрометрии или белка микрочипов) должны требовать только изменение лизата шаги подготовки. Платформа также поддерживает изображения на основе анализа клеточных ответов. Клетки могут быть отображены в перфузии камеры (например, рисунок 3), использование плоской поверхностью (а не округлые) микрокапиллярам для модуля камеры перфузии бы содействовать проведению такого типа анализа. Кроме того, клетки могут быть отображены на ДМФА концентратор 14,15, перед посевом из перфузии камеры и / или после выхода из них. Выхода клетки также могут быть отображены оффплатформой. До сих пор мы использовали свет и флуоресцентной микроскопии изображение клетки на всех этих этапах, чтобы проанализировать их морфологии, выживаемости, пролиферации и физическое взаимодействие с раздражителей (например BioParticles) и друг с другом (данные не показаны). Микроскопия также следует включить анализ содержания метаболита (оценивается посредством использования флуоресцентных красителей), транскрипционной активности (оценивается посредством использования репортер конструкций), и белка / локализации (оценивается посредством использования репортер конструкций, флуоресцентные конструкции гибридного белка, и / или иммуноцитохимия ). Выхода клетки могут быть проанализированы с помощью проточной цитометрии, как хорошо. Многие из этих анализов могут быть осуществлены полностью на платформе в его текущей конфигурации, а другие требуют за пределы платформы анализа или интеграции специализированных микрофлюидики на основе модулей (например, см. Ссылку 36,39-41) в платформу через подключение к DMF концентратор. Взятые вместе, вполне вероятно, тшляпа нашей платформы окажется ценным в обеспечении многомерный анализ малых популяциях клеток, которые в противном случае могут быть достигнуты только с помощью очень сложных и дорогих робототехнических систем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Авторы благодарят Рональд Ф. Рензи и Майкл С. Барч за их вклад в проектирование и разработку устройств DMF и ступицей DMF. Это исследование было полностью поддерживается лаборатории, которой руководил научно-исследовательской программы в Sandia National Laboratories. Sandia является многопрофильным программы лаборатории управляется и эксплуатируется Sandia Corporation, дочерняя компания корпорации Lockheed Martin, для американского Министерства Национальной энергетической администрации по ядерной безопасности в рамках контракта DE-AC04-94AL85000.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Prelude Direct Lysis Module | NuGEN | 1400-24 | |
| Trypan Blue (0.4% w/v) | GIBCO | 15250-061 | |
| Cell Stripper | Cellgro | 25-056-C1 | |
| Ovation PicoSL WTA | NuGEN | 3310-048 | |
| Agencourt RNAClean XP | Beckman Coulter Genomics | A63987 | |
| pHrodo BioParticles | Invitrogen | P35361 | |
| CCL4 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443111_m1 | |
| CCL5 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm01302428_m1 | |
| PTGS2 TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00478374_m1 | |
| TNF TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm00443258_m1 | |
| GAPDH TaqMan qRT-PCR assay | Applied Biosystems | Mm99999915_g1 | |
| Pluronic F127 | Sigma Chemical | 2594628 | |
| Fluorinert FC-40 | Sigma Chemical | 51142-49-5 | |
| Parylene C dimer | Specialty Coating Systems | 28804-46-8 | |
| Teflon-AF | DuPont | AF1600 | |
| Polyimide tape | ULINE | S-11928 | |
| Indium tin oxide (ITO) coated glass substrates | Delta Technologies | CB-40IN-1107 | |
| DMF hub Teflon-coated fused-silica microcapillaries | Polymicro Technologies | TSU100375 | |
| Perfusion chamber microcapillaries | Polymicro Technologies | TSP530700 | |
| Tubing and microcapillary fittings | Sandia National Laboratories | ||
| Polycarbonate tubing | Paradigm Optics | CTPC100-500-5 | |
| 8-port precision syringe pump equipped with 30 mm (500 μl capacity) syringes | Hamilton Company | 54848-01 | |
| Parylene-C vapor deposition instrument | Specialty Coating Systems | PDS 2010 Labcoter 2 | |
| High-voltage function generator | Trek | 615A-1 615-3 | |
| MVX10 microscope | Olympus | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) | |
| QIClick digital CCD camera | QImaging | QIClick-F-CLR-12 | Optional (facilitates tracking of droplets on DMF hub) |
References
- Young, E. W. K., Beebe, D. J. Fundamentals of microfluidic cell culture in controlled microenvironments. Chemical Society Reviews. 39, 1036-1048 (2010).
- Yeo, L. Y., Chang, H. C., Chan, P. P. Y., Friend, J. R.
- Zhang, B., Kim, M. C., Thorsen, T., Wang, Z. A self-contained microfluidic cell culture system. Biomedical Microdevices. 11, 1233-1237 (2009).
- Skafte-Pedersen, P., et al. A self-contained, programmable microfluidic cell culture system with real-time microscopy access. Biomedical Microdevices. 14, 385-399 (2012).
- Barbulovic-Nad, I., Au, S. H., Wheeler, A. R. A microfluidic platform for complete mammalian cell culture. Lab Chip. 10, 1536-1542 (2010).
- Zhou, Y., Pang, Y., Huang, Y. Openly Accessible Microfluidic Liquid Handlers for Automated High-Throughput Nanoliter Cell Culture. Analytical Chemistry. 84, 2576-2584 (2012).
- Wang, H. Y., Bao, N., Lu, C. A microfluidic cell array with individually addressable culture chambers. Biosensors and Bioelectronics. 24, 613-617 (2008).
- Cimetta, E., Cagnin, S., Volpatti, A., Lanfranchi, G., Elvassore, N. Dynamic culture of droplet-confined cell arrays. Biotechnology Progress. 26, 220-231 (2010).
- Hung, P. J., Lee, P. J., Sabounchi, P., Lin, R., Lee, L. P. Continuous perfusion microfluidic cell culture array for high-throughput cell-based assays. Biotechnology and Bioengineering. 89, 1-8 (2005).
- King, K. R., et al. A high-throughput microfluidic real-time gene expression living cell array. Lab on a Chip. 7, 77-85 (2007).
- Gómez-Sjöberg, R., Leyrat, A. A., Pirone, D. M., Chen, C. S., Quake, S. R. Versatile, fully automated, microfluidic cell culture system. Analytical Chemistry. 79, 8557-8563 (2007).
- Wheeler, A. R. Chemistry - Putting electrowetting to work. Science. 322, 539-540 (2008).
- Gong, J., Kim, C. J. All-electronic droplet generation on-chip with real-time feedback control for EWOD digital microfluidics. Lab Chip. 8, 898-906 (2008).
- Choi, K., et al. Integration of field effect transistor-based biosensors with a digital microfluidic device for a lab-on-a-chip application. Lab Chip. 12, 1533-1536 (2012).
- Barbulovic-Nad, I., Yang, H., Park, P. S., Wheeler, A. R. Digital microfluidics for cell-based assays. Lab Chip. 8, 519-526 (2008).
- Gentilucci, L., de Marco, R., Cerisoli, L. Chemical modifications designed to improve peptide stability: incorporation of non-natural amino acids, pseudo-peptide. 16, 3185-3203 (2010).
- Miller, E. M., Wheeler, A. R. A digital microfluidic approach to homogeneous enzyme assays. Anal. Chem. 80, 1614-1619 (2008).
- Jebrail, M. J., Bartsch, M. S., Patel, K. D. Digital microfluidics: a versatile tool for applications in chemistry, biology. 12, 2452-2463 (2012).
- Ng, A. H. C., Choi, K., Luoma, R. P., Robinson, J. M., Wheeler, A. R. Digital Microfluidic Magnetic Separation for Particle-Based Immunoassays. Analytical Chemistry. 84, 8805-8812 (2012).
- Sista, R. S., et al. Heterogeneous immunoassays using magnetic beads on a digital microfluidic platform. Lab Chip. 8, 2188-2196 (2008).
- Malic, L., Veres, T., Tabrizian, M. Biochip functionalization using electrowetting-on-dielectric digital microfluidics for surface plasmon resonance imaging detection of DNA hybridization. Biosens. Bioelectron. 24, 2218-2224 (2009).
- Malic, L., Veres, T., Tabrizian, M. Nanostructured digital microfluidics for enhanced surface plasmon resonance imaging. Biosens. Bioelectron. 26, 2053-2059 (2011).
- Jebrail, M. J., Wheeler, A. R. Digital microfluidic method for protein extraction by precipitation. Anal. Chem. 81, 330-335 (2009).
- Nelson, W. C., et al. Incubated protein reduction and digestion on an electrowetting-on-dielectric digital microfluidic chip for MALDI-MS. Anal. Chem. 82, 9932-9937 (2010).
- Mousa, N. A., et al. Droplet-scale estrogen assays in breast tissue, blood, and serum. Sci. Transl. Med. 1, 1ra2 (2009).
- Jebrail, M. J., et al. A digital microfluidic method for dried blood spot analysis. Lab Chip. 11, 3218-3224 (2011).
- Choi, K., Ng, A. H. C., Fobel, R., Wheeler, A. R.
- Jebrail, M. J., et al. Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing. J. Vis. Exp. (33), e1603 (2009).
- Thaitrong, N., et al. Quality Control of Next Generation Sequencing Library through an Integrative Digital Microfluidic Platform. , Submitted (2012).
- Shin, Y. J., Lee, J. B. Machine vision for digital microfluidics. Review of Scientific Instruments. 81, (2010).
- Thornton, M., Eward, K. L., Helmstetter, C. E. Production of minimally disturbed synchronous cultures of hematopoietic cells. BioTechniques. 32, 1098-1105 (2002).
- Huang, X., Dai, W., Darzynkiewicz, Z. Enforced adhesion of hematopoietic cells to culture dish induces endomitosis and polyploidy. Cell Cycle. 4, 801-805 (2005).
- Raje, M., et al. Charged nylon membrane substrate for convenient and versatile high resolution microscopic analysis of Escherichia coli & mammalian cells in suspension culture. Cytotechnology. 51, 111-117 (2006).
- Chatterjee, D., Hetayothin, B., Wheeler, A. R., King, D. J., Garrell, R. L. Droplet-based microfluidics with nonaqueous solvents and solutions. Lab Chip. 6, 199-206 (2006).
- Perroud, T. D., et al. Microfluidic-based cell sorting of Francisella tularensis infected macrophages using optical forces. Analytical Chemistry. 80, 6365-6372 (2008).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10, 57-63 (2009).
- Malone, J. H., Oliver, B. Microarrays, deep sequencing and the true measure of the transcriptome. BMC Biology. 9, (2011).
- Wu, M., et al. Microfluidically-unified cell culture, sample preparation, imaging and flow cytometry for measurement of cell signaling pathways with single cell resolution. Lab on a Chip. 12, 2823-2831 (2012).
- Srivastava, N., et al. Fully integrated microfluidic platform enabling automated phosphoprofiling of macrophage response. Analytical Chemistry. 81, 3261-3269 (2009).
- Herr, A. E., et al. Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 5268-5273 (2007).
