Abstract
생체 내에서 혈관 벽을 라이닝 내피 세포 (EC에)는 끊임없이 유동에 노출되어 있지만, 배양되는 EC 종종 정적 조건 하에서 성장 및 염증성 표현형을 나타내고있다. 미세 유체 장치의 개발이 20 년간 엔지니어들이 채택되었지만, 생물학적 응용은 제한 남아있다. 생물학적 응용 프로그램에 의해 검증보다 생리 학적으로 관련 시험 관내 미세 혈관 모델들이 필드에 발전 생체 사이 시험관 연구에서 격차를 해소하는 것이 중요하다. 여기서는 장기 관류 용량을 갖는 미세 유동 장치를 이용하여 배양 된 미세 혈관 네트워크의 개발을위한 상세한 절차를 제시한다. 또한, 종래의 공 초점 및 형광 현미경을 사용하여 실시간으로 EC [칼슘] i 및 산화 질소 (NO)의 생산에서 작용제 - 유도 변화의 정량적 측정을위한 응용 프로그램을 보여준다. 형성된 미세 혈관 순연속 관류와 작업이되는 EC 사이의 잘 발달 된 접합을 보여 주었다. 분포를-cadherin의 VE 것은 정적 배양 EC 단층보다 그대로 미세 혈관에서 관찰에 가까운이었다. EC의 일시적인 증가가 유도 ATP [CA는 2+] i 및 NO 생산은 정량적 배양 된 미세 혈관의 기능을 검증 개별 셀 레벨에서 측정되었다. 이 마이크로 유체 장치는 내장 컴퓨터가 기존의 정적 2D 문화보다 생체 내에서의 세포 배양 환경을 가까이하게 잘 조절, 생리 학적으로 관련 흐름에 따라 증가 할 수 있습니다. 마이크로 채널 네트워크 설계 다용도이며, 제조 공정이 단순하고 반복적이다. 이 장치는 쉽게 고해상도 영상화를 가능하게하는 공 초점 현미경 또는 종래의 시스템에 통합 될 수있다. 배양 된 미세 혈관 네트워크가 일차 인간 EC에 의해 형성 될 수 있기 때문에, 가장 중요한 것은,이 방법은 방법을 조사하기 위해 유용한 도구가 될 것병리학 적으로 환자 샘플에서 변경된 혈액 성분은 인간의 내장 컴퓨터에 영향을 미치는 임상 문제에 대한 통찰력을 제공합니다. 또한, 약물 스크리닝을위한 플랫폼으로 개발 될 수있다.
Introduction
생체 내에서 혈관 벽을 라이닝 내피 세포 (EC에)는 끊임없이 유동에 노출되어 있지만, 배양되는 EC 종종 정적 조건 하에서 성장 및 염증성 표현형 1,2 나타내고있다. 미세 유체 기술은 원하는 유량 조건 하에서 성장하기 위하여, 특히 혈관의 EC를 들어, 세포 배양을위한 기회를 제공하는 마이크로 기하학적 제약 (서브 밀리미터) 채널 (3)을 통해 유체를 정밀하게 제어 할 수있다. 이러한 기능은 기존의 정적 차원 세포 배양에 비해 생체 내에서의 세포 배양 조건을 가까이합니다. 그들은 마이크로 유체 장치 vasculatures의 다른 유형을 모델링하는 데 사용되는 기계적 및 / 또는 화학적 자극에 대한 EC의 반응을 연구 할 때 매우 중요하다.
정적 세포 배양, 생물 의학 F의 적응과 미세 유체의 응용 프로그램을 통해 마이크로 네트워크에 의해 입증 장점에도 불구하고의 ield 제한 남아있다. 최근의 검토에 의해보고되는 경우,이 필드 (85 %)의 서적의 대부분은 공학 저널 (4)에 정지한다. 미세 유체 장치의 성능은 대부분의 생물 학자들이 같은 트랜스 웰 분석이 소형 장치에 매크로 규모의 배양 접시 / 유리 슬라이드로 현재 기술로 전환하기에 충분한 납득되지 않았습니다. 미세 유체 앞으로이 필드를 이동하는 학제 간 협력을 필요로하는 종합 분야입니다. 이 기술 문서의 목적은 생물학적 응용 및 미세 미세 혈관의 기능 검증을 제공하면서, 기술 분야 사이의 갭을 감소시키고 생물에 의한 제조 방법을 이해할 수 있도록하는 것이다. 시각화 실험 프로토콜은 마이크로 유체 장치 및 엔지니어와 생물 학자들 사이의 긴밀한 협력을 나타내는 생물학적 유틸리티, 모두의 제조를 포함한다.
우리는 최근 몇 가지를보고미세 유동 장치 (5) 시험 관내 미세 혈관 망을 이용하여 생물학적 응용. 적절히 원하는 전단 응력을 마이크로 네트워크의 치수를 설계 및 적용하기 위해서, 수치적인 모델 밀접 유량 프로파일을 추정하는 전산 유체 역학 소프트웨어를 사용하여 구축 하였다. 즉, 합류에 도달 마이크로에 접종 한 기본 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVECs를)은 연속 관류 3-4 일, 마이크로의 전체 내부 표면에 덮여있다. 적절한 배리어 형성 정적 세포 배양 조건에서 미세 혈관 손상에 형성된 것과 비교 VE-cadherin의 염색에 의해 증명되었다. 개별적으로 관류 그대로 미세 혈관 6-8에서 개발 된 실험 프로토콜을 적용하여, 우리는 정량적으로 EC의 변화를 측정 [칼슘 2 +] i와 산화 질소 (NO) 형광에서와 아데노신 삼인산 (ATP)에 응답하여 생산에 모아와 공 초점 및 기존의 형광 현미경. EC의 효능 유발 증가 [칼슘 2 +] i와 NO 생산은 미세 혈관 투과성 6-15에 염증 매개체에 의한 증가에 필요한 세포 내 신호로보고되고있다. 일부 이전 연구는 DAF-2 DA로드 미세 유체 장치 (16, 17)의 이미지를 보여 주었다 있지만, 적절한 해상도와 데이터 분석은 아직 18을 달성하지 않았다. 우리의 지식으로,이 연구는 내피 세포에 작용 물질에 의한 동적 변화 [칼슘 2 +] i와 NO 생산 이용한 미세 유체 기반 시스템의 첫 번째 양적 측정을 보여줍니다.
미세 가공 기술이 몇 마이크론 마이크로 채널을 제조 및 생체 내 미세 혈관의 형상을 모방하는 복잡한 패턴의 개발을 가능하게 할 수있는 유연성을 가지고있다. 여기에서 우리는 분기의 세 가지 수준으로 일반적인 마이크로 채널 네트워크를 발표했다. 이네트워크는 미세 크린룸 소프트 리소그래피에서 수행되는 리소그래피의 조합에 의해 제조된다.
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Protocol
1. 미세 유체 소자의 제작
- SU-8 (50) 마스터 금형의 표준 포토 리소그래피 제작
- 스핀 코팅 전에 실리콘 웨이퍼를 청소합니다. 15 분 동안 이소 프로필 알콜 (IPA) 다음에 15 분 동안 아세톤 노출 된 2 인치 실리콘 웨이퍼를 헹군다. 1 시간 동안 150 ℃에서 핫 플레이트 상에 배치하여, 웨이퍼 탈수. 탈수 후, 실온에서 웨이퍼를 냉각.
- 스핀 코트 SU-8 포토 레지스트와 실리콘 웨이퍼. 웨이퍼에 2 ㎖의 SU-8 포토 레지스트를 추가합니다. 30 초 동안 300 rpm으로 / 초 가속 1,000 rpm으로 다음 10 초 동안 100 rpm으로 / 초 가속에서 500 rpm으로,에 웨이퍼를 램프. (보충 비디오 1 참조)
- 프리 베이킹을 30 분 동안 95 ° C에서 10 분 후, 소프트 베이크와 65 ℃에서 핫 플레이트상에서 웨이퍼.
- 스핀 코팅 된 포토 레지스트에 영화 마스크에서 디자인 패턴을 변환하는 자외선 노출을 사용합니다. 막을 마스크로 얇은 투명 필름에 패턴을 인쇄. 의 상부에 마스크 필름을 놓고포토 레지스트 코팅 - 스핀과 300 엠제이 / cm 2의 용량과 UV에 노출. (보충 비디오 2 참조)
참고 :이 프로토콜에서, 마이크로 채널 네트워크 패턴 (159 μm의 폭 어머니 채널 사 100 ㎛ 폭 딸 채널로 분기) CAD 소프트웨어로 설계되어 있습니다. 필름상의 패턴 명확한 필드로 나타내고, 필름의 나머지 부분은 검은 색 잉크에 의해 덮여있다. SU-8 네가티브 포토 레지스트이므로, UV에 노출되는 포토 레지스트의 부분 가교 금형 개발 (단계 1.1.6) 중에 용매에 용해 될 것이다. 현상 후,이 불용 설계된 네트워크 패턴을 복제하고 마스터 몰드 역할을한다. - 포스트 베이크 1 분, 10 분 후, 95 ° C, 65 ° C에서 핫 플레이트상에서 노광 된 웨이퍼.
- 마스터 금형을 개발합니다. 용매로 사용 SU-8 개발자는 않은 가교 포토 레지스트를 제거합니다. 3 분 동안 SU-8 개발자의 웨이퍼를 담그고 IPA 씻어1 분.
- IPA 린스 후 더 흰색 줄무늬 형성 (비 경화 된 포토 레지스트의 잔류 물)가 없어 질 때까지이 개발주기를 2 ~ 3 번 반복합니다. 부드럽게 질소 가스로 웨이퍼를 건조하고, 현미경으로 패턴의 작은 특징을 검토한다. 필요한 경우 추가 개발주기를 반복합니다.
- 하드 15 분간 150 ℃에서 핫 플레이트 상에 웨이퍼 굽는다.
- 소프트 리소그래피
- 수동으로 중량의 두 부분으로 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 엘라스토머 (기본 및 경화제)을 섞는다. 10의 비율 : 1.
- 드 가스 15 분 동안 집 진공 연결 데시 케이 터와 PDMS 혼합물. 포토 레지스트 마스터 주형에 PDMS 용액 캐스트. PDMS의 두께는 상기 입구 / 출구 관의 안정된지지를 제공하는 이상 3mm 할 필요가있다. 탈 가스를 15 분 동안 다시 PDMS, 필요하다면 질소 가스 잔류 기포를 제거한다. 3 시간 동안 65 ° C의 오븐에서 주조 된 PDMS 큐어.
- 의 표면을 청소스카치 테이프와 플라즈마 세정기 (30 초 플라즈마 처리)을 유리 커버 슬립. 30 초 동안 500 rpm / sec 가속도에서 4000 rpm으로 램핑 유리 커버 슬립에 스핀 코트 미 경화 PDMS (0.5 mL)을 첨가 하였다. 적어도 30 분 동안 65 ° C의 오븐에서 PDMS 스핀 코팅 된 커버 슬립을 치료.
- 잘라 내기 및 마스터 몰드로부터 경화 된 PDMS를 놓습니다. 이어서 입구 및 머더 채널의 선단부에 직경 1mm의 구멍을 펀치와 출구를 생성한다.
- PDMS의 스핀 - 코팅 유리 커버 슬립에 접합 장치. PDMS의 표면을 산화 1 분 동안 플라즈마 클리너 커버 슬립. 산소 플라즈마 처리 후, 접착면에 탈 이온수 (DI 수)의 액체 방울을 배치하고, 함께 두 부분으로 놓는다. 영구적 결합을 달성하기 위해 30 분 동안 65 ° C의 오븐에서 장치를 굽는다.
2. 내피 세포 시드와 문화
- 장치 살균 및 피브로넥틴 코팅
- 산화에서 입구 / 출구 주위 PDMS 표면의 소수성을 유지. 입구 주위 PDMS 표면을 덮어 산화를 방지하기 위해 스카치 테이프의 작은 줄무늬 출구. 이 절차는 충전 공정 (2.1.3) 동안 장치의 상면 위에 모두 확산되는 DI 워터를 방지 할 수있다.
- 산소 플라즈마 FO하여 PDMS 소자 취급R 5 분 이와 같이, 표면이 소수성으로 변화 마이크로 채널을 통한 유체 유동을 용이하게하고, 충전 과정 (2.1.3)에서 기포 트랩을 방지 할 수있다.
- 입구에서 DI 워터와 장치를 채우기 위해 부착 된 바늘이나 피펫과 주사기를 사용합니다. 출구에서 축적 DI 물 (30 ~ 50 μL)의 비말이 될 때까지 충전을 계속한다. 마이크로 안에 갇혀 거품이 있는지 확인하기 위해 현미경 장치를 검사합니다. 종이 티슈로 입구와 출구에 과도한 물 방울을 제거합니다.
- 층류 바이오 안전성 후드에서 3 시간의 최소 UV와 배양 접시에서 장치를 소독. , 증발을 방지 PDMS의 얇은 조각으로 입구 / 출구를 커버하기 위해, 접시 내부에 젖은 종이 티슈를 넣고, 파라 필름과 접시를 포장.
- 코트 피브로넥틴 장치. (냉장 / ml의 피브로넥틴을 밤새 100 μg의 코트 한 후, 인산 완충 식염수 (PBS)로 먼저 장치 린스4 ° C). 입구에서 용액의 방울을 놓은 다음 집 진공, 바늘 또는 피펫 주사기와 출구에서 부압을 만듭니다.
- 세포 배양 미디어와 디바이스를 입력합니다. 세포 배양 배지를로드하기 전에 세 번 수동 PBS로 씻어 장치. 37 ° C에서 항온 장치를 워밍업.
- 되는 EC 시드 및 장기 관류
주 : 종래의 정적 2D EC 배양과 비교하여, 연속 관류와 시험 관내 미세 혈관 네트워크 모델이 가까운 생체 조건 세포 배양 환경을 만들었다. 이 프로토콜에서 입증 시험 관내 미세 혈관 네트워크는 2 주까지 유지 될 수있다. 잘 제어 관류는 지속적으로 영양분을 보충 폐기물을 제거하고 과도한 합류은 EC 단일 층의 방지 할 수 있습니다. 따라서, 다른 physiologica하에 세포 및 혈역학 적 환경을 흉내 장기적인 연구로 확장 될 수있다리터와 병리 적 상태.- 8 % 덱스 트란 (몰 중량 70,000)와 HUVEC 배양 배지에서 차 HUVECs를 (MCDB 131)를 섞는다. 덱스 트란은 로딩 매체의 점도를 증가시키고, 더 나은 셀 시딩 결과를 달성하기 위해 사용된다. 권장 세포 밀도는 약 2-4 × 106 세포 / ml이다.
- 장치에 세포를 시드. 입구를 통해 세포의 10 ~ 20 μl의 방울을 배치합니다. 어느 장치를 틸팅하거나, 모세관 작용이 출구 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 완만 한 흐름을 소개한다. 성공적인 셀 로딩 키는 유속을 최소 채널 내의 1mm 미만 / 초를 제어하는 것이다.
- 셀 시드를 확인합니다. 초기 접종 후, 현미경으로 시딩 상태를 확인하기 전에 15 ~ 20 분 (37 ℃, 5 % CO 2의 가습 된 분위기)에 장치를 배양한다. 필요한 경우, 원하는 세포 밀도를 달성하기 위해 추가의 셀 로딩을 수행한다.
- 부드럽게 (37 세포 배양 배지로 장치 린스° C)는 덱스 트란를 제거합니다. 배양 (37 ℃, 5 % CO 2) 배양기에서 처음 6 시간 동안 흐름이 없을 장치.
- 장기 관류 용 튜브 연결을 설정합니다. 이동을 방지하기 위해 배양 접시에 장치를 테이프입니다. 입구와 출구 튜브 삽입에 대한 페트리 접시의 뚜껑에 작은 구멍을 만듭니다. 세포 배양 미디어 관류 용 바늘과 주사기에 흡입 튜브를 연결합니다. 폐기물 수집에 출구 튜브를 연결합니다.
참고 : 장소 장치와 세포 배양 인큐베이터에서 쓰레기 수집기, 인큐베이터 외부의 관류 펌프를 배치하면서 긴 입구 튜브에 의해 장치에 연결합니다. 재관류 속도는 실험 설계에 의해 결정된다. 본 장치에서, 0.35 μL / 분의 재관류 속도, 1-2 다인 / ㎝ (2) 사이의 전단 응력 범위를 사용한다. 이 관류 조건 하에서, HUVECs를이 3-4 일 합류에 도달합니다.
3. Immunofluorescent 염색
- 30 15 분 동안 실온에서 PBS 1X 세척 한 다음 4 ℃에서 분, 30 분 동안 차단하고, 1 % BSA 2 % 파라 포름 알데히드의 관류 장치에 고정되는 EC. 세포 배양에 사용되는 것과 같은 재관류 속도를 사용한다.
- 0.1 % 트리톤 X-100 항체 염색을 위해 고정되는 EC Permeabilize 하시려면. 라벨에 5-7 분 동안 트리톤과 장치를 관류는-VE cadherin의, 및 레이블 F - 굴지 3 분.
- 장치에 항체를 넣습니다. 이전의 해결책을 씻어 15 분 동안 1X PBS로 관류 장치. 2 μg의 수동 / ㎖ (총 부피가 20 내지 50 μL 임)의 농도로 장치에 VE-cadherin의 (항 염소)에 대한 일차 항체로드. 4 ℃의 냉장고에 하룻밤 보관 장치. 45-60 분 동안 7 μg의 / ㎖의 농도로 시린지 펌프에 의해 이차 항체 (당나귀 항 - 염소) 관류.
- EC F를-굴지의 레이블 팔로이 딘과 함께. 1X PBS에 FO를 가진 장치를 관류수동으로 7-10 분 동안 팔로이 딘 (10 μg의 / ㎖)를로드하기 전에 R 15 분.
- 라벨 EC 핵 (자료 목록 참조).
- 1X PBS와 장치를 씻어, 및 이미징까지 4 ° C에서 그것을 유지한다.
내피 4. 형광 이미징 [칼슘 2 +] 난
- 알부민 장치 (10 ㎎ / ㎖), 37 ℃에서 15 분 동안 -Ringer의 용액을 관류. 즉, 세포 배양을 위해 사용 된 동일한 관류 속도를 사용한다. 알부민 링거액 모든 성분의 농도는 자재 목록에 설명되어있다.
- EC는 [칼슘 2 +] 내가 FLUO-오전 4시와 이미징 공 촛점 시스템을 설정합니다. 칼슘 이미징 공 초점 현미경 시스템을 사용합니다. 여기에 대한 아르곤 레이저 (488 nm의)를 사용하고 510-530 나노 미터로 방출 대역을 설정합니다. 512 X 512 스캔 형식에 : (0.95, 침수 NA를)은 25X의 목적으로 이미지를 수집합니다. 난 각 스택 2 ㎛의 Z-공정과 주사 간격을 사용20 초의 마법사.
- 알부민 링거액과 함께 루멘 FLUO-4 오전 세척 한 후, 37 ℃에서 40 분 동안 FLUO-오전 4시 (5 μM)와 장치를 관류.
- FLUO-4로드 미세 혈관의 이미지를 획득. 10 분 동안 기본 이미지를 수집합니다. ATP (10 μM)로 장치를 관류하고 20 분 동안 형광 강도 (FI)의 변화를 기록한다.
산화 질소 생산의 5 형광 이미징
- 15 분 동안 알부민 링거 용액으로 관류 장치. 세포 배양에 사용되는 것과 같은 재관류 속도를 사용한다.
- ATP 유도 된 산화 질소 생성을 측정하기 위해 형광 이미징 시스템을 설정한다. 12 비트 디지털 CCD 카메라와 산화 질소 측정을위한 컴퓨터 제어 셔터가 장착 된 현미경을 사용한다. 광원으로 75 W의 크세논 램프를 사용합니다.
주 : 간섭 필터 (40분의 480 ㎚) 및 다이크로 익 미러에 의해 DAF-2 DA위한 여기 및 발광 파장을 선택대역 통과 장벽 (505 ㎚) (50분의 535 ㎚). 이미지를 수집 : 20 배 대물 렌즈 (0.75 NA)를 사용합니다. 광표백을 최소화하기 위해, 간섭 필터 앞의 감광 필터 (0.5 N)을 배치하고 0.12 초의 노출 시간을 제한한다. - DAF-2 DA (5 μM)와 세포를로드합니다. 37 ° C에서 약 35-40 분 동안 DAF-2 DA로 관류 장치. 초기 로딩 후 DAF-2 형광 강도 (FI DAF)의 기준선을 기록합니다.
참고 : DAF-2 DA 실험 (7)에 걸쳐 관류에 지속적으로 존재한다. - DAF-2 이미지를 수집합니다. 5 분 동안 FI DAF의 기준선을 기록합니다. ATP (10 μM)로 관류 장치를 1 분 간격으로 30 분 동안 이미지를 수집한다. 동일한 초점 평면에서 셀의 동일한 그룹의 모든 이미지를 수집한다.
6. 데이터 분석
- 수동으로 개별 셀 수준에서 수집 된 이미지에서 관심 (로아)의 영역을 선택합니다. 마다ROI는 형광 윤곽에 의해 표시 될 수있는 하나의 개별 셀의 영역을 다루고 있습니다.
- 배경 형광을 빼기 각 로아의 평균 FI를 계산합니다.
- EC에서 ATP에 의한 변화를 측정 [칼슘 2 +] i와 NO 생산. (FI 0 알부민 벨소리 관류 동안 평균 기준 FI가 ATP를 추가하기 전에이다 FI / FI 0 * 100) FLUO-4 FI의 변화를 계산하여 EC [칼슘 2 +] 난에 ATP에 의한 변화를 정량화를 뺀 측정 배경. 시간 경과 FI DAF의 제 1 차동 변환을 수행함으로써 NO 생산 속도를 정량화 없다.
주 : FI DAF 시간 경과 시간과 누적 NO 생산을 나타낸다. 따라서, NO 생성 속도는 기초 및 ATP 조건을 자극 모두에서 FI DAF의 프로필을 기준으로 계산되지 않습니다. 데이터 분석 및 실험 절차의 세부 사항은 이전의 간행물 7에 기재되어있다.
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Representative Results
이 섹션에서는이 프로토콜을 개발 한 배양 된 미세 혈관 네트워크와 얻어진 결과의 일부를 보여줍니다. 마이크로 패턴은 세 개의 레벨 분기 네트워크 (도 1a)이다. 이 설계에서, 네 개의 100 ㎛ 폭 보조 채널로 다시이 126 μm의 넓은 채널, 나뭇 가지로 159 ㎛ 폭 어머니 채널 분기합니다. 의 3D 수치 시뮬레이션이 마이크로 네트워크 내에 전단 응력의 세 가지 레벨을 표시 0.35 μL / 분의 유속 (도 1b)에 따라 전단 응력 분포를 추정 하였다. 마이크로 채널 내의 층류를 교란 또는 보조 유동의 존재없이 유체 역학적으로 안정한 것으로 예상된다. SU-8 마스터 몰드는 표준 포토 리소그래피 공정 (도 1C)를 제조 하였다 후, PDMS 장치는 마이크로 채널 (NE)를 복제하는 소프트 리소그래피를 통해 제조 된투명, 공기 투과성 지지체 (- E 그림 1D)로 트워크 디자인. EC 시드 (그림 1 층 - G) 후 연속 관류 3-4 일되는 EC는 합류에 도달 성공적으로 마이크로의 내부 표면에 덮여있다.
EC F - 굴지 및 핵 형광 네트워크 내에서 표시 및 공 초점 이미지로 설명했다. 나머지 70 %는 지배적 주연 F 액틴 5의 조약돌 모양을 유지하는 반면 1.0 다인 / ㎠의 전단 응력에 따라, HUVECs를 약 30 % 증가 중앙 스트레스 섬유 흐름 방향을 따라 연장. 전단에 의한 세포의 형태 변화는 일반적으로 2D 정적 세포 배양에서 관찰 된 것보다 눈에 띄는 나타납니다. 실제 생체 내 조건에서의 EC는 용기의 종류가 다른 세포 형태를 가지고 있지만, 쉽게 유동 차에 응답하여 셀 형상을 변경하지nges. 추가 연구는 이러한 차이가 생체 조건에 가까운, 채널 구조 및 관류 환경의 결과인지를 결정하기 위해 필요하다.
우리는 또한 성공적으로 EC에서 ATP에 의한 변화 [칼슘 2 +] i와 NO 생산 (그림 4와 5) 측정. EC에서 ATP에 의한 일시적 증가 [칼슘 2 +] i와는 NO 생산. 평균 피크 FI의 FLUO-4는 ATP 관류 시작 후 35 ± 10 초에 발생 기준의 187 ± 22 %였다. 노 생성 속도 ATP 노출의 처음 5 분 이내에 분 당 1.18 ± 0.37 AU에 분 당 0.15 ± 0.05 AU의 기저 수준으로 증가 하였다. 모든 결과는 평균 ± 표준 오차 (SE)로보고 하였다. 이들은 개별적으로 관류 손상 세정맥 6,9,14,19로부터 유도되는 결과와 비교한다.
도 1 미세 유체 소자의 제작 및 EC 하중 (A)이 마이크로 네트워크의 개략도.. 마이크로 채널의 폭과 분기 각도 각 분지 수준으로 표시된다. (B) 전단 응력 분포의 수치 시뮬레이션. 유속은 0.35 μL / 분이다. 현상 후의 미세 채널의 높이를 80㎛이다. 이 두 수치는 추가 세부 사항 5 이전의 출판물에서 수정되었습니다. (C) 마스터 몰드의 개발. 마이크로 네트워크의 마스터 주형은 실리콘 웨이퍼 상에 SU-8 포토 레지스트로 제조된다. (D) 소프트 리소그래피 방법. PDMS 혼합물 마스터 주형에 주조하고 오븐에서 경화시킨다. 기판 (E) 접합 PDMS 채널. 이 장치에 사용되는 기판은 커버 슬립의 SPI이다N PDMS의 얇은 층으로 코팅. 입구와 출구는 구멍 구멍을 뚫는 만들어집니다. (F 및 G) EC로드. 셀 솔루션의 약 10 μL은 입구에 배치됩니다. 부드러운 흐름은 모세관 유동을 통해 출구에서 파스퇴르 피펫을 배치하여 유도된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2 : 배양 마이크로 네트워크 EC F 액틴 공 촛점 이미지 (A)는 네트워크 디자인의 개략도.. B에 도시 된 선택 영역 - D 그래프에 나타내었다. (B - D) 시험 관내 미세 혈관 네트워크의 EC F - 굴지 (적색)과 핵 (파란색)의 공 촛점 이미지 B 1. C (1) 및 D (1) 상위 마이크로 화상 스택 하프 및 B 2, C (2) 및 D (2)로부터 투사 된 이미지는 이미지 스택의 하반부로부터의 화상 예측되고있다. D 1, 스케일 바 = 100 μm의 - E.는 단면도 B 1에 1-1 '2-2'3-3 '로 표시. 이러한 이미지는 이전 발행 5에서 적응하고 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 :의 비교는 VE-cadherin의의 정적 배양 EC 단층 그대로 쥐 장간막 세정맥 배양 미세 혈관 네트워크의 분포를 (.
그림 4 : EC [칼슘의 ATP에 의한 증가 P>] 내가. 실험은 4 장치 및 기기 당 7 ~ 12 로아 (개인되는 EC)에서 수행 하였다는 데이터 분석을 위해 선정되었다. (A) ATP의 시간 코스 (10 μM)는 하나의 대표 실험에서 EC [칼슘 2 +] 나는 (FLUO 4 FI / FI SE ± 0 × 100 %)의 변화를 유도 된. (B) (데이터가 같다) 대표적인 실험의 이미지. 이것은 이전에 게시 된 그림 5입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : NO 생성을 ATP 유발하지 실험은 3 장치에서 수행하고, 디바이스 당 11 ~ 12 로아 (개인되는 EC)는 데이터 분석을 위해 선정되었다.. (A DAF는 Y 축 왼쪽, SE를 ±). 은 NO 생산 속도 (DF / DT, 점선)은, 축적 FI DAF (오른쪽 Y 축)의 제 1 차동 변환으로부터 유도되지 않았다. (B) 한 실험에서 대표 이미지. FI DAF 더 NO와 반응하는 세포 DAF-2의 충분한 양을 나타내는 무 공여체, 나트륨 니트 로프 루시드 (SNP)가, 관류 액에 첨가되지 않은 이후에 증가했다. 이것은 이전에 게시 된 그림 5입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 글에서, 우리는 배양 된 미세 혈관 네트워크의 개발을위한 상세한 프로토콜을 제시, EC 접합 및 F-굴지의 유통 세포 골격 특성화 및 EC의 정량적 측정 [칼슘 2 +] i와 미세 유체 장치를 이용하여 NO 생산. 관류 미세 유체 장치는 생체 내 미세 혈관 형상과 전단 유동 조건의 가까운 시뮬레이션을 허용하는 체외 모델을 제공합니다. 배양 된 미세 혈관 네트워크가 일차 인간 EC에 의해 형성 될 수 있기 때문에,이 방법은 환자의 시료로부터 변형 된 혈액 성분이 배양 된 미세 혈관에 환자의 혈액 시료를 직접 관류 인간 EC에 영향을 미치는지 병리학 연구 및 임상에 대한 통찰력을 제공 할 수있는 유용한 수단이 될 수있다 문제. 미세 혈관의 EC 개발 인간은 인간과 동물의 조직과 약물 반응에 잠재적 불일치를 피하기 위해 약물 스크리닝에 사용될 수있다.
ve_content ">이 프로토콜에 도시 된 미세 유동 장치의 기판 상에 스핀 코팅 된 PDMS의 얇은 층이. PDMS이 박층 고해상도 살아있는 조직 실시간 필수 인 유리 커버 슬립 (150-180 μm의) 인 큰 개구 목적은 보통. 마이크로 채널 (서브 밀리미터 범위) 내에서 층류를 짧은 작동 거리가 매우 낮은 레이놀즈 수 있고, 압력 차 선형 흐름과 관련되어 있기 때문에 영상은, 따라서 전단 응력 분포 전적으로 의존 채널 기하학. 따라서,. 고정밀 관류 펌프 (20)에 의해 잘 제어 할 수있는 우리의 현재 연구에서 HUVEC를 배양 미세 혈관 망에인가되는 전단 응력에서 10 다인 / cm 2로 일 사이였다 정맥 시스템 (21, 22)에서 측정 된 전단 응력의 범위. 병렬 흐름 챔버와 같은 매크로 유체 시스템은 복잡한 흐름 패턴 없다. 더 큰 규모의 흐름 챔버 (mm-cm 범위)되는 EC는 일반적으로 만 생체 내 미세 혈관에 기하학적 유사성을 부족, 바닥면 (2 차원 단층)에서 재배된다. 유동 챔버의 폭은 2mm를 초과하면, 균일 한 흐름은 수 밀리미터 떨어진 출구 / 입구에서 통상의 영역에 국한 멀리, 측벽 (23)으로부터 몇 백 미크론이다. 챔버의 폭 cm의 범위로 증가되는 경우, 흐름은 다양한 유선으로 분화되고 유속은 전체 영역 (24)에 걸쳐 변화 할 것이다. 또한, 대규모 유동 챔버는 마이크로 채널과 동일한 전단 응력을 달성하기 위해 적어도 100 배 더 관류 소비한다. 마이크로 네트워크 내에 전단 응력 분포를 수치 모델링 도구를 사용하여 시뮬레이션 될 수 있고, 고정 비압축성 비어 - 스토크 스 방정식 대부분 유한 요소 소프트웨어에 의해 해결 될 수있다.미세 유동 장치는 자장하게 만들어 질 수있다즉 마스크 미세 가공 방법. 배양 된 미세 혈관 개발의 성공은, 그러나, 상세한 설명에 특별한 주목을 필요로한다. 마이크로 채널에 상기 용액을로드 한 후, 각 디바이스는 EC 파종 전에 현미경 버블 트래핑 대해 확인을받을 필요가있다. 기포가 발생하면 PDMS는 통기성 재료, 폐쇄 유출구 입구에서 유압을 적용하여이 단계에서 밖으로 강제로 정지 할 수있다. 소망의 재관류 속도를 유지하기 위해 누설없이 긴장 압박는 니들 / 튜빙 모든 연결에 대한 필요가있다. 일치하는 구멍 구멍을 뚫는 및 튜브 사이즈는 꽉 피팅을 달성하는 것이 중요하다. 유량의 정확한 전달을 보장하기 위해 관류 펌프 장치의 주사기는 동일한 레벨에 위치한다. 관류를 변경하려면, 삽입 튜브 부드럽게하는 스트레칭을 피하기 위해 장치로부터 분리한다. 전단 응력 단계 증가 (18 시간의 증가와 같은 10 단계)을 증가시키기 위해 recommen은갑자기 흐름의 변화를 피하기 위해 DED는 EC의 박리가 발생했습니다.
개별적으로 관류 그대로 미세 혈관을 수행 이전 연구는 EC의 효능 유발 증가 [칼슘 2 +] 나는, 그 이후의 내피 세포의 산화 질소 합성 효소 (eNOS의) 활성화 및 NO 생산은 염증 상태 6,7에서 증가 미세 혈관 투과성에 필요한 신호를하는 것을 나타낼 , 9-13,25. 그것은 일반적으로 적혈구, 혈소판 응집, 부상 조직이나 생체 내에서 염증 상태로 배포되기 때문에이 프로토콜에서 우리는, 대표적인 효능으로 ATP를 선택합니다. 형광 칼슘 인디케이터 FLUO-4 오전, ATP 조사 후 내피의 변화 [칼슘] I를 측정 하였다. 적 능력 배양 된 미세 혈관의 [칼슘 2 +] 내가 응답은 그대로 미세 혈관 7,9에서 발견되는 것과 유사하다. EC NO 생산을 측정하는 것은 생물 학자에 대해 기술적으로 도전하고있다.현재까지, 칼슘 지표 유사한 방식 NO 농도의 동적 변화를 검출 할 수없는 형광 표시는 없었다. DAF-2 DA 널리 NO 생성을 평가하지하는 데 사용되었습니다. 그러나 적절한 사용, 데이터 해석 및 데이터 분석은 사용자의주의를 환기 할 필요가있다. NO의 존재 DAF-2T에 DAF-2의 화학 변화하기 때문에, 검출 DAF 형광 강도 프로파일 NO 농도의 변화를 나타내지 않는다 (편도 변환) 26 비가역이다. 대신, 시간 축적 DAF-2T 생산을 나타낸다. 이 기준은 FI DAF 7,11의 제 1 차동 변환에 의해 유도 될 수 DAF-2 형광 (FI DAF) 곡선은 NO 생산 속도 (DF / DT)을 누적. 즉, FI 곡선의 기울기는 NO 생산 속도를 나타내고 고원상은 더 NO 생산을 증가하지 나타낸다. 변환 후, 데이터가이 프로토콜 (PR)에서 생성 된esented 두 기초 NO 생산 속도 및 미세 혈관 네트워크 내에서 개별 EC 수준에서 시간과 공간 해상도와 ATP의 질문에 답변 NO 생산의 변화.
이 광학적으로 투명하고 독성, 가스 투과성 부드러운 엘라스토머 27-30 PDMS 같이 현재 널리 미세 애플리케이션에 사용되어왔다. PDMS는 투과 물이 아닌 때문에, 우리는 직접 EC 단일 층의 투과도를 측정 할 수 없었다. 사람이 집중되었지만 이러한 한계를 극복하기 위해, 일부 애플리케이션은, 예를 들면 채널 (31)에 투석막을 통합 또는 마이크로 기둥 또는 미세 구멍 (32, 33)와 투과성 "윈도우 개구"를 만드는 것과, 상기 채널 벽 구조를 변형 이러한 하이드로 겔 또는 하이드로 겔 장치 / PDMS 하이브리드 장치 17,34-36 사용과 같은 디바이스 재료의 변형. 이러한 장치의 단점은 탈수 그들의 취약한 특성 및 상대적으로 미약하다 mechanical 속성은 스트레스 나 압력을 서있다. 기계적 강도와 투과성 재료의 미래 발전은 더욱 장치와 폭 넓은 생물학적 응용 프로그램에 대한 가능성을 향상시킬 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 경쟁의 이익 또는 충돌하는 이해 관계가 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 심장, 폐, 혈액 연구소에 의해 지원되었다 HL56237, 당뇨병과 소화기의 국립 연구소 및 신장 질환 연구소 DK97391-03, 국립 과학 재단 (NSF-1227359 및 EPS-1003907)를 부여합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Acetone | Fisher Scientific | A929 | |
| Biopsy punch | Miltex | 33-31 AA | |
| Bovine Albumin | MP Biomedicals | 810014 | |
| Bovine Brain Extract (BBE) | Lonza | CC-4098 | |
| Cover-slip | Fisher Scientific | 12-542C | |
| DAF-2 DA | Calbiochem | 251505 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | 31390 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody | Life technologies | A-11055 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-250 | |
| DRAQ5 (nuclei staining) | Cell Signaling Technology | 4084 | |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | Sigma-Aldrich | E2759-15MG | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | |
| Fibronectin | Gibco | PHE0023 | |
| Fluo-4 AM | Life technologies | F-14201 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| Gentamicin (50 mg/ml) | Gibco | 15750-078 | |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | 12-548B | |
| Glass Pasteur pippette | VWR | 14672 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3393-10KU | |
| HEPES Buffered Saline Solution | Lonza | CC-5024 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | CC-2517 | |
| Isopropyl alcohol (IPA) | VWR | 89125 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030-081 | |
| Mammalian Ringer Solution Ingredient | |||
| NaCl (132 mM) | Fisher Scientific | S671-3 | |
| KCl (4.6 mM) | Fisher Scientific | P217-500 | |
| CaCl2 · 2H2O (2.0 mM) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| MgSO4 ·7H2O (1.2 mM) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Glucose (5.5 mM) | Fisher Scientific | BP350-1 | |
| NaHCO3 (5.0 mM) | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Hepes Salt (9.1 mM) | Research Organics | 6007H | |
| Hepes Acid (10.9 mM) | Research Organics | 6003H | |
| MCDB 131 Culture Medium | Life technologies | 10372-019 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Phalloidin (F-actin staining) | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life technologies | 14040-133 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Corporation | Sylgard 184 | |
| Scalpel | Exel Int | 29552 | |
| Scotch tape | 3M | 34-8711-3070-3 | |
| Silicon wafer | VWR | 14672 | |
| SU-8 photoresist | MicroChem | SU-8 2050 Y111072 | |
| SU-8 developer | MicroChem | Y020100 | |
| tissue culture flasks | Sigma-Aldrich | Z707503-100EA | |
| Triton X-100 | Chemical Book | T6878 | |
| Trypsin Neutralizer solution | Gibco | R-002-100 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Gibco | R-001-100 | |
| Tubing | Cole-Parmer | PTFE microbore tubing, 0.012" ID x 0.030" OD | |
| VE-cadherin | Santa Cruz Biotechnology | SC-6458 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biosafety Laminar hood | NuAire | NU-425 Class II, Type A2 | |
| CCD camera | Hamamatsu | ORCA | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SL | |
| Desiccator | Bel-Art | F42022 | |
| Hotplate | Wenesco | HP-1212 | |
| Incubator | Forma Scientific | 3110 | |
| Isotemp oven | Barnstead | 3608-5 | |
| Lithography bench | Karl Suss | MA6 Contact Lithography | |
| Optical microscope | Nikon | L200 ND & Diaphod 300 | |
| Shutter for the CCD camera | Sutter Instrument | Lambda 10-2 | |
| Plasma cleaner | PVA TePla/Harrick plasma | M4L/PDC-32G | |
| Spin coater | Brewer Science | Cee 200X | |
| Syringe pump system | Harvard Apparatus | 703005 | |
| Name of Software | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| CAD software | Autodesk | AutoCAD 2015 | |
| CFD simulation software | COMSOL | COMSOL Multiphysics 4.0.0.982 | |
| Images acquire and analyse for NO production | Universal Imaging | Metafluor |
References
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![개발 및 특성화의<em> 체외</em> 미세 혈관 네트워크 및 내피의 정량적 측정 [칼슘<sup> 2 +</sup>]<sub> 전</sub> 및 질소 산화물 생산](https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/54014.jpg)
