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Summary
Qui si descrive un metodo per infliggere cranico chiuso lesione cerebrale traumatica (TBI) in Drosophila. Questo metodo fornisce un gateway per studiare i meccanismi cellulari e molecolari che sono alla base delle patologie TBI utilizzando la vasta gamma di strumenti sperimentali e le tecniche disponibili per le mosche.
Abstract
Lesione cerebrale traumatica (TBI) colpisce milioni di persone ogni anno, causando perdita di valore di fisico, cognitivo, e funzioni comportamentali e la morte. Gli studi che utilizzano Drosophila hanno contribuito importanti passi avanti nella comprensione dei processi neurologici. Così, con l'obiettivo di comprendere le basi cellulari e molecolari di patologie TBI negli esseri umani, abbiamo sviluppato il dispositivo High Impact Trauma (HIT) di infliggere alla testa chiusa TBI in mosche. Le mosche sottoposte alla visualizzazione fenotipi dispositivo HIT coerenti con TBI umana, come incapacità temporanea e progressiva neurodegenerazione. Il dispositivo HIT utilizza un meccanismo a molla per spingere basato mosche contro la parete di una fiala, causando danni meccanici al cervello mosca. Il dispositivo è economico e facile da costruire, il suo funzionamento è semplice e rapida, e produce risultati riproducibili. Di conseguenza, il dispositivo HIT può essere combinato con strumenti sperimentali esistenti e tecniche per mosche per affrontare fondamentaledomande su TBI che possono portare allo sviluppo di strumenti diagnostici e terapie per TBI. In particolare, il dispositivo HIT può essere utilizzato per eseguire schermi genetici su larga scala per comprendere la base genetica di patologie TBI.
Introduction
Lesione cerebrale traumatica (TBI) è definita come lesioni al cervello da una forza meccanica esterna. Più comunemente, i risultati TBI da forze testa chiusi quali forze smussati e accelerazioni inerziali e decelerazione che causano il cervello per colpire l'interno del cranio. Negli Stati Uniti, si stima che 50.000 persone muoiono ogni anno per TBI e 2,5-6.500.000 individui vivono con le conseguenze del trauma cranico, tra cui debilitante fisico, cognitivo, e problemi comportamentali 1,2. Le conseguenze del trauma cranico non solo a causa di infortuni meccanici primari al cervello, ma anche per le lesioni cellulari e molecolari secondari al cervello e altri tessuti che si verificano nel corso del tempo 3-5. Lo sviluppo di approcci per diagnosticare e trattare TBI ha dimostrato di essere difficile, perché TBI è un processo patologico complesso. La variabilità delle lesioni primarie, la fisiologia umana, e fattori ambientali si traduce in eterogenei i secondarionjuries e patologie. Fattori variabili esistenti includono la gravità della lesione primaria, il tempo tra lesioni primarie ripetitive, e l'età e il genotipo dell'individuo. Capire come ogni fattore variabile contribuisce alle conseguenze di trauma cranico è probabile che per aiutare nello sviluppo di approcci per diagnosticare e trattare TBI 6,7.
Qui si descrive un metodo per infliggere testa TBI chiuso in Drosophila melanogaster (moscerino della frutta) che può essere utilizzato per delineare il contributo dei fattori variabili per le conseguenze del trauma cranico. Il metodo si basa su una prima osservazione che intensamente colpire il lato di un flaconcino cultura mosca contro il palmo di una mano causato wild-type vola a diventare temporaneamente inabili, un probabile conseguenza di TBI. Così, abbiamo costruito il Trauma (HIT) dispositivo ad alto impatto di ricapitolare le forze di accelerazione e decelerazione dall'azione incisiva mano. Un film ad alta velocità mostra che un singolo colpo dallaHIT dispositivo fa sì che vola a contattare il muro flacone più volte con la loro testa e il corpo 8. In una certa misura, tutti i contatti sono suscettibili di causare il cervello mosca per rimbalzare e deformare contro la capsula testa, simile a quanto accade per gli esseri umani in cadute e incidenti stradali 9. Di conseguenza, mosche trattato con il display fenotipi dispositivo HIT coerenti con lesioni cerebrali, tra cui incapacità temporanea seguita da atassia, graduale recupero della mobilità, cambiamenti di espressione genica nella testa, e la progressiva neurodegenerazione nel cervello 10. Così, il dispositivo HIT consente di studiare TBI utilizzando l'enorme arsenale di strumenti e tecniche sviluppate per mosche sperimentali.
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Protocol
1. Costruzione del dispositivo di HIT
- Fissare la molla alla scheda utilizzando due morsetti e quattro viti (Figura 1A). Centrare i morsetti relativi alla larghezza della tavola e allineati l'uno con l'altro con il filo morsetto esterno con il bordo della scheda. Prima di collegare i morsetti, piegarli con una pinza per adattarsi perfettamente durante la primavera.
NOTA: Vedi Tabella 1 per le descrizioni dei materiali necessari per la costruzione del dispositivo HIT. L'estremità bloccato della molla deve essere 1/8 di pollice (3,2 mm) dal bordo della tavola, e l'estremità libera sia estesa al bordo da 3/4 di pollice (19 mm). Regolare la molla in modo che risulti parallelo alla lunghezza della tavola. - Avvolgere l'estremità libera della molla una volta intorno con il nastro adesivo di loop velcro. Il bordo esterno del velcro deve essere a filo con l'estremità della molla. Il Velcro è importante perché è utilizzato per fissare il flacone per la molla creDELL'INDICE DI un raccordo a compressione stretto. Il Velcro consente inoltre una facile connessione e la rimozione di fiale, permettendo molte fiale da trasformare in un breve periodo di tempo.
- Mettere il coperchio del contenitore di ghiaccio a testa in giù, al centro, a contatto con la tavola di legno. Orientare la zona in rilievo del coperchio del contenitore di ghiaccio tale che il lato lungo è parallelo alla larghezza della tavola. Si noti che la zona in rilievo della benna di ghiaccio è di 1/2 di pollice (13 mm) più alto del bordo di legno, in modo che quando una fiala è collegato alla molla la molla non sarà piatte sul bordo.
- Scorrere l'intero dispositivo contro un oggetto fisso, ad esempio un muro, in modo che il coperchio del contenitore di ghiaccio si incunea tra la scheda e l'oggetto e non si muove.
- Nastro il goniometro carta sul fondo del cartone vola vassoio fiala e basamento sul bordo contro la lunghezza della tavola in modo che il marchio di 90 ° sia allineata con la molla quando viene tirato indietro ad una posizione perfettamente verticale.
2.Il funzionamento del dispositivo di HIT
- Luogo tra 1 e 60 CO 2 -anesthetized vola in una fiala vuota e tappo del flacone con un batuffolo di cotone aderente.
- Confinare linea al fondo 1 pollice (2,5 cm) del flaconcino spingendo il batuffolo di cotone nel flaconcino finché è 1 pollice (2,5 cm) dal fondo. E 'utile a tracciare una linea sul flacone al segno 1 pollice (2,5 cm). Si noti che confinare mosche a regioni più grandi o più piccoli della fiala può influenzare la gravità dei fenotipi.
- Attendere 5 minuti per le mosche di recuperare la mobilità della CO 2. Si noti che non è noto se 5 min è sufficiente per eliminare completamente gli effetti di CO 2.
- Inserire l'estremità della molla nel flaconcino finché il bordo interno del Velcro è a filo con la parte superiore della fiala (Figura 1B). Quando la molla è disteso, 1 pollice (2,5 centimetri) del flaconcino deve sovrapporsi regione rialzato del coperchio del secchiello del ghiaccio. Fiale possono essere riutilizzati mogni volta.
- Stando seduti, tenere il flaconcino in corrispondenza della zona in velcro con il pollice e l'indice della mano sinistra. Tenere il bordo stretto al banco con la mano destra. In alternativa, utilizzare C-morsetti per tenere la scheda stretto al banco.
- Tirare la molla perfettamente dritto torna all'angolazione desiderata. Rilasciare la molla. Lasciare che la primavera a venire ad un arresto completo.
- Rimuovere la fiala dal primavera e consentire in linea di recuperare per ≥5 min. Sottoporre linea ad un altro sciopero o trasferire le mosche per una fiala con la mosca cibo.
NOTA: Una varietà di saggi possono essere utilizzati per valutare gli effetti fenotipici dei colpi dal dispositivo HIT. Ad esempio, gli effetti sulla longevità può essere determinato analizzando la percentuale di mosche che sopravvivono a volte dopo la lesione, effetti sulla morfologia cerebrale può essere determinata mediante analisi istologica della testa, e gli effetti sulla espressione genica può essere determinata mediante l'analisi quantitativa dei livelli di mRNA 10. - Determine effetti del procedimento non dovuti ad attacchi trattando identicamente linea di controllo che non sono soggette a colpi. Indossare protezione acustica perché l'impatto della fiala contro il coperchio del contenitore di ghiaccio produce un forte rumore.
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Representative Results
Siamo interessati a capire il motivo per cui le mosche muoiono poco dopo la lesione primaria. Per quantificare la morte, abbiamo determinato l'indice di mortalità in 24 ore (MI 24), che è la percentuale di mosche che sono morti entro 24 ore della lesione primaria. Mosche sottoposti a colpi dal dispositivo HIT sono state incubate a 25 ° C in una fiala con fly cibo, e il numero di mosche morte è stato contato dopo 24 ore. Abbiamo usato questo approccio per identificare fattori che influenzano il MI 24 verificando che il MI 24 non è influenzata dal numero di mosche in una fiala (10 e 60 in linea è stato testato), il tempo tra colpi ripetuti (da 1 a 60 min stata testata ), o il sesso del volo 10. Al contrario, abbiamo scoperto che l'età al momento della lesione primaria e il genotipo ha influenzato il MI 24. Mosche più anziani ha avuto un MI alto 24 di mosche più giovani, e le mosche di diversi genotipi avevano significativamente diversi MI 24 s.
In figura 2, Abbiamo testato se la gravità della lesione primaria colpisce il MI 24. Per modificare la gravità della lesione primaria, si devia la molla ad angoli differenti. Per ogni punto di vista, fiale di entrambi 0-7 o 20-27 giorni di età w 1118 mosche (un ceppo di laboratorio standard) sono stati sottoposti a quattro colpi con 5 minuti tra scioperi. Tre fiale di 60 mosche sono stati esaminati per ogni angolo. Mosche sono stati trasferiti in fiale con melassa cibo, incubate a 25 ° C, e il numero di mosche morte è stato contato dopo 24 ore. L'errore medio MI 24 e standard della media è stata calcolata per ciascun angolo. Questi dati rivelano che più grandi angoli di flessione, vale a dire., Più gravi lesioni primarie, si traducono in una maggiore MI 24 di piccoli angoli di flessione, vale a dire., Lesioni meno gravi. Questo è stato osservato per entrambe le vecchie mosche 0-7 e 20-27 al giorno. Inoltre, in accordo con Katzenberger et al. 10, 20-27 giorni di età fli ha avuto un significativamente più alto MI 24 di 0-7 giorni di età mosche ad angoli ≥50 °. Quindi, questi dati indicano che a più età il MI 24 correla con la gravità della lesione primaria.
Figura 1:. Schema del dispositivo HIT (A) Illustrazione della vista dall'alto del dispositivo HIT in posizione di riposo. (B) Illustrazione della vista laterale del dispositivo HIT. La molla è mostrato nella posizione di riposo (rosso scuro) e deviato a 90 ° (luce rossa).
Figura 2:. Gravità lesioni primario è correlata con il MI 24 Abbiamo determinato la MI 24 per 0-7 giorni di età w
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Discussion
Il metodo dispositivo HIT si distingue da altri metodi che infliggono lesione traumatica in linea dal fatto che essa provoca cranico chiuso piuttosto che penetrante TBI 11. Inoltre, il metodo di dispositivo HIT richiede meno tempo, fatica e abilità per infliggere TBI in molte mosche, in modo che il metodo è più suscettibili di altri metodi agli schermi genetici su larga scala. Infine, il fatto che le lesioni primarie inflitte dal dispositivo HIT non si limitano al cervello è un limite e un vantaggio. Si tratta di una limitazione in quanto sono necessari ulteriori studi per valutare se fenotipi sono dovuti a lesioni traumatiche al cervello o altre parti del corpo. D'altra parte, politrauma (lesione traumatica più parti del corpo) spesso accompagna TBI e si pensa a modulare fenotipi TBI, in modo che il metodo di dispositivo HIT può essere utilizzato per studiare il contributo dei politraumi a fenotipi TBI. Il modello mosca TBI ha anche vantaggi rispetto ai roditori e modelli TBI di primati non umani
Questo protocollo descrive la costruzione e il funzionamento del dispositivo di HIT, che è stato progettato per infliggere testa TBI chiuso in mosche. Abbiamo utilizzato il dispositivo HIT in combinazione con il MI 24 </ Sub> test per studiare la morte organismal seguente TBI 7. Tuttavia, il modello di TBI mosca può essere usato in molti altri modi per comprendere la morte e altre conseguenze di TBI. Ad esempio, le conseguenze fisiche della TBI può essere misurata mediante saggi per parametri quali l'arrampicata o il volo, e le conseguenze comportamentali della TBI può essere misurato con test per parametri quali il sonno e l'apprendimento e la memoria 10,12-14. Effetti strutturali sul cervello possono essere determinate utilizzando tecniche di imaging come la immunofluorescenza e microscopia elettronica a trasmissione. Effetti molecolari sul cervello possono essere determinate con saggi genomici come l'RNA-Seq o analisi di proteomica, come la spettrometria di massa. Effetti genetici sul cervello possono essere determinati utilizzando approcci quali atterramento gene condizionale e sovraespressione. Effetti ambientali sulle conseguenze di trauma cranico possono essere determinati da diverse pre- o post-infortunio parametri quali la temperatura di incubazione e la dieta o parametri diil dispositivo HIT come l'angolo di deflessione della molla o il tempo tra colpi ripetuti. Infine, il dispositivo HIT può essere utilizzato per schermi genetici su larga scala per affrontare questioni fondamentali come ad esempio perché le conseguenze di TBI sono peggiori nei soggetti anziani rispetto individui giovani, nonché per droga schermi di grandi dimensioni che possono essere utilizzati per identificare i trattamenti per le conseguenze di TBI.
Se utilizzato in modo coerente, abbiamo trovato che il dispositivo HIT produce fenotipi riproducibili tra esperimenti e gli utenti indipendenti. I parametri che possono influenzare la riproducibilità sono la messa a punto e il funzionamento del dispositivo di HIT. Fenotipi possono essere significativamente influenzati da piccole variazioni della posizione del coperchio del contenitore di ghiaccio rispetto al bordo, la posizione del batuffolo di cotone nella patta flaconcino, e la posizione del flacone rispetto al velcro. Inoltre, come mostrato nella Figura 2, fenotipi possono essere notevolmente influenzati da piccoli cambiamenti nellaangolo di deflessione primavera. Pertanto, i nuovi utenti del dispositivo HIT dovrebbero essere controllati per assicurare che il set-up ed il funzionamento sono identici a quelli degli altri utenti. Noi abitualmente calibrare nuovi utenti facendoli determinano l'MI 24 di 0-7 giorni di età w 1118 mosche. Infine, il dispositivo HIT non deve essere identico a quello descritto nel protocollo. Ci aspettiamo che la maggior parte del dispositivo HIT possono essere modificati, pur mantenendo la capacità di infliggere TBI in mosche.
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Disclosures
Noi non abbiamo conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health sovvenzione, R01 AG033620 (BG) e di Robert Draper Technology Innovation Funding (DAW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zinc plated compression spring | The Hillman Group | 540189 | 9 7/8 inch (length, 2.2 cm), 15/16 inch (outer diameter, 2.4 cm), 0.12 inch (wire size, 0.3 cm) |
| Wooden board | 9 inch (length, 22.9 cm), 6.5 inch (width, 16.5 cm), 0.75 inch (height, 1.9 cm) | ||
| Clamps | Sigma Electrical Manufacturing Corporation | 49822 | 3.10 inch (length, 7.9 cm), 0.68 inch (width, 1.7 cm), 1.11 inch (height, 2.8 cm), EMT Two Hole Straps, click on type for 1 inch (2.5 cm) steel EMT conduit |
| Loop half of self-adhesive velcro | 3 inch (length, 7.6 cm), (3/4 inch width, 1.9 cm) | ||
| Polyurethane ice bucket cover | Fisher Scientific | 02-591-45 | 9 1/8 inch (length, 23.2 cm), 9 1/8 inch (width, 23.2 cm), 1 1/4 inch (height, 3.2 cm) |
| Plastic fly vials | Applied Scientific | AS-510 | 3 11/16 inch (height, 9.4 cm), 1 1/16 inch (inner diameter, 2.7 cm), 1 1/8 inch (outer diameter, 2.9 cm) |
| Large cotton balls | Fisher Scientific | 22-456-883 | |
| Paper protractor | 10 inch (diameter, 25.4 cm) |
References
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Tags
Neuroscienze Numero 100,Erratum
Formal Correction: Erratum: A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila
Posted by JoVE Editors on 07/14/2015.
Citeable Link.
An author's name was corrected in the publication of A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila. The second to last author's was spelled incorrectly. It has been updated from:
Barry Ganetky
to:
Barry Ganetzky
