Summary
Her beskriver vi en fænotypisk analyse, der gælder for high-throughput/high-content skærme af små-forstyrrende syntetisk RNA (siRNA), kemisk forbindelse, og Mycobacterium tuberkulose mutant biblioteker. Denne metode er baseret på påvisning af fluorescerende mærket Mycobacteriumtuberkulose i fluorescerende mærket værtscelle ved hjælp af automatiseret konfokal mikroskopi.
Abstract
På trods af tilgængeligheden af terapi og vaccine er tuberkulose (TB) fortsat en af de mest dødelige og udbredte bakterieinfektioner i verden. Siden flere årtier har den pludselige udbrud af multi- og ekstensivt resistente stammer er en alvorlig trussel for kontrollen med tuberkulose. Det er derfor vigtigt at identificere nye mål og veje, der er kritiske for det årsagsfremkaldende middel for tuberkulose, Mycobacteriumtuberkulose (Mtb), og at søge efter nye kemikalier, der kan blive TB-lægemidler. En metode er at etablere metoder, der passer til de genetiske og kemiske skærme i store biblioteker, der gør det muligt at søge efter en nål i en høstak. Til dette formål udviklede vi en fænotypisk analyse, der var afhængig af påvisning af fluorescerende mærket Mtb i fluorescerende mærkede værtsceller ved hjælp af automatiseret konfokal mikroskopi. Denne in vitro-analyse giver mulighed for en billedbaseret kvantificering af koloniseringsprocessen af Mtb ind i værten og blev optimeret til 384-brønds mikropladeformatet, hvilket er korrekt for skærme af siRNA-, kemisk forbindelses- eller Mtb mutantbiblioteker. Billederne behandles derefter til multiparametrisk analyse, som giver udlæsning af Mtb's patogenese i værtsceller.
Introduction
Blandt de nye og genopståede smitsomme patogener, der er rapporteret i løbet af de seneste år, har Mycobacteriumtuberkulose (Mtb) en fremtrædende plads som ansvarlig for 1,4 millioner dødsfald og 8,7 millioner nye infektioner i 2011 (Global tuberkuloserapport 2012, www.who.int/topics/tuberculosis/en/). På trods af tilgængeligheden af multidrug behandlinger, antallet af smittede mennesker er stadig stigende og multidrug resistente (MDR) samt omfattende resistente (XDR) Mtb er hurtigt breder sig over hele verden1. Desuden er det, når man tager hensyn til tilstedeværelsen af Mtb-antigener, tydeligt, at en tredjedel af den globale befolkning anses for at være latent inficeret af Mtb. Statistisk set er der i et tilfælde ud af ti udvikling i retning af sygdommens aktive form med efterfølgende kliniske symptomer2. Derfor er der et presserende behov for nye midler til at bekæmpe Mtb. I denne sammenhæng udviklede vi en in vitro visuel fænotypisk analyse, der var afhængig af overvågning af Mtb-invasion og multiplikation i værtsceller ved automatiseret konfokal fluorescensmikroskopi3. Tilpasningen af analysen i 384-brønds mikrotiterplader i kombination med automatiseret billederhvervelse og analyse tillod high-content/high-throughput Screening (HC/HTS) af mellemstore biblioteker af forbindelser, siRNA'er og bakteriede mutanter. Screeningen af et genom bredt RNAi bibliotek på denne fænotypiske analyse således gjort det muligt at identificere de vigtigste værtsfaktorer, der er involveret i Mtb handel og intracellulær replikation, men også belysning af værtsveje udnyttes af tuberkel bacillus. En anden tilpasning af denne særlige fænotypiske analyse var til identifikation af bakterielle faktorer, der er afgørende for Mtb intra-fagosomal persistens. For eksempel betragtes anholdelsen af fagadær modning som en af de vigtigste mekanismer, der letter overlevelse og replikation af Mtb i makrofag. Overvågning af subcellulær lokalisering af Mtb knock-out mutanter i fluorescerende mærkede syreholdige rum gjorde det muligt at identificere bakterielle gener, der er involveret i overlevelsesprocessen4. Endelig giver billeddannelsen af Mtb med højt indhold også en fremragende metode til at kvantificere lægemiddeleffektivitet til at hæmme forskellige fænomener som intracellulær bakterievækst3. Alt i alt giver denne type høj gennemløbsfenotypisk analyse mulighed for at fremskynde lægemiddelopdagelse mod TB, og de data, der indsamles af disse forskellige tilgange, bidrager til en bedre forståelse af værtsmanipulationen udøvet af Mtb.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Høj-gennemløb Genome-dækkende siRNA Screening
Screening udført i en human Type-II pneumocytes model A549 celle linje ved infektion med Mtb H37Rv udtrykke Grøn Fluorescerende Protein (GFP). Denne procedure er beskrevet i figur 1A.
- Genbrug det tørrede siRNA-bibliotek, der opbevares i moderplader (96-brøndsplader) med 1x siRNA-buffer for at nå en koncentration på 4 μM, og overfør derefter 10 μl af blandingen til en 384-brønd datterplade (datterplade 1).
- Der tilsættes 10 μl 1x siRNA-buffer i datterplade 1 for at fortynde siRNA med 2 gange. Efter siRNA-genopståning forsegles pladerne med aluminiumsforsegling, der kan skrælles, og kan opbevares ved -20 °C mindst 6 måneder og op til 2-3 år, men opbevaringstiden kan variere afhængigt af siRNA-biblioteksproducentens anbefalinger.
- Fortyndet siRNA'er i datterplade 1 i datterplade 2 for at nå en koncentration på 500 nM. Efter siRNA-genopståning forsegles pladerne med aluminiumsforsegling, der kan skrælles, og kan opbevares ved -20 °C mindst 6 måneder og op til 2-3 år, men opbevaringstiden kan variere afhængigt af siRNA-biblioteksproducentens anbefalinger.
- Før brug optøs datterplade 2 ved stuetemperatur.
- Tag 2,5 μl siRNA fra dattertallerken 2 og læg det i en 384-godt assay plade.
- I samme 384-brønds analyseplade i trin 1.5 tilsættes 2,5 μl negativ og positiv kontrol siRNA til deres respektive brønde.
- Transfektreagenset fortyndes i 1x D-PBS for at give tilstrækkelig opløsning til at give 0,1 μl transfektreagens i hver brønd og præincubat den fortyndede transfektureopløsning ved stuetemperatur i 5 min.
- Der tilsættes 7,5 μl af blandingen af transfekturereagens/PBS-opløsning til hver brønd i analysepladen og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Der tilsættes 40 μl A549-celler (1.500 celler/brønd), der er ophængt i RPMI 1640-medium suppleret med 10% føtalt kvægserum (FBS). Cellerne opbevares i en inkubationsperiode på 37 °C i en atmosfære, der indeholder 5 % CO2. Disse celler deler hver 24 timer, således omkring 12.000 celler er i brøndene tre dage efter transfekt.
- Vask en to uger gammel GFP-udtrykkende Mtb H37Rv kultur ud med D-PBS (fri for MgCl2 og CaCl2)ved centrifugering ved 4.000 x g i 5 minutter og kassér vaskene. Gentag dette trin 3x.
- Den bakteriel pellet suspenderes i 10 ml RPMI 1640 medium suppleret med 10% FBS og dekanteres i 1 time ved stuetemperatur for at tillade bakterielle aggregater til sediment.
- Opsamle det bakterielle supernatant og måle OD600 (OD600 skal være mellem 0,6-0,8) og GFP-fluorescens (RFU-værdi) ved hjælp af en mikropladelæser til bestemmelse af bakteriekoncentrationen. Ophængets titer beregnes ved hjælp af en referenceregressionslinje, der viser RFU-værdi = f (CFU-værdi), som var genereret før eksperimentet på en anden kultur, der var blevet udarbejdet under de samme betingelser. Forbered bakteriel suspension indeholdende 2,4 x 106 bakterier/ml, hvilket svarer til en mangfoldighed af infektion (MOI) på 5.
- Mediet fjernes i 384-brøndsanalysepladen, og der tilsættes 25 μl frisklavet bakteriel suspension.
- 384-brøndsanalysepladen inkuberes ved 37 °C i 5 timer i en atmosfære, der indeholder 5% CO2.
- Fjern mediet og vask forsigtigt cellerne med RPMI-medium suppleret med 10% FBS 3x.
- For at dræbe de resterende ekstracellulære bakterier skal cellerne behandles med 50 μl frisk RPMI-FBS-medium indeholdende 50 μg/ml amikacin ved 37 °C i 1 time i en atmosfære, der indeholder 5% CO2.
- Den mediumholdige amikacin fjernes, og der tilsættes 50 μl frisk RPMI-medium suppleret med 10% FBS. 384-brøndsanalysepladen inkuberes ved 37 °C i 5 dage i en atmosfære, der indeholder 5% CO2.
- Før erhvervelsen af billedet tilsættes 10 μl frisklavet 30 μg/ml DAPI i PBS (endelig koncentration 5 μg/ml) og inkuberes i 10 min ved 37 °C.
- Læg pladen i automatiseret konfokalt mikroskop.
Klik her for at se større billede. - Angiv eksponeringsparametrene. Optag DAPI-fluorescens ved hjælp af excitationslaser 405 nm med emissionsfilter 450 nm og GFP-fluorescens ved hjælp af excitationslaser 488 nm med emissionsfilter 520 nm.
Klik her for at se større billede.
Klik her for at se større billede. - Vælg brøndene og felterne i hver brønd, der skal anskaffes, som derefter kaldes layout- og underlayoutparametre.
Klik her for at se større billede.
Klik her for at se større billede. - Generer eksperimentfilen ved hjælp af parametrene fra trin 1.20 og 1.21, og kør den automatiske anskaffelse.
Klik her for at se større billede.
Klik her for at se større billede. - Overfør billeder til fjernserveren.
Klik her for at se større billede. - Vurder billeder ved hjælp af billedanalysesoftware. Registrer cellekerner fra DAPI-kanalen ved hjælp af kernedetektionsalgoritmen og bakterieområdet fra GFP-kanalen ved hjælp af algoritmen for pixelintensitetsegenskaber (Figur 4A).
Bemærk: Denne protokol er optimeret til at studere effekten af genhæmning på den intracellulære Mtb-vækst. Mtb er en langsom vækstbakterie, der deler hver 20. time under optimale forhold. Efter 5 dage efter infektion er mængden af ekstracellulær Mtb stadig lav i mangel af celle lysis og påvirkede ikke kvaliteten af analysen. Denne protokol skal optimeres med hensyn til længden af antibiotikabehandling og inkubationstid, der skal tilpasses siRNA-skærme ved hjælp af hurtigtvoksende bakterier som Mycobacteria smegmatis og Escherichia coli, der frigives i vid udstrækning og kan inficere nye celler.
2. Screening af forbindelser med høj gennemløb
Screening udført på Mtb H37Rv inficerede værtsceller. Denne procedure er beskrevet i figur 1B.
- Tø 384-godt moder plader, der indeholder den sammensatte bibliotek opløses i DMSO 100%. 0,5 μl af forbindelserne overføres i datterplader med 384 brønd, der indeholder 10 μl RPMI 1640 medium suppleret med 10% FBS.
- Vask en to uger gammel GFP-udtrykkende Mtb H37Rv kultur ud med D-PBS (fri for MgCl2 og CaCl2)ved centrifugering ved 4.000 x g i 5 minutter og kassér vaskene. Gentag dette trin 3x (For GFP-Mtb H37Rv kultur betingelser se protokol 3).
- Den bakteriel pellet suspenderes i 10 ml RPMI 1640 medium suppleret med 10% FBS og dekanteres i 1 time ved stuetemperatur for at tillade bakterielle aggregater til sediment.
- Opsamle det bakterielle supernatant og måle OD600 (OD600 skal være mellem 0,6-0,8) og GFP-fluorescens (RFU-værdi) ved hjælp af en mikropladelæser. Forskrænk titer for suspensionen ved hjælp af en referenceregressionslinje, der viser RFU-værdi = f (CFU-værdi), der var genereret før eksperimentet. Typisk koncentration er 1 x 108 bakterier/ml.
- Høst 6 dage gamle primære humane makrofager ved 4 x 105 celler/ml i RPMI 1640 medium suppleret med 10% føtalt kvægserum (FBS) og 50 ng/ml rekombinant human M-CSF (For humane perifere blodmoncytceller rensning og makrofager differentiering se protokol 4).
- De fortyndede primærceller inkuberes med bacilli ved forskellige MOI, fra 1-5, i suspension med mild rysten ved 90 omdrejninger i 2 timer ved 37 °C.
- Vask de inficerede celler ved centrifugering ved 350 x g for at fjerne de ekstracellulære bakterier. Efter hvert centrifugeringstrin blev pelleten genbrugt i RPMI 1640-mediet suppleret med 10% FBS. Gentag dette trin 2x.
- De inficerede celler suspenderes i RPMI 1640-medium suppleret med 10% FBS og amikacin ved 50 μg/ml, og suspensionen inkuberes med mild omrystning i 1 time ved 37 °C.
- Det cellekulturmedium, der indeholder amikacin, fjernes ved centrifugering ved 350 x g, og de inficerede celler vaskes med et komplet RPMI 1640-medium suppleret med 10% FBS og 50 ng/ml rekombinant human M-CSF. Gentag én gang.
- Der tilsættes 40 μl af de inficerede makrofager suspension i samme analyseplade i trin 2.1, som allerede indeholder 10 μl af de sammensatte fortyndinger. Den endelige koncentration af DMSO i hver brønd er nu nået op på 1%.
- Analysepladerne inkuberes i 5 dage ved 37 °C i en atmosfære, der indeholder 5 % CO2.
- Plette de levende celler med celle-permeant langt røde fluorescerende farvestof.
- Læg pladen i automatiseret konfokalt mikroskop.
Klik her for at se større billede. - Angiv eksponeringsparametrene. Optag langtrød fluorescens ved hjælp af excitationslaser 640 nm med emissionsfilter 690 nm og GFP-fluorescens ved hjælp af excitationslaser 488 nm med emissionsfilter 520 nm.
Klik her for at se større billede.
Klik her for at se større billede. - Vælg brøndene og felterne i hver brønd, der skal anskaffes, som derefter kaldes layout- og underlayoutparametre.
Klik her for at se større billede.
Klik her for at se større billede. - Generer eksperimentfilen ved hjælp af parametrene fra trin 2.14 og 2.15, og kør den automatiske anskaffelse.
Klik her for at se større billede.
Klik her for at se større billede. - Overfør billeder til fjernserveren.
Klik her for at se større billede. - Vurder billeder ved hjælp af billedanalysesoftware. Registrer celleområde fra langt rød kanal ved hjælp af algoritmen for pixelintensitetsegenskaber og bakterieområdet fra GFP-kanalen ved hjælp af algoritmen for pixelintensitetsegenskaber (Figur 4B).
Bemærk: Denne protokol kan tilpasses til screening af Mtb-mutantbiblioteker ved at erstatte forbindelser med mutanter, der udtrykker et fluorescerende protein (En brønd/en mutant) (Figur 1C, se også Brodin et al. 4). Fluorescerende mutanter sås først i brønde (20 μl bakteriel suspension pr. brønd). Bakterier genvindes derefter med 30 μl celleaffjedring. Efter centrifugering ved 350 x g i 1 min. inkuberes pladen ved 37 °C i en atmosfære, der indeholder 5% CO2. Inkubationstiden og MOI afhænger af analysen. Som et eksempel kan cellerne til visualisering af tidlige cellulære hændelser som fyagosomforsuring inficeres i 2 timer med MOI fra 1-20. Lysosomer farves ved hjælp af Lysotrackerfarve ved 2 μM i 1,5 timer ved 37 °C i en atmosfære, der indeholder 5% CO2 og derefter fastgøres med enten 10% formalin eller 4% paraformaldehyd (PFA). Konfokale billeder erhverves og analyseres til sidst ved hjælp af billedanalysescripts med passende algoritmer til lysosomerregistrering og subcellulær lokalisering4.
3. Grøn fluorescerende protein udtrykke Mycobacterium tuberkulose H37Rv (GFP-H37Rv) Kultur Betingelser
Til langtidsopbevaring blev GFP-H37Rv frosset i D-PBS (ca. 1 x 108 mycobakterier pr. hætteglas).
- Et frosset bouyl af GFP-H37Rv i en Erlenmeyer-kolbe, der indeholder 50 ml bouillonglas, der er tilsat Middlebrook OADC-berigelse 10%, Glycerol 0,5%, Tween-80 0,05% og Hygromycin B (50 μg/ml), genudsættes.
- 8 dage ved 37 °C.
- Mål OD600 af GFP-H37Rv-kulturen.
- GFP-H37Rv-kulturen fortyndes for at opnå OD600 = 0,1 i frisk bouillon med 7H9 bouillon suppleret med Middlebrook OADC-berigelse 10%, Glycerol 0,5%, Tween-80 0,05% og Hygromycin B (50 μg/ml).
- GFP-H37Rv inkuberes ved 37 °C i yderligere 8 dage, før analysen anvendes.
4. Humane perifere blod monocytceller rensning fra fuldblods eller Buffy-coat Forberedelse
- Blodposen fortyndes 2x i 1x D-PBS (fri for MgCl2 og CaCl2),der indeholder 1% FBS.
- Monocytterne isoleres ved Ficoll-massefyldeforløbsdrifugering ved 400 x g i 20 min.
- Saml de isolerede monocytter.
- Monocytterne vaskes 3x med 1x D-PBS (fri for MgCl2 og CaCl2),der indeholder 1% FBS ved centrifugering ved 400 x g i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Koncentrer cellerne op til 1 x 107 celle/ml.
- Rens monocytter ved hjælp af CD14-magnetiske perler i henhold til producentens protokol (se Materialer).
- Efter rensning af CD14-monocytter frø cellerne ved 1,5 x 106 celle/ml i RPMI 1640 suppleret med 10% FBS og 40 ng/ml human Makrofager Colony Stimulerende Faktor (hM-CSF) og inkuberet i 4 dage ved 37 °C i en atmosfære, der indeholder 5% CO2.
- Efter 4 dage erstattes mediet med frisk RPMI 1640 suppleret med 10% FBS og 40 ng/ml hM-CSF og inkuberes i 2 dage ved 37 °C i en atmosfære, der indeholder 5% CO2.
- Efter 6 dage kan cellerne bruges til analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SiRNA-screening for høj gennemstrømningsgenom
Mtb er i stand til at kolonisere immunceller in vitro samt flere andre lunge epitelceller. For eksempel er Mtbi stand til at inficere og beskadige A549 epitelceller, der almindeligvis bruges som model for human type II pneumocytter5-7. Dectin-1 blev rapporteret som en værtscellereceptor involveret i Mtb-optagelse, proinflammatorisk respons og antibakteriel effekt på intracellulær mycobakteriel vækst i A549-celler8. siRNA-betingelse, der er beskrevet i protokol 1, førte til 85 % af lyddæmpningseffektiviteten (data vises ikke). Silencing Dectin-1 udtryk med siRNA førte til et fald i intracellulær mycobakterier mængde i A549 celler. Efter 3 dages lyddæmpning og 5 dages infektion reduceres procentdelen af inficerede celler to gange i Dectin-1-1-bragte A549-cellerne til tavshed sammenlignet med celler, der er transfected med ikke-målfyldt scramble siRNA (Figur 2A og 2B). Vi anvendte prøvebaseret normalisering af siRNA målrettet Dectin-1 sammenlignet med kamp for at definere Z-score. Som vist i figur 2Copnåede vi et Z-score gennemsnit omkring -15 for siRNA målrettet Dectin-1. Dectin-1 kan bruges som positiv kontrol for siRNA skærmen for at opdage andre nye vært faktor, der er involveret i Mtb kolonisering i pneumocytter, der kunne have samme fænotype som med Dectin siRNA. Brugen af et siRNA, der påvirker fænotypen som kontrol på hver mikroplade under skærmen, gør det muligt at normalisere hver plade, hvilket er nyttigt, når man ønsker at udføre hele genomskærmanalyse. Den statistiske parameter Z' var 0,1 ved hjælp af kontrolbaseret normalisering på scramble og siRNA målrettet Dectin1, hvilket er en acceptabel værdi for valideringen af siRNA-screeningsdataene.
Screening af forbindelser med højt indhold
Sammensatte effektivitet på intracellulære bakterielle vækst evalueres ved at etablere en dosis respons kurve (DRC) og normaliseres til referencen positive sammensatte og negative sammensatte opløsningsmiddel kontrol. Den repræsentative Drc for to referenceforbindelser, isoniazid (INH) og rifampicin (RIF), der er aktive over for Mtb-væksten, er vist i figur 3. Disse kurver opnås i humane primære makrofager inficeret med en GFP-udtrykkende Mtb H37Rv stamme, med udlæsning efter 5 dage efter infektion. DMSO og INH ved en endelig koncentration på henholdsvis 1% og 0,1 μg/ml anvendes almindeligvis som negative og positive kontroller, der giver basale effektivitetsniveauer (0 og 100%) (Figur 3A). Efter den billedanalyseproces, der er beskrevet i figur 4B, udtrækkes multiparametriske data fra konfokale fluorescensbilleder af inficerede menneskelige makrofager taget af automatiseret konfokalt mikroskop. Aktive forbindelser, der påvirker den intracellulære replikation af Mtb i værtsceller, førte til et fald i mycobakteriel belastning, hvilket svarer til GFP-signalets område i celler på billeder (Figur 3B). Forholdet mellem intracellulært bakterieområde og samlet celleareal, beregnet ved hjælp af billedbaseret analysesoftware, afbildes i funktion af sammensatte koncentration, som genererer Den Demokratiske Republik Congo (Figur 3B). Disse kurver gør det muligt at bestemme både den koncentration, der kræves for at reducere bakteriebelastningen med 50% (IC50),og den minimale koncentration, der kræves for at hæmme 99% af bakteriel replikation (MIC99) (Figur 3C). Z' baseret på kontrol DMSO 1%, og kontrol INH 0,1 μg/ml var 0,49. Denne Z', virkelig tæt på 0,5, er acceptabelt at validere denne analyse.
Figur 1. Visuelle screeningsmetoder med højt indhold. Skematisk repræsentation af Mtb-infektionsmodelsystem, der anvendes til skærmene siRNA (A), kemiske forbindelser (B) og Mtb mutanter (C). (A) siRNA bibliotek skærm: cellerne blev transfected med siRNA i 3 dage i 384-brønd plader ved hjælp af omvendt transfection metode. siRNA transfected celler blev inficeret med GFP-Mtb og inkuberet i 5 dage ved 37 °C i en atmosfære, der indeholder 5% CO2. Cellerne blev derefter farvet og billeder blev indsamlet ved hjælp af en automatiseret konfokal mikroskop. (B) Forbindelser bibliotek skærm: forbindelserne blev fordelt i 384-brønd plader. Celleaffjedring ogGFP-Mtb blev inkuberet sammen i 2 timer ved 37 °C. Inficerede celler blev seedet i pladerne og inkuberet i 5 dage ved 37 °C i en atmosfære, der indeholder 5% CO2. Cellerne blev derefter farvet og billeder blev indsamlet ved hjælp af en automatiseret konfokal mikroskop. (C) Fluorescerende-Mtb mutant bibliotek: den fluorescerende Mtb mutanter blev seedet i 384-brønd plader og værten celle suspension blev distribueret. Inkubationstiden varierede afhængigt af analysen. Cellerne eller cellulære vesikler blev farvet før automatiseret billederhvervelse. Klik her for at se større billede.
Figur 2. Dectin-1 lyddæmpning virkninger på Mtb kolonisering i A549 celler. (A) Repræsentative konfokale billeder (10X luftlinse) af A549-celler, der er transfected med ikke-målende siRNA (scramble) eller med siRNA, der er specifik for Dectin-1 og inficeret med GFP-Mtb H37Rv (MOI5) i 5 dage. Skalalinjen repræsenterer 200 μm (A) GFP-Mtb H37Rv blev visualiseret i grønt og cellerne i rødt. Antallet af celler(A. Celledetektering) og den intracellulære GFP-Mtb H37Rv-belastning(A. Bakterielt område) blev bestemt ved hjælp af billedbaseret analysesoftware. (B) Grafisk repræsentation af procentdelen af inficerede A549-celler i 5 replikater (w1 til w5) af Scramble siRNA (blå cirkler) og Dectin-1 siRNA (røde cirkler). (C) Grafisk repræsentation af Z-score gennemsnit af Scramble siRNA og Dectin-1 siRNA. (*** p-værdi < 0,0001). Klik her for at se større billede.
Figur 3. Dosisresponskurve for aktive referenceforbindelser mod Mtb i humane makrofager. (A og B) Repræsentative konfokale billeder (20X vandlinse) af humane makrofager (rød, celle mærket med rødt fluorescerende farvestof) inficeret med GFP-Mtb H37Rv (grøn) med en MOI1 i 5 dage. Skalalinjen repræsenterer 50 μm. (A) Billeder af inficerede celler inkuberet med DMSO 1%, der anvendes som negativ kontrol i analysen. (B) Billeder af inficerede celler, der inkuberes med stigende koncentration af to referenceforbindelser isonazid (INH) og rifampicin (RIF). (C) Dosisresponskurver (DRC) for INH og RIF. Billedbaseret analyse gjorde det muligt at bestemme Den Demokratiske Republik Congo for hver testet forbindelse. DRC repræsenterer forholdet mellem intracellulært GFP-bakterieområde og samlet celleareal (Y-akse) i funktion af den sammensatte koncentration (logskala, x-akse). I hver graf blev den demokratiske republik Congo af forbindelsen normaliseret til den negative kontrol DMSO 1% (0% hæmning) og den positive kontrol INH i en koncentration på 0,1 μg/ml (100% hæmning). For hver forbindelse blev den koncentration, der kræves for at hæmme 50% af bakteriekoloniseringen (IC50), og den minimale hæmmende koncentration (MIC99)beregnet ud fra Den Demokratiske Republik Congo. Klik her for at se større billede.
Figur 4. Standard billedbaseret analyse til bestemmelse af fluorescerende intracellulære mycobakterier. Billeder fra 384-brøndsplader blev erhvervet ved hjælp af et automatiseret konfokalt mikroskop. I dette tilfælde blev der optaget 4 forskellige billeder af den samme brønd (felter). Hvert felt blev derefter analyseret ved hjælp af billedbaseret analysesoftware Acapella 2.6 (Perkin Elmer). (A) Hvert felt indeholdt to kanaler (to farver), en for bakterierne (grøn) og en for cellekernerne (blå kanal), der blev segmenteret ved hjælp af følgende algoritme: i) kernedetektion ved hjælp af en indbygget Acapella-procedure ii) detektion af cytoplasma, baseret på kernepopulationen, ved hjælp af en indbygget Acapella-procedure, iii) bakteriedetektion ved kun at holde pixel, hvis intensitet er højere end en manuelt defineret tærskel, iv) fusionerende cellers position med bakteriers position til at identificere inficerede celler. De endelige resultater, udtrykt som et gennemsnit af de fire felter, er det samlede bakterieområde, det samlede antal celler, procentdelen af inficerede celler og bakterieområdet pr. celle (gennemsnit af alle inficerede celler). (B) Hvert felt indeholdt to kanaler, en for bakterierne (grøn kanal) og en for cellekernerne og cytoplasmaet (langt rød kanal), der blev segmenteret ved hjælp af følgende algoritme: i) filtrering af den oprindelige kanal ved hjælp af et anti-medianfilter ii) kun at holde pixels, hvis intensitet er højere end en manuelt defineret tærskel (hver kanal har sin egen tærskel), iii) tælle det resterende antal pixel for hver kanal, iv) fusionerende kanaler og tælle antallet af pixel, der deles af både bakterier og kerner for at kvantificere intracellulære bakterier. De endelige resultater, udtrykt som et gennemsnit af de fire felter, er det samlede bakterieområde, det samlede celleareal, det samlede areal af intracellulære bakterier og forholdet mellem intracellulært bakterieområde og det samlede celleareal. Klik her for at se større billede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver her de metoder, der kræves for en fænotypisk analyse ved hjælp af en GFP-udtrykkende Mtb H37Rv-stamme for at inficere fluorescerende mærkede værtsceller, hvilket gør det hensigtsmæssigt for skærme med højt indhold/høj gennemløb. Denne protokol kan anvendes på en bred vifte af forbindelser, fluorescerende sonder og Mtb mutanter. For hver protokol, der er beskrevet ovenfor, kan fikserings- og immunolabelingstrin udføres inden billederhvervelse. Vi bruger et automatiseret fluorescerende konfokalt mikroskop udstyret med en 20X (NA 0.70) eller 60X (NA 1.2) vandlinse til at erhverve billeder. Konfokale mikroskop er udstyret med 405, 488, 561 og 640 nm excitation lasere. Den udsendte fluorescens opfanges ved hjælp af 3 kameraer, der er forbundet med et sæt filtre, der dækker en detektionsbølgelængde fra 450-690 nm. Det er vigtigt at bemærke, at justeringen af mikroskopudslip og emissionsindstillinger afhænger af den type farvestoffer eller fluorkrome, der anvendes i hvert forsøg. For fænotypiske assays anvendes DAPI eller Hoechst almindeligvis ved 5 μg/ml i 10 minutter til pletkerner. Celler kan dog også farves med forskellige fluorescerende farvestoffer, der er specifikke for påvisning af cytoplasma, membran eller cytoskeleton. Efter billederhvervelse skal billeder analyseres ved hjælp af en billedbaseret analysesoftware. Cellesegmenteringsalgoritmer baseret på intensiteten af hver pixel bør anvendes til henholdsvis at fastslå antallet af celler eller det intracellulære bakterieområde (se figur 4). De genererede data bør afvejes i forhold til et statistisk baseret acceptkriterium for at validere analysens robusthed og nøjagtighed.
Store skærme med høj overførselshastighed er tids- og ressourcekrævende eksperimenter. Derfor er det af største betydning på forhånd at vurdere analysens egnethed. De data, der blev indsamlet fra fænotypiske skærme, blev visualiseret ved hjælp af regnearkssoftware som Excel og generelt normaliseret pr. plade. De mest almindelige kvalitetsmålinger, der bruges til både siRNA- og småmolekyleskærme, er Z. Z defineres med middelværdi og standardafvigelse for både positive og negative kontroller9. Z kvantificerer, om analysen svar er stor nok til at validere sin ansøgning om en fuld-skala skærm af prøver. Rækkevidden af Z er negativ uendelig til 1, med >0,5 som en meget god analyse, >0 en acceptabel analyse og <0 en uacceptabel analyse. Sammenlignet med de små molekyleskærme, for hvilke styringens styrke gør det muligt at validere analysen med Z > 0,5, påvirker variationen af siRNA-skærme Z, som har tendens til at være lavere (ofte mellem 0,0-0,5)10. SiRNA-skærmenes succes afhænger faktisk af optimeringen af i) effektiviteten af siRNA-levering i cellerne, ii) den cytotoksicitet, der fremkaldes af transfekten, og iii) analysen af effektiviteten af genhæmning. SiRNA kan nemt transfected i forskellige cellelinjer, såsom HeLa, efter producentens transfekt protokol, men effektiv siRNA transfection i nogle cellelinjer, herunder makrofager stadig en udfordring. Ikke desto mindre kan viral vektor-medieret udtryk for korte hårnåle RNA (shRNA) repræsentere et godt alternativ11. For at undgå fortolkningsvanskeligheder normaliseres de data, der indsamles fra siRNA-skærme, ofte i forhold til den normale standardfordeling for at definere Z-scoren (også kaldet Z-værdi) for hvert punkt10,12. Derefter blev hit-prøver rangeret i henhold til Z-score, som typisk tilhører mindre end -2 eller mere end +2. Endelig blev udvalgte hits på den primære skærm testet igen på en sekundær skærm, herunder flere replikater for at bekræfte den fænotype, der blev observeret på den primære skærm.
Vores protokol kunne nemt anvendes til små skærme med udstyr. For at opnå dette er der brug for analyse miniaturisering i mikro-titerpladerne og manipulation af bibliotek af molekyler for at optimere processen med bevarelse, udlevering og blanding13. Desuden anbefales det at bruge en automatiseret robotplatform, herunder dispensere, for præcist og reproducerbart at kontrollere analyseforholdene i mikroti titerpladerne. Den enorme mængde data, der produceres ved screening af høj overførselshastighed (HTS), bør også forvaltes via database og en tilpasset pipeline til billedanalyse af konfokale billeder, datalagring og overførsel. De analysemetoder, der præsenteres i denne rapport, blev udført i biosikkerhedsniveau 3-faciliteten (BSL3). Den strenge overholdelse af sikkerheden i BSL3 øger skærmens sværhedsgrad. Faktisk skal der være meget udstyr til rådighed til skærmene i BSL3, som skal isoleres for at beskytte arbejdstageren og miljøet mod kontaminering. Derfor krævede installationen af den tilpassede rørledning i BSL3 meget plads. Af denne grund blev vores protokol udviklet til at have et maksimum af trin udført BSL3 som siRNA transfection og sammensatte overførsel til pladerne. Celleinfektionen gennem billederhvervelsestrin blev udført i BSL3-forhold. Billederne blev derefter overført i en dedikeret server og analyseret ud af BSL3.
Den fænotypiske analyse, der er beskrevet her, var baseret på to metoder til billedanalyse (Figur 4). Den første metode, der blev brugt til siRNA-screening, var designet til at give antallet af inficerede celler. Denne parameter blev fundet til effektivt at sammenligne effekten af genhæmning på Mtb intracellulær replikation. Ved screening af forbindelser var en mere grundlæggende udlæsning baseret på det samlede celleareal imidlertid tilstrækkelig til klart at identificere aktive forbindelser. Da denne anden metode er hurtigere og lettere at implementere, blev den foretrukket til analyse af billeder, der stammer fra blandingsscreening. For at gå videre, mere fluorescerende farvestoffer og / eller mærkning sonder kunne tilføjes og billedanalyse scripts kunne optimeres til at generere multiparametriske data såsom kolocalization, kerner og celle morfologi, celledød, bakteriel sammenlægning, samt intracellulær handel med bakterier. Det er vigtigt at bemærke, at for intracellulær handel eller colocalization assays, er det vigtigt at få Z-stakke for at anvende en kumulativ vurdering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Den finansielle støtte til dette arbejde blev ydet af Det Europæiske Fællesskab (ERC-STG INTRACELLTB Grant nr. 260901, MM4TB Grant nr. 260872), Agence Nationale de Recherche, Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) og Regionen Nord Pas de Calais. Vi anerkender taknemmeligt den tekniske bistand fra Gaspard Deloison, Elizabeth Werkmeister, Antonino Bongiovanni og Frank Lafont fra platformen BICeL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µclear-plate black, 384-well | Greiner Bio-One | 781091 | 127.8/86/15 MM with Lid, TC treated |
| CellCarrier 384-well plate | PerkinElmer | 6007550 | Black, Clear Bottom, with Lid, TC treated |
| V-bottom white, 384-well plate | Greiner Bio-One | 781280 | |
| sealing tape, breathable, sterile | Corning | 3345 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | Transfection reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 34943 | |
| RPMI 1640 + GlutaMAX-I | Life Technologies | 61870-010 | Cell culture medium |
| D-PBS 1x [-]MgCl2/[-]CaCl2 | Life Technologies | 14190-094 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| D-PBS 1x [+]MgCl2/[+]CaCl2 | Life Technologies | 14190-091 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 2610040-79 | |
| Ficoll Paque PLUS | Dutscher | 17-1440-03 | Ficoll for Peripherical Blood Monocyte Cells purification |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi | 130-050-201 | Purification of CD14+ Monocytes |
| Human M-CSF, premium gr. (1000 μg) | Miltenyi | 130-096-493 | Macrophage Colony Stimulating Factor |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | Columns for CD14+ Monocytes isolation |
| Tween 80 | Euromedex | 2002-A | Mycobacteria culture |
| Glycerol high purity | Euromedex | 50405-EX | Mycobacteria culture |
| Middlebrook OADC enrichment | Becton-Dickinson | 211886 | Mycobacteria culture |
| 7H9 | Becton-Dickinson | W1701P | Mycobacteria culture |
| Versene 1x | Life Technologies | 15040033 | Nonenzymatic cell dissociation solution |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | Nuclei dye |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Nuclei dye |
| Syto60 | Life Technologies | S11342 | Nuclei/cytoplasm dye |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT5014 | Cell fixation solution |
| siRNA targeting Dectin-1 | Santa-Cruz | sc-63276 | |
| *siGenome* Nontargeted siRNA pool | Dharmacon | D-001206-14 | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | antibiotic |
| Isoniazid (INH) | Sigma-Aldrich | I3377-50G | antibiotic |
| Hygromycin B | Life Technologies | 10687-010 | antibiotic |
| Amikacin | Sigma-Aldrich | A1774 | antibiotic |
| Automated Confocal Microscope OPERA | PerkinElmer | Image acquisition | |
| Columbus 2.3.1 Server Database | PerkinElmer | Data transfer, storage, and analysis | |
| Acapella 2.6 software | PerkinElmer | Image-based analysis | |
| GraphPad Prism5 software | GraphPad | Statistical analysis | |
| Excel 2010 | Microsoft | Statistical analysis |
References
- Gandhi, N. R., et al. Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis: a threat to global control of tuberculosis. Lancet. 375, 1830-1843 (2010).
- Barry, C. E., et al. The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies. Nat. Rev. Microbiol. 7, 845-855 (2009).
- Christophe, T., Ewann, F., Jeon, H. K., Cechetto, J., Brodin, P. High-content imaging of Mycobacterium tuberculosis-infected macrophages: an in vitro model for tuberculosis drug discovery. Future Med. Chem. 2, 1283-1293 (2010).
- Brodin, P., et al. High content phenotypic cell-based visual screen identifies Mycobacterium tuberculosis acyltrehalose-containing glycolipids involved in phagosome remodeling. PLoS Pathog. 6, (2010).
- Bermudez, L. E., Goodman, J. Mycobacterium tuberculosis invades and replicates within type II alveolar cells. Infect. Immun. 64, 1400-1406 (1996).
- Dobos, K. M., Spotts, E. A., Quinn, F. D., King, C. H. Necrosis of lung epithelial cells during infection with Mycobacterium tuberculosis is preceded by cell permeation. Infect. Immun. 68, 6300-6310 (2000).
- McDonough, K. A., Kress, Y. Cytotoxicity for lung epithelial cells is a virulence-associated phenotype of Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun. 63, 4802-4811 (1995).
- Lee, H. M., Yuk, J. M., Shin, D. M., Jo, E. K. Dectin-1 is inducible and plays an essential role for mycobacteria-induced innate immune responses in airway epithelial cells. J. Clin. Immunol. 29, 795-805 (2009).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat. Methods. 6, 569-575 (2009).
- Carralot, J. P., et al. Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure. J. Biomol. Screen. 14, 151-160 (2009).
- Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J. Biomol. Screen. 16, 775-785 (2011).
- Song, O. R., et al. Confocal-based method for quantification of diffusion kinetics in microwell plates and its application for identifying a rapid mixing method for high-content/throughput screening. J. Biomol. Screen. 15, 138-147 (2010).
