Summary
Presenteras här är en enkel metod för isolering och flödescytometrisk analys av gliom-infiltrerande perifera mononukleära blodkroppar som ger tidsberoende kvantitativa uppgifter om antal och aktiveringsstatus av immunceller som förs in i hjärnans tidiga tumörmikro.
Abstract
Vårt laboratorium har nyligen visat att naturliga mördarceller (NK) är i stånd att utrota ortotopiskt implanterade mus GL26 och rått CNS-1 maligna gliom snart efter intrakraniell inympning om cancercellerna göres bristfälliga i sin expression av β-galaktosid-bindande lektin galektin -1 (gal-1). Senare arbete visar nu att en population av Gr-1 + / CD11b + myeloidceller är avgörande för detta ändamål. För att bättre förstå de mekanismer som NK och myeloidceller samarbetar för att ge gal-1-brist tumöravstötnings vi har utvecklat en omfattande protokoll för isolering och analys av gliom-infiltrerande perifera mononukleära blodceller (PBMC). Metoden demonstreras här genom att jämföra PBMC infiltration i tumören mikromiljö av gal-1-uttryckande GL26 gliom med de renderade gal-1-brist via shRNA knockdown. Protokollet börjar med en beskrivning av hur man kulturen och förbereda GL26 ceLLS för ympning in i syngena C57BL / 6J mushjärna. Det förklarar sedan stegen i isolering och flödescytometrisk analys av gliom-infiltrera PBMC från tidigt hjärntumör mikro. Metoden kan anpassas till ett antal in vivo-experimentella utformningar där temporala data om immun infiltration i hjärnan krävs. Metoden är känslig och mycket reproducerbar, såsom gliom-infiltrerande PBMC kan isoleras från intrakraniala tumörer så snart som 24 timmar efter tumör inympning med liknande cellräkningar observerade från tidpunkt matchas tumörer hela oberoende experiment. En enda experimentalist kan utföra metoden från hjärnan avverkning till flödescytometrisk analys av gliom-infiltrerande PBMC på ungefär 4-6 timmar beroende på antalet prover som ska analyseras. Alternativa gliom modeller och / eller cellspecifika antikroppar upptäckt kan också användas vid experimentalhandlingsfrihet att bedöma infiltration av flera andra Immune celltyper av intresse utan behov av förändringar av den totala proceduren.
Introduction
Gliom är en klass av neuroepiteliala hjärnan cancer till följd av transformerade glia i det centrala nervsystemet (CNS). Av alla gliom, Världshälsoorganisationen (WHO) grad IV gliom eller glioblastom (GBM), är den vanligaste och dödliga 1. GBM är mycket motståndskraftiga mot den nuvarande standarden-of-care som består av tumörresektion i möjligaste mån följt av strålning plus samtidig och adjuvant kemoterapi med temozolomid 2. Dessa dödliga cancer bär en dyster prognos på bara 15-18 månader att överleva från tidpunkten för diagnos med endast 5% av patienterna överlever sjukdomen efter 5 år 3.
Närvaron av blodhjärnbarriären (BBB), har brist på professionella antigenpresenterande celler (APC), och tidigare oidentifierade förekomsten av bona fide lymfatiska strukturer i hjärnan 4 ledde till begreppet GBM som immun privilegierade. Men många studier nu show att dessa hjärncancer faktiskt framkalla rekrytering av perifera immunceller som är övervägande myeloid ursprung som inkluderar monocyter, makrofager, och myeloid-derived suppressorceller (MDSCs) 5. GBM påverkar också aktiviteten hos hjärnans bosatt mikroglia att bli pro-tumörogen 6,7. Lymfoidceller såsom CD8 + T-celler 8 och CD56 + naturliga mördarceller 9 finns också inom tumören mikromiljö, men i mycket mindre antal, ett faktum trodde bero på immunosuppressiv funktion initieras av gliom härledda faktorer tumörassocierade makrofager ( TAM) 10. CD4 + T-celler är också närvarande i GBM, men en stor del av denna population uttrycker också CD25 och Foxp3, tillverkare av immunsuppressiv T regelverk (T reg) celler 11. Den totala immunsuppressiva delstaten GBM kulminerar i främjandet av immunologiska flykt och tumörprogression 12.
13-19. Kulmen på detta arbete har nu lett till en klinisk prövning som syftar till att utvärdera en kombinerad cytotoxiska och immunstimulerande terapeutiska för patienter med nydiagnostiserad GBM (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT01811992).
Vårt senaste arbete visar att mus GL26 och rått CNS-1 GBM celler blockera antitumör NK-cell immunkontroll genom att producera stora mängder av β-galaktosid-bindande lektin galektin-1 (gal-1) 20. Detta visades genom att undertrycka expressionen av gal-1 i gliomceller med användning shRNA-medierad gen knockdown. In vitro experiments visade att gal-1-brist gliomceller frodats normalt i kultur, men genomgick en snabb avstötning strax efter intrakraniell ympning i syngena C57BL / 6J eller RAG1 - / - möss, att kunna skapa självständighet T- eller B-celler på denna form av tumöravstötning. NK-celler immunotömning med anti-asialo GM 1-antiserum eller monoklonala antikroppar NK1.1 ledde till fullständig restaurering av intrakraniell gal-1-brist gliom tillväxt, om inrättande av rollen av NK-celler i gal-1-brist gliom avslag. Vi visar nu att immunotömning av Gr-1 + / CD11b + myeloidceller är tillräcklig för att förhindra gal-1-brist gliom avslag trots närvaron av NK-celler, vilket avslöjar en oumbärlig hjälp roll myeloidceller i hjälp till NK-medierad gal -1-brist tumörlys (opublicerade data). Detta oväntade resultat har lett oss att utveckla en omfattande protokoll för isolering och analys av perifera mononukleära blodceller (PBMC) sominfiltrera hjärntumör mikro strax efter intrakraniell ympning så att vi bättre kan karakterisera immuninfiltrations händelser som predikat gal-1-brist gliom avslag.
Metoden demonstreras här genom musen GL26 gliom celler som konstitutivt uttrycker mCitrine fluorescerande proteinet, som kallas GL26-Cit, som tillåter direkt tumörcell visualisering genom fluorescensmikroskopi 21. Dessa celler är stereotaktiskt inympade i hjärnan hos syngena C57BL / 6J-möss och tillåts växa för 24, 48, eller 72 h före mus eutanasi. Gliom-infiltrerande PBMC isoleras sedan och immunolabeled användning av anti -CD45, -Gr-1, -CD11b och -NK1.1 cellytan antikroppar tillsammans med intracellulär immunomärkning för granzym B (GzmB). Denna specifika kombination av antikroppar möjliggör identifiering av tumörinfiltrerande Gr-1 + / CD11b + myeloidceller och NK1.1 +, NK-celler, celltyper vi har been inblandad i gal-1-brist tumöravstötning. Immun infiltration profil gal-1-brist GL26-Cit gliom, som här kallas GL26-Cit-gal1i, jämförs sedan med den för gliom uttrycker normala nivåer av gal-1 kallas GL26-Cit-NT som innehåller en icke- targeting kontroll shRNA hårnål. Protokollet börjar med en beskrivning av hur man kulturen GL26-Cit gliomceller in vitro, som följs av en förklaring om hur man ortotopiskt ympas dessa celler i striatum hos syngena C57BL / 6J möss. Det fortsätter sedan att räkna upp de olika stegen i isolering och immunomärkning av gliom-infiltrera PBMC för flödescytometrisk analys. Protokollet avslutas med en förklaring av standarddataanalys och grafisk representation.
Demonstrationen visar att både Gr-1 + / CD11b + myeloidceller och NK1.1 + NK-celler företrädesvis ackumuleras i gal-1-brist hjärntumör mikro inom 48hr av tumörimplantationen, ett resultat som bidrar till att förklara varför dessa tumörer genomgår snabbt fullständig tumörlys ca 1 vecka efter tumör engraftment 20. Förfarandet är lätt att anpassa till ett antal olika in vivo experimentella utformningar där temporala data om immun infiltration i hjärnan krävs. En enda experimentalist kan utföra protokollet från hjärnan avverkning till flödescytometrisk analys av gliom-infiltrerande PBMC i cirka 4-6 timmar, beroende på antalet prover som ska analyseras. Förfarandet kan även kombineras med experiment som syftar till att karakterisera profilen av cirkulerande PBMC i tumörbärande möss för jämförelse med de som infiltrerar hjärnan så att identifiera immunsuppression fenotyper specifikt inducerade av tumörens mikromiljö. Tillämpning av detta och liknande metoder bör underlätta en bättre förståelse av de faktorer som är inblandade i handel med perifera immunceller i hjärntumören mikro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Läs igenom hela protokollet innan du utför experiment. Godkännande för användning av ryggradsdjur från lämplig institutionell utskott för användning och djurens välfärd måste erhållas före du fortsätter.
1. Beredning av tumörceller för intrakraniell Engraftment
- Att arbeta i en klass II biologiskt säkerhetsskåp, börja med att framställa GL26-Cit-NT / gal1i cellkulturmedia genom att komplettera en 500 ml flaska av Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) med 10% sterilfiltrerad värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS ), 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin, 100 | ig / ml streptomycin, 600 ug / ml G418 sulfat (för val av mCitrine expressionsvektor) och 3 | j, g / ml puromycin dihydroklorid (för urval av det icke- inriktning eller gal-1-specifika shRNAs).
- Kultur GL26-Cit-NT och / eller GL26-Cit-gal1i celler (Figur 1A och 1B 2 för 1-2 dagar innan tumören engraftment förfarandet eller tills kolvarna når 50-80% konfluens.
- På dagen för kirurgi, ta bort cellkulturmedia från gliomceller med användning av en 10 ml serologisk pipett och en pipett pistol och kassera mediet in i en avfallsbägare.
- Vänd kolven ovansidan nedåt och tillsätt 10 ml DPBS till ovansidan av kolven med hjälp av en 10 ml serologisk pipett. Invertera långsamt kolven för att täcka cellerna i DPBS, sedan tippa flaskan vertikalt och ta bort och kasta DPBS till en avfallsbägare.
- Lägg 3-4 ml icke-däggdjurs trypsin alternativ i DPBS med EDTA (se material lista för detaljer) till varje T75 vävnadskultur kolv och placera tillbaka in i vävnadsodlingsskåp för 2-5 minuter. Med hjälp av en ljusfältsmikroskop, kontrollera att alla cellerna har lossnat från bottenytan före förfarandet.
- Inhibera further enzymatisk aktivitet genom att späda trypsinet alternativet med 6 ml DPBS. Pipettera upp och ner under användning av en 10 ml serologisk pipett för att skölja den undre ytan av kolven och att mekaniskt dissociera eventuella cellulära aggregat. Aspirera cellerna och placera i respektive märkta 15 ml centrifugrör. Snurra cellerna ner vid 550 x g (max RCF) under 5 min vid 4 ° C (figur 1C).
- Avlägsna supernatanten och försiktigt återsuspendera cellerna med 1 ml un-kompletterat DMEM. Se till att pipet cellerna upp och ner noggrant med en P-1000 mikropipett för att uppnå en enda cell suspension.
- Gör en 1:10 spädning av den resulterande cellsuspensionen genererad på 1,6 genom att placera 18 | il av un-kompletterat DMEM till en 0,6 ml konisk polypropen mikrorör följt av tillsats av 2 | il av tumörcellsuspension. Pipett upp och ner med en P-10 mikropipett att homogenisera cellerna ordentligt.
- Tillsätt 10 pl &# 160; av 1:10 tumörcellspädning som genereras i 1.7 till en separat 0,6 ml konisk polypropylen mikrorör, lägg sedan till 10 pl Trypan blånad till röret. Blanda med en P-10 mikropipett och tillsätt 10 pl av den resulterande tumörcell / Trypan blå lösning under en glaskupa halka placerad på toppen av en hemocytometer var noga med att inte införa luftbubblor (Figur 1D).
- Räkna cellerna med ett ljust fält mikroskop med hjälp av en 10X mål enligt den specifika protokoll i samband med den givna hemocytometer. Var noga med att faktor i 20-faldig utspädning av den ursprungliga tumören cellsuspensionen gjort under förberedelserna av cellerna för noggrann cell uppskattning i den ursprungliga 1 ml portion. Använd följande formel för att beräkna det totala antalet celler: totala celler / ml = [((Σcells räknat per kvadrat) / # av rutor räknade) x 20 (dvs utspädningsfaktor) x 10.000 celler / ml].
- Efter determining det totala antalet celler för varje cellinje som användes i det givet experiment, spinn ner dem vid 550 x g (max RCF) under 5 min vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten (s) och återsuspendera cellerna med en lämplig volym av un-kompletterat DMEM i syfte att uppnå en målkoncentration av 3 x 10 4 celler per 1 pl för varje cellinje enligt följande formel: (totalt antal celler / 30 tusen).
- Placera en ekvivalent volym av varje cellinje i respektive märkta 0,6 ml koniska polypropylenrör och placera på is (Figur 1E). Var noga med att spara några celler att fortsätta sprida varje cellinje om separata T75s inte tidigare såddes.
2. Förfarande för Stereotactic Engraftment av gliomceller i striatum hos C57BL / 6J möss
- Bered arbets lösningar av kirurgisk anestesi, smärtlindring och anestesi återföring före operation enligt följande:
- För ketamin / dexmedetomidin surgical anestesi: ta bort 1,4 ml från en 10 ml flaska med steril 0,9% NaCl-injektion och ersätt med 600 pl av en 100 mg / ml stamlösning av ketamin hydroklorid och 800 | il av en 0,5 mg / ml stamlösning av dexmedetomidinhydroklorid för att ge en blandad arbetslösning av ketamin-hydroklorid (6 mg / ml) och dexmedetomidin-hydroklorid (0,04 mg / ml).
- För buprenorfin smärtlindring: ta bort 1 ml från en 10 ml injektionsflaska med steril 0,9% NaCl injektion och ersätt med hela 1 ml volym av en enda 0,3 mg / ml lager buprenorfinhydroklorid ampull för att ge en 0,03 mg / ml arbetslösning.
- För atipamezol kirurgisk anestesi återföring: ta bort 1 ml från en 10 ml injektionsflaska med steril 0,9% NaCl injektion och ersätta med 1 ml av en 5 mg / ml stamlösning av atipamezolhydroklorid för att ge en 0,5 mg / ml arbetslösning.
- Att arbeta i en godkänd plats för mus överlevnad surgery, börja med att sätta upp autoklave eller pärla steriliserade kirurgiska instrument och andra reagens som visas i (figur 2A), då få tillräckligt 8-10 veckor gamla C57BL / 6J-möss (syngena med GL26 gliom) som krävs för undersökningen; garantera deras kontinuerlig tillgång till mat och vatten.
- Söva första musen med en enda intraperitoneal (ip) injektion av arbetsanestesilösningen genom att leverera en dos av 75 mg / kg ketamin och 0,5 mg / kg dexmedetomidin (approximativt 250 | il för en 20 g mus). Härnäst ge en 5 mg / kg subkutan (se) injektion av karprofen (approximativt 100 | il för en 20 g mus). Se till att musen är inte svarar på tå och svans nyper innan du fortsätter.
- Med hjälp av kirurgiska Clippers, raka pälsen från kraniet. Applicera povidonjod antiseptisk lösning på det rakade området, skrubba med en 70% isopropylalkohol prep pad, sedan åter ansöka povidonjod antiseptisk lösning. Applicera en liten mängd av Sterile vaselin oftalmisk salva till varje öga för att förhindra torkning.
- Säkra skallen i den stereotaktiska ramen enligt följande protokoll:
- Öppna försiktigt munnen genom att nå in med ett par böjda dissekera pincett för att försiktigt dra ut tungan och flytta till ena sidan av munnen för att förhindra kvävning. Låt pincett för att dra tillbaka medan det i munnen för att sprida käken öppna guide de två översta framtänderna i nyckelhålet av tanden baren på den stereotaktiska ramen. Säkra tand bar från att svänga horisontellt eller vertikalt genom att justera respektive skruvarna. Kontrollera att musens kraniet är i nivå med bänkytan.
- Placera örat barer säkert mot postorbital ben kraniet var noga med att inte använda för mycket inåtriktat tryck på skallen för att förhindra krossning.
- Placera nosstången över nosen och skruva ner tills ordentligt. Kontrollera att det inte finns någon vertikal / lateral rörelse i huvudet genom ett lätt tryckmed en tumme och pekfinger. En mus korrekt placeras i en stereotaktisk ram visas i (figur 2B).
- Med hjälp av en skalpellblad, gör en 1 cm mittlinje snitt över kraniet från pannbenet till nackbenet. Dra tillbaka huden vid snittet med hjälp av Colibri upprullningsdon.
- Sänk mikroliter spruta försedd med en 33 G nål fäst vid den vertikala arm stereotaktiska ramen direkt ovanför ställning bregma (figur 2C). Därifrån, justera positionen av nålen 0,5 mm AP, 2,5 mm ML för att nå målet plats för tumörimplantation. Använd en tuberkulinspruta 1 ml utrustad med en 26 G nål för att markera den här platsen genom att försiktigt excoriating periosteum.
- Borra ett hål i kraniet vid målplatsen tills den når den underliggande dura mater med hjälp av en trådlös precision borrmaskin utrustad med en 1/32 "(0,8 mm) bit. Medan borrning, applicera intermittent tryck följt av avlägsnande av drill bitars från ytan av kraniet att undvika överdriven värme och kraft som skulle kunna medföra att borrskäret punktering av underliggande hjärnvävnad.
- Spola mikroliter spruta med 0,9% NaCl i en 1,7 ml konisk polypropylen mikrorör för att säkerställa att nålen inte är igensatt. Flick försiktigt 0,6 ml koniska polypropylen mikrorör innehåller tumörcellerna flera gånger för att suspendera cellerna.
- Upprätta 2 pl av celler i mikroliter sprutan garanterar att inga luftbubblor införs i sprutan. Dispensera 1 ni av cellerna på en 70% isopropylalkohol prep dyna lämnar exakt 1 il tumörceller som finns kvar i sprutan.
- Ta nålen tills den rör vid dura mater, sedan införa nålen i hjärnan -3.5 mm ventralt och dra med 0,5 mm. Långsamt och jämnt leverera cellerna genom nedtryckning av sprutkolven under loppet av 1-2 min.
- Låt cellerna att avveckle vid injektionsstället för 5 minuter före långsamt dra tillbaka nålen. Torka bort koagulerat blod eller hjärnsubstans från spetsen av nålen med en ren 70% isopropylalkohol prep pad. Skölj nålen och sprutan noggrant med 0,9% NaCl från steg 2,6 för att säkerställa att nålen inte är igensatt för nästa injektion.
- Ta bort Colibri upprullningsdon och sutur hårbotten med hjälp av tre 3-0 nylon monofilamentsuturer. Ta bort musen från den stereotaktiska ramen och administrera 0,1 mg / kg av buprenorfinhydroklorid subkutant (sc) (ca 67 ul av 0,03 mg / ml arbetslösning för en 20 g mus) följt av 2,5 mg / kg atipamezolhydroklorid intramuskulärt (im) (approximativt 100 | il av 0,5 mg / ml arbetslösning för en 20 g mus) för postoperativ smärtlindring och anestesi återföring. Placera postoperativa möss tillbaka till sina burar enligt en värmelampa för att återhämta sig.
3. Mus transcardial Perfusjon och Skörd av hjärnan
- Förbered hepariniserat Tyrodes lösning enligt följande protokoll:
- Sätt en magnetisk omrörarstav i en 1 liters glasskruvlock lagerbehållaren och fyll till märket med ultrarent avjoniserat vatten. Placera flaskan på en omrörningsplatta.
- Väg och lägga till följande kemikalier till glasflaska under omrörning: 8 g natriumklorid (NaCl), 0,264 g kalciumklorid (CaCl2 • 2H 2 O), 0,05 g natriumfosfat monobasiskt (NaH 2 PO 4 • 2H 2 O), 1,0 g D-glukos (C 6 H 12 O 6), 1,0 g natriumvätekarbonat (NaHCOs 3), 0,2 g kaliumklorid (KCl). Låt salter för att lösa upp, tillsätt sedan 100 | il av en 1,000U / ml förrådslösning av heparinnatrium till Tyrodes lösning.
- Ta bort behållaren från omrörningsplattan och extrahera omrörarstaven användning av en magnetisk trollspö. Lagra hepariniserad Tyrodes lösning vid 4° C.
- Bered en fungerande lösning för terminal anestesi enligt följande:
- För ketamin / xylazin terminal anestesi: avlägsna 1,360 il från en 10 ml flaska med steril 0,9% NaCl-injektion och ersätta med 1200 | il av en 100 mg / ml stamlösning av ketamin hydroklorid och 160 | il av en 100 mg / ml stamlösning av xylazin hydroklorid för att ge en blandad arbetslösning av ketamin-hydroklorid (12 mg / ml) och xylazinhydroklorid (1,6 mg / ml).
- Förbered densitetscentrifugering mediemix lösning genom att placera 90 ml av 10x PBS i 264 ml ultrarent avjoniserat vatten (3.93x) i en steril plastbehållare. Titrera till pH 7,0-7,2 med HCl och filtrera sterilisera genom ett 0,22 pm filter. Förvaras vid 4 ° C.
- Förbered 70% densitetscentrifugering medierna genom att kombinera 18 ml densitetscentrifugering mediemix lösning med 30 ml av densitetscentrifugering media (se material listaför mer information) i en 50 ml polypropylen centrifugrör. Förvara vid 4 ° C, men ta till RT före användning.
- Bered 37% densitetscentrifugering medierna genom att kombinera 9,6 ml DPBS med 10,4 ml 70% densitetscentrifugering media i en 50 ml centrifugrör. Förvara vid 4 ° C, men ta till RT före användning.
- Bered buffertflöde genom att placera 500 ul av FBS i 50 ml DPBS (~ 1% FBS) i en 50 ml centrifugrör. Förvara i butik vid 4 ° C
- Fyll en 4,5 L polyuretan ishink kapacitet med isbitar.
- Gör en kombinerad lösning av 1 mg / ml kollagenas och ett mg / ml DNas-I i tillräcklig mängd för 1 ml per hjärna prov i studien genom att späda en 10 mg / ml DNas-I-förrådslösning 01:10 och en 50 mg / ml kollagenas stamlösning 1:50 med steril DPBS i en enda 15 ml polypropylen centrifugrör. Blanda försiktigt lösningen genom att pipettera upp och ned med en P-1000 mikropipett. Förvara på is i polyurethane hink från steg 3,7.
- Skaffa två 7 ml glas Dounce vävnadskvarnar. Märk en "NT" och den andra "gal1i". Placera vävnadskvarnar i ice skopan och tillsätt 1 ml DPBS till varje.
- Skaffa tillräckligt 15 ml centrifugrör att samla hjärnsubstans från varje mus i studien och plats i ishink.
- Placera ~ 150 ml DPBS bland tre 50 ml centrifugrör i ice bucket.
- Skaffa tillräckligt polystyren sexkantiga vågskålarna (övre innerdiameter (ID) 115 mm, bas ID 85 mm, 203 ml volym) för varje mus i studien. Den fullständiga uppsättningen för dissekering och triturering av mushjärnor visas i (figur 3A)
- Vid valda tidpunkter, söva första tumörbärande mus i studien med användning av en enda IP-injektion av 150 mg / kg av ketamin hydroklorid och 20 mg / kg xylazin-hydroklorid (approximativt 250 | il av den kombinerade 12 mg / ml ketamin / 1,6 Mg / ml xylazin arbetslösning för en 20 g mus) för att inducera djup anestesi. Se till att musen är icke-svar på tå och svans nyper innan du går vidare.
- Hämta den tidigare beredda Tyrodes lösning och placera i ett laminärt flöde huva tillägnad terminal djur kirurgiska ingrepp. Placera gasogenomträngliga polymera rören fäst vid en karbogen tank in i Tyrodes lösning. Öppna flaskventilen för att medge 95% O 2/5% CO 2 karbogen att kontinuerligt bubbla in i lösningen.
- Fäst en 20 G aluminiumnav trubbig nål till slutet av ytterligare gas impermeabla polymera rören ansluten till en peristaltisk pump. Placera röret vid den andra änden av den peristaltiska pumpen i Tyrodes lösning och slå på pumpen för att göra det möjligt för slangen att fylla med syresatt och hepariniserad Tyrodes lösning. Ställ in för mus transcardial perfusion visas i (Figur 3B).
- Med fyra 26 G nålar, stift nersövd musen ventralsidan upp av de främre och bakre tassar på en extruderad styrencellplast blocket täckt med en avyttring absorberande handduk i laminärt flöde huva.
- Tag i huden ovanför bukhålan användning av ett par av trubbig dissektion pincett, och med hjälp av en stor par dissektion sax göra ett "Y" snitt genom att penetrera den peritoneala väggen, skärning cephalically att punktera membranet, därefter bifurcating vid bröstbenet för att avslutas vid vänster och höger armhålor.
- Använd en hemostat för att klämma bröstbenet och reflektera bröstkorgen över musens vänstra axel. Ta hjärtsäcken med paret av dissektion pincett.
- Slå på den peristaltiska pumpen för att börja en stadig droppa av syresatt och hepariniserad Tyrodes lösning (ungefär 2,3-2,5 ml / min).
- För in den trubbiga nålen in i den vänstra ventrikeln hos hjärtat. Använd en liten par dissekering sax för att klippa höger förmak för att möjliggöra exsanguination (Figur3C).
- Låt Tyrodes lösning att grundligt BEGJUTA musen cirkulationssystemet tills levern och lungorna har helt blanched grund av brist på blod. Se till att inga stora mängder blod fortsätter att lämna höger förmak innan du tar bort 20 G aluminiumnav trubbig nål från vänster kammare.
- Unpin musen från den strängsprutade polystyrenskum blocket och vrid mus ventrala sidan nedåt. Med hjälp av en stor par dissektion sax, separera huvudet från resten av kroppen vid nivån för halsen.
- Med hjälp av en liten par dissektion sax, klippa hårbotten vid mittlinjen börjar vid pannben arbetar framåt mot nosen för att exponera kraniet.
- Dra in huden på båda sidor av kraniet med hjälp av en tumme och pekfinger och håller skallen säkert. Använda ett par ben rongeurs att bryta igenom kraniet början vid occipital ben och arbeta framåt för att fullständigt exponera de dorsala och lateralaytor hos hjärnan. Var noga med att minimera skador på hjärnan.
- När skallbenen har tagits bort, vrida huvudet av musen ventrala sidan upp och använda en liten par dissekering sax för att klippa kranialnerverna vid basen av hjärnan för att befria det från skallen.
4. Isolering av gliom-infiltrerande PBMC
- Med hjälp av en ren enda kantad rakblad, isolera område i hjärnan som innehåller tumören genom att göra en sagittal snitt längs mitten av hjärnan att tudela de två hjärnhalvorna. Vrid ipsilaterala hemisfären mediala sidan ner och göra två koronala snitt med den grad av lillhjärnan och luktloben att isolera målvävnaden innehållande tumörimplantation (Figur 4A). En ekvivalent del av den kontralaterala hemisfären kan också isoleras och användas som en negativ kontroll.
- Placera målvävnaden i respektive märkt glas Dounce vävnadskvarn innehållande 1 ml, DPBS, tryck kolven hela vägen ner och vrid 7 gånger att initialt störa vävnaden. Lyft kolven för att låta vätskan komma tillbaka till botten av vävnadskvarn. Upprepa detta steg tre gånger; men bara vrida kolven 4 gånger under de kommande två upprepningarna och 3 gånger under den senaste upprepa att undvika över triturering vävnaden.
- Med hjälp av en P-1000 mikropipett, sekventiellt gälla tre 1 ml volymer iskall DPBS (framställda i 3.11) längs sidorna av kolven för att skölja in i vävnaden kvarn.
- Resuspendera revs hjärnsubstans genom att pipettera upp och ned och placera i en märkt 15 ml centrifugrör på is. Skölj sidorna av Dounce vävnadskvarn med ytterligare 1 ml iskall DPBS och lägg till samma 15 ml centrifugrör. Håll alla rör innehållande revs hjärnsubstans på is tills alla prover har behandlats.
- Upprepa steg 3,13-3,25 och 4,1-4,4 för varje mus i studien.
- När alla prover have behandlats, spinn ner revs hjärnsubstans i 15 ml centrifugrör vid 740 xg (max RCF) under 20 minuter vid 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten med en 10 ml serologisk pipett och pipett pistol och resuspendera pellethjärnsubstans i 1 ml av den tidigare framställda kollagenas / DNas-I matsmältningsenzymer med hjälp av en P-1000. Placera 15 ml centrifugrör i ett provrörsställ och placera i en 37 ° C vattenbad i 15 minuter.
- Skaka försiktigt proverna två gånger under inkubationstiden genom att snärta rören för att underlätta vävnads uppdelning.
- Tillsätt 6 ml iskall DPBS med användning av en 10 ml serologisk pipett till varje rör för att späda matsmältningsenzymer. Pipettera upp och ner för att resuspendera, och filtrera den sammanlagda volymen genom sterila 70 pm nylon mesh filter till nya märkta 15 ml centrifugrör på is.
- Snurra hjärnan cellsuspensionen ned vid 740 x g (max RCF) under 20 min vid 4 ° C för att uppnå enenda cell pellet (Figur 4B). Efter avlägsnande av 15 ml rör från centrifugen placera dem på is och öka temperaturinställningen på centrifugen till ca 21 ° C som förberedelse för nästa steg.
- Fullt avlägsna supernatanten från varje rör innehållande hjärnceller och initialt resuspendera pelletarna i 1 ml 70% densitetscentrifugering media med en P-1000 mikropipett. Sedan lägga till ytterligare 4 ml 70% densitetscentrifuge media till varje rör med hjälp av en 10 ml serologisk pipett. Skruva locken på säkert och homogenisera cellsuspensionen genom att försiktigt vända på rören flera gånger.
- Ta bort de 15 ml centrifugrör innehållande hjärnceller återsuspenderas i 70% densitetscentrifugering media från is, och placera i ett provrörsställ vid RT. En i taget, noggrant överlagra 2 ml 37% densitetscentrifugering medielösningen på 5 ml 70% densitetscentrifugering media med en P-1000 mikropipett för att bilda acmager ytan mellan de två densitetscentrifugering medieskikt (figur 4C).
- Använd en spetsig markör för att indikera läget för gränsytan så att den lätt kan identifieras efter centrifugering, då skillnaden blir mindre uppenbara.
- Spinn ner 15 ml centrifugrör vid 740 xg (max RCF) under 20 minuter vid rumstemperatur utan paus för att undvika störningar gränssnittet.
- Efter centrifugering, samla PBMC som har ackumulerats vid gränsytan mellan de två densitetscentrifugering medieskikt (figur 4D) genom införande av en P-200 mikropipett in i röret utmed dess sida, försiktigt förbi lipidskiktet.
- En gång vid nivån för PBMC-bandet, långsamt extrahera 200 ^ från ytan av den 70% densitetscentrifugering medieskiktet och placera in i ett respektive märkt polypropylen FACS-rör på is. Upprepa en gång för en total volym på 400 l per prov.
- Lägg 3 ml buffertflöde till varje FACS-rör innehållande 400 | il av PBMC för att tillräckligt späda densitetscentrifugering media sedan snurra cellerna ner vid 660 x g (max RCF) under 20 min vid 4 ° C.
5. immunomärkning av gliom-infiltrerande PBMC
- Innan analysera eventuella experimentella PBMC prover, göra en enda, självständig, cellytan isotypkontroll experiment för att fastställa grundläggande grindar för att vara associerad med en uppsättning fasta PMT spänningar inom en flödescytometrisk dataanalys mall som ägnar sig åt bedömning av gliom-infiltrerande PBMC enligt följande protokoll:
- Ympas en C57BL / 6J mus med GL26-Cit-gal1i och en annan med GL26-Cit-NT enligt det förfarande som beskrivs i avsnitt 2. Efter 72 timmar av tumörtillväxt, euthanize både möss och isolera tumörinfiltrerande PBMC enligt de förfaranden skiss hela avsnitt 3 och 4.
- Kombinera de två PBMC prover (NT and gal1i) i en volym (dvs 100 ul), sedan ytterligare dela upp provet jämnt mellan tre FACS rör (dvs., 33,3 | il per rör) märkt "CD45 isotyp", "Gr-1 / CD11b isotyp", och "NK1. 1 isotyp ". Lägg följande antikroppar (vardera vid en 1: 100 spädning och späddes till en total volym av 200 | il i buffertflöde) till de respektive märkta FACS rör: "CD45 isotyp": Alexa Fluor 700-konjugerad rått-IgG2b, κ (klon: RTK4530 ), "Gr-1 / CD11b isotyp": Alexa Fluor 700-konjugerat rått-anti-mus CD45 (klon: 30-F11), PE-konjugerat rått-IgG2b, κ (klon: eB149 / 10H5), och PerCP / Cy5.5 -konjugerad rått IgG2b, κ (klon: RTK4530); "NK1.1 isotyp": Alexa Fluor 700-konjugerat rått-anti-mus CD45 (klon: 30-F11), PE-konjugerat rått-anti-mus Gr-1 (klon: RB6-8C5), PerCP / Cy5.5-konjugerat rått-anti-mus CD11b (klon: M1 / 70), och APC-conjugated mus IgG2a, κ (klon: eBM2a).
- Tillåt PBMC att immunolabel på is i mörker under 20 minuter. Flick rören efter halva inkubationstiden att blanda försiktigt. Tvätta med 1 ml buffertflöde, spinn ner vid 660 xg (max RCF) under 10 minuter vid 4 ° C och resuspendera varje FACS rör innehållande PBMC med 200 pl buffertflöde.
- Med hjälp av en flödescytometer utrustad med en 85 um integrerat munstycke, analysera "CD45 isotypen" rör först med att etablera en baslinje CD45 intervall grind. Därefter kör "Gr-1 / CD11b isotyp" röret för att etablera en baslinje Gr-1 / CD11b kvadranten porten med hjälp enda sanna CD45 + celler som indata. Slutligen, kör "NK1.1 isotypen" röret för att etablera en baslinje NK1.1 intervall grind med hjälp enda sanna CD45 + / Gr-1 låg / CD11b +/- celler som indata.
- Använd följande procedur för alla framtida experiment enALYS:
- Gör en tillräcklig mängd av en 1: 100 utspädning av cellyt-antikroppar i buffertflöde för att uppnå en 200 | al volym per prov (plus ett för GzmB isotyp): Alexa Fluor 700-konjugerad rått-anti-mus-CD45 (klon: 30-F11 ), PE-konjugerat rått-anti-mus Gr-1 (klon: RB6-8C5), PerCP / Cy5.5-konjugerat rått-anti-mus CD11b (klon: M1 / 70), APC-konjugerade mus-anti-mus NK1.1 (klon: PK136).
- Försiktigt bort supernatanten av de spunna ned PBMC från 4,15 tills menisken är precis ovanför botten av varje FACS rör (~ 50 l) för att undvika cellförluster. Resuspendera PBMC i varje FACS rör med restbuffertflöde med en P-200 mikropipett och ta bort (1 / # prov) till ett värde av volymen från varje FACS rör och kombinera till en ny FACS rör märkt "poolade isotyp".
- Tillsätt 200 pl av cellytan antikropps cocktail upprättats i 5.2.1 till varje PBMC prov. Tillåt PBMC att immunolabel på is i mörker under 20 minuter. Flick than rören efter halva inkubationstiden att blanda försiktigt.
- Tvätta med 1 ml buffertflöde; spinn ner vid 660 xg (max RCF) x 10 minuter vid 4 ° C.
- Resuspendera alla FACS rör innehållande PBMC i 200 pl av en kommersiellt tillgänglig formalin baserade fixativ (se material lista för detaljer) för 15 minuter på is i mörker. Flick rören efter halva inkubationstiden att blanda försiktigt.
- Tvätta med 1 ml av en kommersiellt tillgänglig 1x permeabilization / tvättbuffert (se material lista för detaljer) och spinn ner vid 660 xg (max RCF) under 10 minuter vid 4 ° C.
- Medan PBMC snurrar ner, förbereda en tillräcklig mängd av en 1: 100 spädning av Pacific Blue-konjugerat mus-anti-mus-GzmB (Klon: SV11) intracellulära antikroppar i 1x permeabilization / tvättbuffert för att uppnå en 200 | al volym per prov.
- I ett separat rör, förbereda en enda 200 pl volym av en 1: 100 utspädning av Pacific Blue-conjugated mus IgG1, κ (klon: MOPC-21) isotypkontrollantikropp.
- Resuspendera varje experiment PBMC proverna med 200 ul av 1: 100 spädning av anti-mus GzmB antikroppar och resuspendera enda FACS-rör märkt "poolade isotyp" med 200 | j, l volym av 1: 100 utspädning av isotyp-antikroppar.
- Tillåt alla PBMC prover för att immunolabel på is i mörker under 20 minuter. Flick rören efter halva inkubationstiden att blanda försiktigt.
- Tvätta med 1 ml buffertflöde; spinn ner vid 660 xg (max RCF) under 10 minuter vid 4 ° C och slamma PBMC med 200 il buffertflöde för analys.
- Flow cytometrically analysera gliom-infiltrera PBMC med hjälp av en 85 um integrerat munstycke och grindar och PMT-spänningar som tidigare fastställts i avsnitt 5.1 22. Var noga med att köra hela volymen av varje prov på flödescytometern för att säkerställa en rättvis jämförelse av det totala antalet av gliom-infiltrating PBMC i varje prov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Följande grind strategi används för ett typiskt experiment: FSC-A kontra SSC-A → SSC-H kontra SSC-W → FSC-H kontra FSC-W → CD45 vs. räkna → Gr-1 vs CD11b → NK1.1 vs. räkning. Grindar placeras på Gr-1 + / CD11b + myeloidceller och NK1.1 + NK-celler därefter stratifieras baserade på GzmB uttryck (figur 5A). Bakförspänning de celler som identifieras som NK1.1 + NK-celler och Gr-1 + / CD11b + myeloida celler i våra experiment PÅ FSC-A kontra SSC-A bekräftar mindre lymfoid storleken på NK-celler och den relativt stora storleken på myeloidceller ( figur 5B). Raw datafiler (dvs. FCS filer) analyseras av kommersiellt tillgängliga flödescytometrisk dataanalys program som FlowJo.
Totalt 18 C57BL / 6J-möss användes för att visa den här metoden. Nio (9) har inympats med GL26-Cit-NT och 9 engrafted med GL26-Cit-gal1i på samma day användning ekvivalent antal celler (3x10 4). Tre möss från varje grupp avlivades vid 24, 48, och 72 h efter tumör engraftment. Data visar att inympning av GL26-Cit-gal1i gliomceller i hjärnan hos syngena C57BL / 6J-möss inducerar snabbt rekrytering av CD45 + PBMC (figur 6A). Baserat på den specifika antikroppen cocktail som används i demonstrationen den kan vidare visat att Gr-1 + / CD11b + myeloidceller och NK1.1 + NK-celler ange specifikt gal-1-brist tumörmikro inom 48 timmar av tumör inympning (Figur 6B och 6C); men det totala antalet gliom-infiltrerande myeloidceller långt uppväger det av NK-celler.
Figur 1: Framställning av GL26-CIT Celler för Intrakraniell Engraftment (A.) Företrädare 10X ljusfält och epifluorescence mikrofotografier av GL26-Cit-NT (vänster bilder) och GL26-Cit-gal1i (rätt bilder) celler odlade i kultur. (B) Western blöt av GL26-Cit-NT (vänster körfält) och GL26-Cit-gal1i (höger körfält) helt cellysat. Gamma tubulin (γ-badkar.) Visas som en laddningskontroll. (C) GL26-Cit cellpelleten från en ungefärligen 50% konfluenta T75 vävnadsodlingskolv efter centrifugering vid 550 x g (max RCF) under 5 min vid 4 ° C. (D) Bright-field vy av en hemocytometer innehållande GL26-Cit celler (vita prickar) spädd 1: 1 med trypanblått för att bedöma antalet celler och livsduglighet. Celler bör vara> 90% lönsamt att säkerställa reproducerbar tumörtillväxt. Genomsnittet av de cellräkningar från torgen märkta 1 till 5 bör vidtas för att öka noggrannheten av cellantalet uppskattning. (E) GL26-CIT cellerna resuspenderades vid 3 x 10 4 celler / ul i FN-kompletterat DMEM för intrakraniell implantation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Stereotactic Engraftment av gliomceller i striatum hos C57BL / 6J möss (A) Kirurgisk svit layout som visar de nödvändiga kirurgiska instrument och reagens.. (B) Närbild av en C57BL / 6J mus utnyttjas i en stereotaktisk ram med lämplig nål placering vid 0,5 mm AP, 2,5 mm ML och -3,0 mm DV förhållande till bregma. (C) Rygg tanke på musen skallen som visar läget för bregma och målplatsen för tumörcells engraftment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
(A) Mus transcardial Perfusion Nödvändiga reagens för dissekering, fördelning, och enzymatisk nedbrytning av mus hjärnvävnad: Figur 3.. (B) Montage av instrument och reagens som krävs för mus transcardial perfusion med syresatt och hepariniserad Tyrodes lösning som visas i ett laminärt flöde huva tillägnad terminal mus kirurgiska ingrepp. (C) Schematisk bild av hjärtat visar riktiga instrument och placeringar som krävs för transcardial perfusion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Isolering av Gliom-infiltrerandePBMCs. (A) strategi för dissektion av musen hjärnvävnad innehåller tidigt stadium orthotopic gliom implantat. Den övre panelen visar sagittala TUDELNING av ipsilaterala halvklotet bort från kontralaterala hemisfären. Den nedre panelen visar de två ytterligare koronala snitt som krävs för att isolera målvävnaden innehåller tumörimplantering (markerad i lila). (B) Enda cell hjärnvävnad pellet (vit pil) efter enzymatisk spjälkning, filtrering genom ett 70 | im nylonnät och centrifugering. (C) ordentligt hälls densitetscentrifugering media gradient före centrifugering. Den vita pilen anger rent gränssnitt som bildas mellan de två densitetscentrifugemedieskikt. (D) densitetscentrifugering medie gradient efter centrifugering visar lipidskiktet som bildas på toppen av det 37% densitetscentrifugering medieskikt vit pil) och PBMC-bandet (skiss av the streckade svarta linjer) vid gränsytan mellan de två skikten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Flödescytometriska Gating strategi som används för att identifiera Gliom-infiltrerande Gr-1 + / CD11b + myeloidceller och NK-celler (A) Steg 1:. Totalt immunolabeled celler isolerade från PBMC-bandet av en densitetscentrifugering medie gradienten grindas på till utesluta cellrester (FSC-A mindre än ~ 50 K). Steg 2 och 3: dublett diskriminering grind att filtrera bort cellulära aggregat. Steg 4: CD45 gate att identifiera gliom-infiltrerande immunceller. Isotypkontroll visas som grå siluett. Steg 5: CD45 + -celler stratifierades baserat på Gr-1 och CD11b. Isotypkontroll för både Gr-1 och CD 11b överlagras på tomten och omges av guldcirkeln. Den röda cirkeln visar Gr-1 + / CD11b + myeloidceller. Steg 5 ': Gr-1 + / CD11b + myeloidceller stratifierat baserat på GzmB uttryck. Som bygger, dessa celler inte märka med anti-GzmB antikroppar över isotypkontroll (grå silhuett). Steg 6: Gr-1 låg celler som beskrivs av den svarta rektangeln i steg 5 skiktade baserat på NK1.1 uttryck. Isotypkontroll visas som grå siluett. Steg 6 ': NK1.1 hög celler stratifierades baserat på GzmB uttryck. Dessa celler verkligen märka med anti-GzmB antikroppar över isotypkontroll (grå silhuett). (B) bakförspänning av Gr-1 + / CD11b + myeloidceller på FSC-A kontra SSC-A som visar att NK-celler har en mindre lymfoid storlek jämfört med de större Gr-1 + / CD11b + myeloidceller."_blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 6: Jämförelse av PBMC Infiltration i GL26-Cit-NT vs GL26-Cit-gal1i tumör mikromiljö under de tre första dagarna av Intrakraniell tumörtillväxt (A) Total CD45 + immunceller.. (B) CD45 + / Gr-1 + / CD11b + myeloidceller. (C) CD45 + /NK1.1 + NK-celler. Datapunkter från PBMC som isolerats från GL26-Cit-gal1i gliom är anslutna med mjuka linjer, whiles de som isolerats från GL26-Cit-NT gliom är förbundna med streckade linjer. Gliom-infiltrerande PBMC från tre möss analyserades per tumörtyp vid varje tidpunkt. Siffror i samband med varje datapunkt på GL26-Cit-gal1i kurvorna representerar den utfällbara induktion av just PBMC typ över GL26-Cit-NT på den angivna timme efter tumörimplantation (HPI). Data representerar det genomsnittliga antalet immun räknade celler ± standardfel för medelvärdet (SEM). Statistisk analys utfördes med 2-vägs variansanalys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver en robust och reproducerbar metod för isolering och flödescytometrisk analys av PBMC som har infiltrerat den tidiga mus hjärntumör mikromiljö. Gliom cellsuspensioner genereras vid en koncentration som anges av experimentalist som stereotaktiskt är inympade i striatum av mushjärna. Möss sedan avlivas vid förutbestämda tidpunkter som anges av experimentell design och deras hjärnor skördas och bearbetas för att isolera gliom-infiltrera PBMCs som immunolabeled med kombinationer av fluorokromkonjugerade primära antikroppar; immunolabeled celler kvantifieras därefter genom flödescytometri. Även demonstrationen presenteras här fokuserar på tidiga tidpunkter, kan gliom-infiltrerande PBMC bedömas vid någon tidpunkt efter tumör inympning fram till mus moribundity. Metoden är mycket modulärt som helst antal olika antikroppskombinationer kan användas för att undersöka immunceller av intresse including T-celler, B-celler, NK-celler, monocyter och makrofager. Observera att protokollet har optimerats för användning med C57BL / 6J möss 8-10 veckor gamla. Möss utanför denna åldersgrupp kan ha ändrat procentandelar av cirkulerande PBMC, vilket kan leda till cellräkningar vid ekvivalenta tidpunkter som inte är representativa för de uppgifter som presenteras här. Karakteriserings experiment kan också krävas om alternativa tumörmodeller används eller om andra än de på B6 bakgrund möss används på grund av det faktum att stammar kan skilja sig åt i sina PBMC profiler (Jaxpheno6, mus Phenome databas; Jackson Laboratory). Kön och miljöförhållanden kan också vara källor till skillnader mellan PBMC frekvenser och procentsatser.
Denna metod har visats med hjälp av en kombination av fyra cellytan antikroppar som möjliggör detektion av Gr-1 + / CD11b + myeloidceller och NK1.1 + NK-celler, celltyper inblandade i avstötning av gaL-1-deficient gliom. Införandet av intracellulära GzmB antikroppar möjliggör ytterligare detektion av cytotoxiska potential i NK-cellgrupp. Representativa resultat finns för immuncellinfiltration i tidiga GL26-CIT gliom i syngena C57BL / 6J möss som antingen uttrycker normala nivåer av gal-1 eller som har reducerade nivåer på grund av shRNA-medierad gen knockdown. Demonstrationen uppvisar känsligheten och reproducerbarheten hos tekniken genom att visa att gliom-infiltrerande PBMC kan reproducerbart isoleras och kvantifieras så snart som 24 timmar efter tumör engraftment. Bortsett från att avslöja en population av tumörinfiltrerande Gr-1 hög / CD11b + myeloidceller, demonstrationen visar också en population av Gr-1 int / CD11b + celler vars identitet är för närvarande odefinierad. ytterligare experiment är nödvändiga för att ytterligare dechiffrera karaktären av denna cellpopulation. Vi noterar också att vi inte observera en lätt urskiljbara population av CD45
Anti-Gr-1-antikroppar känner igen både Ly6G och Ly6C cellytproteiner som är specifika för polymorfonukleära och mononukleära myeloidceller, respektive 25. Användningen av anti-Gr-1 Antibodtalet utesluter sålunda skillnaden mellan dessa två cellpopulationer. Preliminära resultat i vårt labb börjar nu att belysa en mer exakt beskrivning av de tidiga Gr-1 + / CD11b + celler som infiltrerar gal-1-brist gliom mikromiljö. Experiment som innefattar anti Ly6G (klon: 1A8) och anti-Ly6C (klon: AL-21) antikroppar tillsammans med anti-CCR2-antikroppar indikerar nu att GR-1 hög / CD11b + -celler infiltrera den tidiga gal-1-saknande tumörmikromiljö överensstämmer med Ly6C hög / CCR2 höga inflammatoriska monocyter, även om ytterligare experiment krävs för att bekräfta detta resultat (data ej visade).
På grund av cell förlorar som kan uppstå under upprepad centrifugering och resuspension stegen i att isolera gliom-infiltrera PBMC, är det troligt att observerade blodkroppar är i själva verket lägre än vad är närvarande i den intakta hjärnan. Men skillnaderna mellan experimental grupper bör hålla om motsvarande volymer av 37/70 densitetscentrifugering media gränssnitt extraheras och om hela volymen av varje prov analyseras av flödescytometern. Underlåtenhet att följa dessa steg kommer att leda till orättvisa jämförelser mellan prov och kommer att hindra opartisk analys. Oförmågan att kvantifiera det exakta antalet PBMC som förs in i hjärntumören mikro är inte en begränsning som är specifik för detta protokoll. Alternativa metoder såsom immunohistologiska cellräkningsstrategier är också föremål för fel på grund av extrapoleringar av totala cellantalet baserat på stereologisk räkningar och kravet på motsvarande bildtröskel på vävnadssnitt micrographs, som kan skilja sig i deras nivå av bakgrundsfärgning, som kan leda till falska -negativ eller falskt positiva signaler. Ändå bör en jämförelse av tidsförlopp analys mellan olika analysmetoder avslöjar tidsberoende immun tillströmning kurvor med liknande övergripande formen. Enytterligare nackdel med immunhistokemiska metoder är oförmågan hos vissa antikroppar validerade för flödescytometri för att binda till motsvarande antigen epitop inom ramen för formalinfixerade hjärnvävnadssnitt.
Det finns några viktiga steg i detta protokoll som kan tjäna som begränsningar för dem obekanta med sin metodik. Ett sådant steg är skörd av hjärnan från kraniet utan att skada den. Vi föreslår att öva teknik flera gånger innan du kör riktiga experiment. Eftersom hjärnan så småningom kommer att finfördelas, mindre skador på de ytliga skikten av hjärnan sannolikt oviktiga för den exakt kvantifiering av gliom-infiltrerande PBMC. Ett andra steg som oerfarna utredare initialt kan finna svårt är häll av densiteten centrifuge media lutning. De experimentalister förmåga att bilda ett rent gränssnitt medan ovanpå de 2 ml av 37% densitetscentrifuge media ovanpå70% skiktet är avgörande för reproducerbar isolering av PBMC. Även om detta steg initialt kan vara utmanande, kolossalt berikar det för PBMC och minskar dramatiskt den tid som annars krävs för provanalys om hela hjärnan vävnad där analyseras flöde cytometrically. PBMC anrikning minskar också det totala antalet händelser som kan iakttas genom flödescytometern, vilket minskar .fcs filstorlekar och bidra till att lösa sällsynta hjärn-infiltrerande immuncellpopulationer. För bästa resultat att etablera en ren densitetscentrifugering gränssnitt rekommenderar vi att hälla 37% densitetscentrifugering media med ett P-1000 mikropipett med blank kolv åtgärder. Vinkla 15 ml centrifugrör ca 20-30 ° ovanför bänk. Vila spetsen på mikropipett på den sida av röret 3-5 ml tecknen över ytan av det 70% densitetscentrifugering medieskikt. Häll stadigt och långsamt så att minimera öppen utåt fart av 37% densitetscentrifugering medier som det extrudes från mikropipett spets för att undvika att störa den underliggande 70% densitetscentrifugering media. Slutligen, det faktum att hjärnvävnaden arkitekturen nödvändigtvis förstörs i processen att isolera gliom-infiltrera PBMC innebär att ytterligare möss kommer att krävas för att få tidpunkt matchade histologiska data.
Nyare gliom modeller som genereras genom injektion av onkogen plasmid DNA i normala gnagare hjärnan har utvecklats under de senaste åren 26-32. Dessa "endogena" tumörmodeller kringgår potentiella artefakter som orsakas av stereotaktiskt engrafting ex vivo cancerceller och närmare efterlikna de histologiska kännetecknen för klinisk gliom. Den metod som beskrivs här är väl lämpad för att studera immuninfiltrations händelser som kännetecknar dessa mer kliniskt relevant modellsystem. Studier av immun tillströmning i neonatala möss kan också genomföras med användning av denna metod, även om densiteten för neonatal mouse hjärnan är mindre än den hos vuxna, som kan kräva en optimering av den enzymatiska digeresteget för att förhindra överdigerering av hjärnvävnaden. Ytterligare tillämpningar av tekniken inkluderar undersökningar om alternativa klasser av inflammatorisk hjärnsjukdom bortsett från maligna tumörer såsom experimentell allergisk encefalomyelit (EAE) och immunsvar på virusinfektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health / National Institute of neurologiska sjukdomar och Stroke (NIH / NINDS) beviljar R01-NS074387, R01-NS057711 och R21-NS091555 till MGC; NIH / NINDS beviljar R01-NS061107, R01-NS076991, R01-NS082311 och R21-NS084275 till PRL; bidrag från Leas lyckliga hjärtan, University of Michigan Comprehensive Cancer Center tilldelas MGC och PRL; Institutionen för neurokirurgi, University of Michigan School of Medicine; Michigan Institutionen för klinisk och hälsoforskning, med stöd av NIH bidrag 2UL1-TR000433; University of Michigan Cancer Biology Training Grant stöds av NIH / NCI (National Cancer Institute) bidrags T32-CA009676; University of Michigan utbildning i klinisk och grundläggande neurovetenskap stöds av NIH / NINDS bevilja T32-NS007222; och University of Michigan Medical Scientist Training Program som stöds av NIH / NIGMS (National Institute of General Medicine Sciences) bevilja T32-GM007863. Författarna enre tacksam för akademiskt ledarskap och stödet från Dr. Karin Muraszko och Department of Neurosurgery, M. Dahlgren, D. TOMFORD och S. Napolitan för suverän administrativt stöd; M. Dzaman för enastående tekniskt stöd; och Phil F. Jenkins för generöst stöd för inköp av en Zeiss 3D svepelektronmikroskop. Vi erkänner också Kuchroo laboratorium vid Harvard Medical School som en modifierad version av densitetscentrifugering media-medierad strategi för isolering av hjärnmononukleära celler drogs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modification of Eagles Medium | Gibco | 12430-054 | with 4.5g/L D-glucose, L-glutamine, 25 mM HEPES and phenol red |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Gibco | 14190-144 | without calcium chloride or Magnesium chloride |
| Fetal bovine serum | Omega Scientific Inc. | FB-11 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 10,000 U/ml Penicillin; 10,000 μg/ml Streptomycin |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | 200 mM |
| G418 sulfate | Omega Scientific Inc. | GN-04 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P8833 | from Streptomyces alboniger |
| HyClone HyQTase non-mammalian trypsin alternative | Thermo Scientific | SV30030.01 | in DPBS with EDTA |
| Phase contrast hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | 0.1 mm deep |
| Trypan blue stain | Gibco | 15250-061 | |
| Sterile 0.9% NaCl injection, USP | Hospira | NDC: 0409-4888 | 10 ml vials |
| 0.6 ml conical polypropylenemi microtubes | Genesee Scientific | 22-272 | |
| Atipamezole hydrochloride injection | Orion Pharma | NDC: 52483-6298 | 5 mg/ml solution |
| Ketamine hydrochloride injection | Fort Dodge | NDC: 0409-2051 | 100 mg/ml solution |
| Dexmedetomidine hydrochloride injection | Zoetis | NDC: 54771-2805 | 0.5 mg/ml solution |
| Xylazine hydrochloride injection | Lloyd | NDC: 61311-481 | 100 mg/ml solution |
| Carprofen injection | Pfizer | NDC: 61106-8501 | 50 mg/ml solution |
| Buprenorphine hydrochloride injection | Reckitt Benckiser | NDC: 12496-0757 | 0.3 mg/ml ampuls |
| 1 ml tuberculin syringes | Covidien | 8881501400 | |
| 26G x ½ (0.45 mm x 13 mm) syringe needles | BD | 305111 | |
| Surgical clippers | 3M | 9661 | |
| Providone-iodine solution | Aplicare | 82-217 | NDC: 52380-1905 |
| Sterile petrolatum ophthalmic ointment | Dechra | NDC: 17033-211 | |
| 70% isopropyl alcohol prep pads | Kendall | 6818 | |
| Sterile gauze | Covidien | 8044 | non-woven, 4" x 4", 4-ply |
| 1.7 ml conical polypropylene microtubes | Genesee Scientific | 22-281 | |
| Mouse stereotactic frame | Stoelting | 51730 | |
| Surgical lamp | Philips Burton | CS316W | Coolspot II Variable Spotlight |
| Curved dissecting forceps | Ted Pella Inc. | 5431 | |
| Colibri retractors | FST | 17000-03 | |
| Cordless precision power drill | Dremel | 1100-01 | Stylus model; 7.2-Volt Lithium-Ion with Docking Station |
| Engraving Cutter | Dremel | 105 | 1/32" or 0.8 mm bit diameter |
| Microliter syringe | Hamilton | 75 | Hamilton Microliter Syringes 700 series; 5 μl volume |
| Microliter syringe needles | Hamilton | 7762-06 | 33 G, small hub RN NDL, 1.5 in, point style 3, 6/PK |
| Ethilon 3-0 black monofilament nylon sutures | Ethicon | 1663 | |
| Magnetic stir bar | VWR | 74950-296 | 7.9 mm diameter x 50 mm length (5/16" diameter x 2" length) |
| 1 L glass screw-cap storage bottle | Corning | 1395 | Type 1, Class A borosilicate glass |
| Heparin sodium | Sagent | NDC: 25021-400 | 1,000 U/ml solution |
| Peristaltic pump | Cole Parmer Instruments Group | 77200-60 | Master Flex Easy Load II console drive |
| compressed carbogen (95% O2 / 5% CO2) | available from local vendor | N/A | A-type, large cylinder |
| 20 G x 1 ½" aluminum hub blunt needles | Kendall | 8881202363 | 0.9 mm x 38.1 mm |
| Polyurethane ice bucket | Fisherbrand | 02-591-45 | Capacity: 0.152 oz. (4.5L) |
| Collagenase (Type I-S) | Sigma Aldrich | C1639 | from Clostridium histolyticum |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemical Corp. | LS002007 | >2,000 Kunitz units per mg dry weight |
| Antistatic polystyrene hexagonal weighing dishes | Ted Pella Inc. | 20157-3 | top I.D. 115 mm, base I.D. 85 mm, 203 ml volume |
| Stainless steel single edged razor blades | Garvey | 40475 | |
| Bone rongeurs | FST | 16001-15 | |
| Hemostat | FST | 13014-14 | |
| Large dissection scissors | Ted Pella Inc. | 1316 | |
| Small dissection scissors | FST | 14094-11 | |
| Blunt end forceps | Ted Pella Inc. | 13250 | |
| 7 ml glass Dounce tissue grinder | Kontes | KT885300-0007 | |
| Percoll Density Centrifugation Media | GE Healthcare | GE17-0891-01 | |
| 10 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-104 | single use; sterile |
| 70 μm sterile nylon mesh cell strainers | Fisherbrand | 22363548 | |
| Alexa Fluor 700-conjugated rat anti-mouse CD45 (clone: 30-F11) | Biolegend | 103128 | |
| APC-conjugated mouse anti-mouse NK1.1 (clone: PK136) | eBiosciences | 17-5941-82 | |
| PE-conjugated rat anti-mouse Gr-1 (clone:RB6-8C5) | BD Pharmigen | 553128 | |
| PerCP/Cy5.5-conjugated rat anti-mouse CD11b (clone: M1/70) | Biolegend | 101228 | |
| Alexa Fluor 700-conjugated rat IgG2b, κ (clone: RTK4530) isotype control | Biolegend | 400628 | |
| APC-conjugated mouse IgG2a, κ (clone: eBM2a) isotype control | eBioscience | 17-4724 | |
| PE-conjugated rat IgG2b, κ (clone: eB149/10H5) isotype control | eBioscience | 12-4031-82 | |
| PerCP/Cy5.5-conjugated rat IgG2b, κ (clone: RTK4530) isotype control | Biolegend | 400632 | |
| Pacific Blue-conjugated mouse anti-mouse granzyme B (Clone: GB11) | Biolegend | 515403 | |
| Pacific Blue-conjugated mouse IgG1, κ (Clone: MOPC-21) isotype control | Biolegend | 400151 | |
| Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | |
| 15 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-103 | conical bottom |
| 50 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-108 | conical bottom |
| 12 mm x 75 mm round-bottom polypropylene FACS tubes | Fisherbrand | 14-956-1B | |
| FACSAria Special Order Research Product flow cytometer/cell sorter | BD | 650033 | |
| Class II Biological Safety Cabinet | The Baker Company | SG603 | model: SterilGARD III Advance |
References
- Bleeker, F. E., Molenaar, R. J., Leenstra, S. Recent advances in the molecular understanding of glioblastoma. J Neurooncol. 108, 11-27 (2012).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352, 987-996 (2005).
- Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011. Neuro Oncol. 16, Suppl 4. iv1-63 (2014).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523, 337-341 (2015).
- Kennedy, B. C., et al. Tumor-associated macrophages in glioma: friend or foe? J Oncol.. 2013, 486912 (2013).
- Markovic, D. S., Glass, R., Synowitz, M., Rooijen, N., Kettenmann, H. Microglia stimulate the invasiveness of glioma cells by increasing the activity of metalloprotease-2. J Neuropathol Exp Neurol. 64, 754-762 (2005).
- Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E.
- Kmiecik, J., et al. Elevated CD3+ and CD8+ tumor-infiltrating immune cells correlate with prolonged survival in glioblastoma patients despite integrated immunosuppressive mechanisms in the tumor microenvironment and at the systemic level. J Neuroimmunol. 264, 71-83 (2013).
- Yang, I., Han, S. J., Sughrue, M. E., Tihan, T., Parsa, A. T. Immune cell infiltrate differences in pilocytic astrocytoma and glioblastoma: evidence of distinct immunological microenvironments that reflect tumor biology. J Neurosurg. 115, 505-511 (2011).
- Wagner, S., et al. Microglial/macrophage expression of interleukin 10 in human glioblastomas. Int J Cancer. 82, 12-16 (1999).
- El Andaloussi, A., Lesniak, M. S. An increase in CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells in tumor-infiltrating lymphocytes of human glioblastoma multiforme. Neuro Oncol. 8, 234-243 (2006).
- Kostianovsky, A. M., Maier, L. M., Anderson, R. C., Bruce, J. N., Anderson, D. E. Astrocytic regulation of human monocytic/microglial activation. J Immunol. 181, 5425-5432 (2008).
- Curtin, J. F., et al. HMGB1 mediates endogenous TLR2 activation and brain tumor regression. PLoS Med. 6, e10 (2009).
- Curtin, J. F., et al. Fms-like tyrosine kinase 3 ligand recruits plasmacytoid dendritic cells to the brain. J Immunol. 176, 3566-3577 (2006).
- Mineharu, Y., et al. Engineering the brain tumor microenvironment enhances the efficacy of dendritic cell vaccination: implications for clinical trial design. Clin Cancer Res. 17, 4705-4718 (2011).
- Larocque, D., et al. Exogenous fms-like tyrosine kinase 3 ligand overrides brain immune privilege and facilitates recognition of a neo-antigen without causing autoimmune neuropathology. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 14443-14448 (2010).
- Curtin, J. F., et al. Treg depletion inhibits efficacy of cancer immunotherapy: implications for clinical trials. PLoS One. 3, e1983 (2008).
- Ali, S., et al. Combined immunostimulation and conditional cytotoxic gene therapy provide long-term survival in a large glioma model. Cancer Res. 65, 7194-7204 (2005).
- Dewey, R. A., et al. Chronic brain inflammation and persistent herpes simplex virus 1 thymidine kinase expression in survivors of syngeneic glioma treated by adenovirus-mediated gene therapy: implications for clinical trials. Nat Med. 5, 1256-1263 (1999).
- Baker, G. J., et al. Natural killer cells eradicate galectin-1-deficient glioma in the absence of adaptive immunity. Cancer Res. 74, 5079-5090 (2014).
- Baker, G. J., et al. Mechanisms of glioma formation: iterative perivascular glioma growth and invasion leads to tumor progression, VEGF-independent vascularization, and resistance to antiangiogenic therapy. Neoplasia. 16, 543-561 (2014).
- Ormerod, M. G., Novo, D. Flow cytometry : a basic introduction. , (2008).
- Stirling, D. P., Yong, V. W. Dynamics of the inflammatory response after murine spinal cord injury revealed by flow cytometry. J Neurosci Res. 86, 1944-1958 (2008).
- Hirai, T., et al. The prevalence and phenotype of activated microglia/macrophages within the spinal cord of the hyperostotic mouse (twy/twy) changes in response to chronic progressive spinal cord compression: implications for human cervical compressive myelopathy. PLoS One. 8, e64528 (2013).
- Fleming, T. J., Fleming, M. L., Malek, T. R. Selective expression of Ly-6G on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family. J Immunol. 151, 2399-2408 (1993).
- Wiesner, S. M., et al. De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA. Cancer Res. 69, 431-439 (2009).
- Holland, E. C., et al. Combined activation of Ras and Akt in neural progenitors induces glioblastoma formation in mice. Nat Genet. 25, 55-57 (2000).
- Lynes, J., et al. Lentiviral-induced high-grade gliomas in rats: the effects of PDGFB, HRAS-G12V, AKT, and IDH1-R132H. Neurotherapeutics. 11, 623-635 (2014).
- de Vries, N. A., et al. Rapid and robust transgenic high-grade glioma mouse models for therapy intervention studies. Clin Cancer Res. 16, 3431-3441 (2010).
- Uhrbom, L., et al. Ink4a-Arf loss cooperates with KRas activation in astrocytes and neural progenitors to generate glioblastomas of various morphologies depending on activated Akt. Cancer Res. 62, 5551-5558 (2002).
- Marumoto, T., et al. Development of a novel mouse glioma model using lentiviral vectors. Nat Med. 15, 110-116 (2009).
- Assanah, M., et al. Glial progenitors in adult white matter are driven to form malignant gliomas by platelet-derived growth factor-expressing retroviruses. J Neurosci. 26, 6781-6790 (2006).
