Abstract
Endotelceller (ECS) lining blod fartøy vegger in vivo er stadig utsatt for flyt, men dyrkede egenkapitalbevis er ofte dyrket under statiske betingelser og viser en pro-inflammatorisk fenotype. Selv om utviklingen av microfluidic enheter har blitt omfavnet av ingeniører over to tiår, deres biologiske applikasjoner forbli begrenset. En mer fysiologisk relevant in vitro modell microvessel validert ved biologiske anvendelser er viktig å fremme feltet, og bygge bro over gapene mellom in vivo og in vitro studier. Her presenterer vi detaljerte prosedyrer for utvikling av kulturmicrovessel nettverk ved hjelp av en mikrofluid enhet med et langsiktig perfusjon evne. Vi viser også sine applikasjoner for kvantitative målinger av agonist-induserte forandringer i EC [Ca2 +] og nitrogenoksid (NO) produksjon i sanntid ved hjelp av konfokal og konvensjonelle fluorescens mikroskopi. Den dannet microvessel nettArbeidet med kontinuerlig perfusjon viste velutviklede veikryss mellom egenkapitalbevis. VE-cadherin fordelingen var nærmere det som ble observert i intakte microvessels enn statisk kultur EC monolagene. ATP-indusert forbigående økning i EC [Ca 2+] i og NO produksjon ble kvantitativt målt til enkelte cellenivå, som validerte funksjonaliteten til de dyrkede microvessels. Denne mikrofluid enheten kan ECS til å vokse under en godt kontrollert, fysiologisk relevant strømning, noe som gjør det cellekulturmiljøet nærmere in vivo enn det som i de konvensjonelle, statiske 2D-kulturer. Microchannel nettverk design er svært allsidig, og fabrikasjon prosessen er enkel og repeterbare. Enheten kan enkelt integreres til confocal eller konvensjonelt mikroskopisk system som muliggjør høy oppløsning. Viktigst, fordi den kultiverte microvessel nettverket kan være dannet av primære humane ECS denne tilnærmingen vil tjene som et nyttig verktøy for å undersøke hvordanpatologisk endrede blodkomponenter fra pasientprøver påvirke menneskeegenkapitalbevis og gi innsikt i kliniske problemstillinger. Det kan også bli utviklet som en plattform for narkotika screening.
Introduction
Endotelceller (ECS) lining blod fartøy vegger in vivo er stadig utsatt for flyt, men dyrkede egenkapitalbevis er ofte dyrket under statiske betingelser og viser en pro-inflammatorisk fenotype 1,2. Den MicroFluidics teknologien muliggjør en nøyaktig kontrollert væske gjennom en geometrisk begrenset mikro (sub-millimeter) kanaler 3, som gir mulighet for dyrkede celler, spesielt for vaskulær egenkapitalbevis, å vokse under ønskede strømningsforhold. Disse egenskapene gjør celledyrkningsbetingelser i nærmere in vivo enn de konvensjonelle, statiske 2D-cellekulturer. De er ekstremt viktig når microfluidic enheter brukes til å modellere forskjellige typer vasculatures og for å studere EC respons på mekanisk og / eller kjemisk stimulering.
Til tross for fordelene demonstrert av microchannel nettverk over en statisk cellekultur, tilpasning og anvendelse av MicroFluidics i biomedisinsk field forbli begrenset. Rapportert av en fersk gjennomgang, de fleste av publikasjonene til dette feltet (85%) er fortsatt i tekniske tidsskrifter 4. Utførelsen av microfluidic enheter har ikke vært overbevisende nok for de fleste biologer å bytte fra dagens teknikker for eksempel Transwell analysen og makro-skala kultur parabol / glass lysbilde til dette miniatyrisert enheten. MicroFluidics er et tverrfaglig felt som krever tverrfaglig samarbeid for å flytte dette feltet fremover. Formålet med denne tekniske artikkelen er å redusere kunnskapshull mellom disipliner og gjøre fabrikasjon prosedyrer forståelig av biologer, samtidig som det gir biologisk søknad og funksjonell validering av microfluidic microvessels. De visualisert eksperimentelle protokoller inkluderer fabrikasjon av både microfluidic enheter og deres biologiske verktøy, som representerer et tett samarbeid mellom ingeniører og biologer.
Vi har nylig rapportert noenbiologiske applikasjoner ved hjelp av in vitro microvessel nettverk med microfluidic enhet 5. For å utforme passende dimensjonene av microchannel nettverket og bruke den ønskede skjærspenning, ble en numerisk modell bygget med Computational Fluid dynamisk programvare for å tett estimere strømningsprofil. Primære humane umbilikalvene endotelceller (HUVECs) som ble sådd inn i microchannels nådd konfluens, dvs. dekket hele den innvendige overflater av microchannel, i 3-4 dager med kontinuerlig perfusjon. Den riktige barriere dannelse ble demonstrert ved VE cadherin-farging og sammenlignes med de som blir dannet under statiske betingelser cellekultur og i intakte mikrokar. Ved å bruke de eksperimentelle protokoller som er utviklet i individuelt perfuserte intakte microvessels 6-8, vi målt kvantitativt endringene i EC [Ca2 +] og nitrogenoksid (NO) produksjon som respons på adenosin trifosfat (ATP) med fluorescerende idicators og confocal og konvensjonell fluorescens mikroskopi. Agonist-indusert økning i EC [Ca 2+] i og NO produksjon har blitt rapportert som nødvendige intracellulære signaler for inflammatoriske mediator-indusert økning i microvessel permeabilitet 6-15. Selv om noen tidligere studier viste bilder av DAF-2 DA lastet microfluidic enheter 16,17, hadde passende oppløsning og dataanalyse ennå ikke nådd 18. Så vidt vi vet er dette studium viser de første kvantitative målinger av agonist-indusert dynamisk forandring i endotel- [Ca2 +] og NO-produksjon å benytte mikrofluidbasert system.
Microfabrication teknikker har fleksibilitet til å dikte microchannels ned til noen få mikrometer og muliggjøre utvikling av komplekse mønstre å etterligne geometrier av in vivo microvasculature. Her presenterte vi et typisk microchannel nettverk med tre nivåer av forgrening. Dettenettverk er fremstilt av en kombinasjon av fotolitografi, som er utført i et microfabrication renrom og myk litografi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. microfluidic enheten fabrikasjon
- Standard Fotolitografi Fabrikasjon av en SU-8 50 Master Mold
- Rengjør silikonplaten før spin-belegg. Skyll et nakent 2 tommers silikonplaten med aceton i 15 minutter, etterfulgt av isopropylalkohol (IPA) i 15 min. Dehydrere skiven ved å plassere den på en varmeplate ved 150 ° C i 1 time. Etter dehydrering, avkjøle skiven ved romtemperatur.
- Spin-coat silikonplaten med SU-8 fotoresist. Tilsett 2 ml SU-8 fotoresist på skiven. Rampe skiven til 500 rpm ved 100 rpm / sek akselerasjon i 10 sekunder, etterfulgt av 1000 rpm ved 300 rpm / sek akselerasjon i 30 sek. (Se Supplemental Video 1)
- Pre-bake skiven på en varm plate ved 65 ° C i 10 min, deretter myk bake ved 95 ° C i 30 min.
- Bruk UV-eksponering for å transformere utformet mønster fra en film maske til spin-belagt fotoresist. Skriv ut mønsteret på en tynn gjennomsiktig film som en film maske. Plassere filmen masken på toppen avspinn-belagt fotoresist og utsettes for UV med en dose på 300 mJ / cm 2. (Se Supplemental Video 2)
Merk: I denne protokollen, microchannel nettverk mønster (159 mikrometer brede mor kanaler forgreninger inn i fire 100 mikrometer brede datter kanaler) er utformet med CAD-programvare. Mønsteret på filmen viser som en klar felt og resten av filmen dekkes med sort blekk. Fordi SU-8 er en negativ fotoresist, vil den del av fotoresist som er utsatt for UV være tverrbundet og bli uløselig i løsningsmidlet i løpet av utvikling av mold (trinn 1.1.6). Etter utbyggingen vil dette uløselig del gjenskape designet nettverk mønster og tjene som en master mold. - Post-bake den eksponerte platen på en varm plate ved 65 ° C i 1 min, deretter 95 ° C i 10 min.
- Utvikle master mold. Bruk SU-8-utvikler som oppløsningsmiddel for å fjerne den ikke-tverrbundet fotoresist. Senk wafer i SU-8 utvikler for 3 min og skyll med IPAi 1 min.
- Gjenta denne utviklingen syklus 2-3 ganger til det ikke er hvite strek dannelse (rest av ikke-herdet fotoresist) etter IPA skylling. tørke forsiktig av wafer med nitrogengass og undersøke små funksjoner i mønsteret under et mikroskop. Gjenta flere utviklingssykluser om nødvendig.
- Hard bake skiven på en varmeplate ved 150 ° C i 15 min.
- Soft Litografi
- blande manuelt de to delene (base og herder) polydimetylsiloksan (PDMS) elastomer på en vekt. forhold på 10: 1.
- De-gass PDMS blandingen med en eksikator forbundet med et hus vakuum i 15 min. Kast PDMS løsning på fotoresist mester mold. Tykkelsen av PDMS må være mer enn 3 mm for å tilveiebringe en stabil holding av innløpet / utløpet slangen. De-gass til PDMS igjen i 15 minutter, og fjerne de gjenværende luftbobler med nitrogengass ved behov. Kurere de støpte PDMS i en ovn ved 65 ° C i 3 timer.
- Rengjør overflaten avglasset dekkglass med en scotch tape og en plasma renere (30 sek plasma behandling). Spin-frakk un-herdet PDMS (0,5 ml) på dekkglass ved gradvis å 4000 rpm ved 500 rpm / sek akselerasjon hastighet for 30 sek. Kurere PDMS spin-belagte dekkglass i en ovn ved 65 ° C i minst 30 min.
- Klipp og slipp herdet PDMS fra master mold. Deretter oppretter et innløp og et utløp med en 1 mm diameter hullemaskin ved den distale enden av moderkanaler.
- Binde enheten til PDMS spin-belagt dekkglass. Oksidere overflaten av PDMS og dekkglass med en plasmarenser i 1 min. Etter oksygen plasma behandling, plassere en dråpe med avionisert vann (DI vann) på bonding overflaten, og plasser de to delene sammen. Bake til enheten i en ovn ved 65 ° C i 30 minutter for å oppnå en fast binding.
Supplemental Video 1 (Høyreklikk for å laste ned).
Supplemental Video 2 (Høyreklikk for å laste ned).
2. endotelcelle Seeding og kultur
- Enhets Sterilisering og Fibronektin Coating
- Bevare den hydrofobe egenskap av PDMS overflaten rundt innløp / utløp fra oksydasjon. Dekk PDMS overflaten rundt innløp og utløp med små striper av scotch tape for å hindre oksidasjon. Denne fremgangsmåten kan hindre DI vann fra å spre seg over hele toppoverflaten av innretningen under fyllingstrinnet (2.1.3).
- Unn PDMS enhet med oksygen plasma for 5 min for å forandre overflaten til å være hydrofil, og dermed muliggjøre fluidstrømning gjennom microchannel og forhindre boblen overlapping i fylleprosedyren (2.1.3).
- Bruk enten en sprøyte med en nål festet eller en pipette for å fylle anordningen med DI-vann fra innløpet. Fortsette fylling til det er en dråpe med DI-vann (30-50 pl) akkumulert ved utløpet. Undersøk enheten under et mikroskop for å se om det er bobler fanget inne i microchannel. Fjerne overdreven vanndråpen ved innløpet og utløpet med et silkepapir.
- Steriliser enheten i en petriskål med UV i minimum 3 timer i en laminær biosikkerhet hette. For å hindre fordamping, dekker innløpet / utløpet med et tynt stykke PDMS, legg et vått papir vev inne i fatet, og pakk fatet med Parafilm.
- Coat enheten med fibronektin. Skyll den første enheten med fosfat-bufret saltvann (PBS), og deretter belegge det med 100 pg / ml fibronektin over natten i et kjøleskap (4 ° C). Plassere en dråpe av oppløsningen ved innløpet, og deretter å skape et negativt trykk ved utløpet med et hus vakuum, en sprøyte med en nål eller en pipette.
- Fyll enheten med cellekulturmedier. Skyll enheten med PBS manuelt for 3 ganger før du legger i cellekultur media. Varm opp enheten i en inkubator ved 37 ° C.
- Egenkapitalbevis Seeding og Langsiktig Perfusjons
NB: Sammenlignet med konvensjonelle statiske 2D EC kultur in vitro microvessel nettverksmodell med kontinuerlig perfusjon har gjort en cellekulturmiljøet nærmere in vivo-betingelser. In vitro microvessel nettverk demonstrert i denne protokollen kan opprettholdes inntil to uker. Den godt kontrollert perfusjon vil fortløpende etterfylle næringsstoffer, fjerne avfall og forhindre overløpet av EC monolaget. Derfor kan det bli utvidet til en lengre sikt studier, etterligne den cellulære og hemodynamisk miljø under forskjellige physiological og patologiske tilstander.- Bland primær HUVECs i HUVEC dyrkningsmedier (MCDB 131) med 8% dekstran (molekylvekt 70 000). Den dekstran benyttes for å øke viskositeten av laste media og oppnå en bedre celle seeding resultat. Den anbefalte celle tetthet er ca 2-4 x 10 6 celler / ml.
- Seed cellene i enheten. Plasser en 10-20 mL dråpe av celler over innløpet. Innføre en svak strøm enten ved å vippe enheten, eller kapillær handling ved hjelp av et glass Pasteur pipette ved utløpet. Nøkkelen til en vellykket celle lasting er å regulere strømningshastigheten mindre enn 1 mm / sek innenfor de minste kanalene.
- Kontroller mobil seeding. Etter den innledende såing, inkuber anordningen i 15-20 min (fuktet atmosfære av 5% CO2 ved 37 ° C) før sjekker seeding status under mikroskopet. Hvis det er nødvendig, foreta ytterligere celle blir lastet for å oppnå en ønsket celletetthet.
- Skyll forsiktig enheten med cellekulturmedium (37° C) for å fjerne dekstran. Kultur anordningen i fravær av strømningen til den første 6 timer i en inkubator (5% CO2 ved 37 ° C).
- Sett opp slangen tilkobling for langsiktig perfusjon. Tape enheten i en petriskål for å hindre bevegelse. Lag små hull på lokket av petriskålen for innløp og utløp rør innsettinger. Koble innløpsslangen til en sprøyte med en nål for cellekulturmedier perfusjon. Koble utløpsrøret til en avfallsbeholder.
Merk: Plasser enheten og avfallsbeholder i en cellekultur inkubator, mens plassere en perfusjon pumpe utenfor inkubatoren og koble den til enheten ved den lange innløpsslangen. Den perfusjonshastighet er bestemt av den eksperimentelle design. I den foreliggende anordning, bruke en perfusjonshastighet på 0,35 mL / min og en skjærspenning på mellom 1-2 dyn / cm 2. Under denne perfusjon tilstand, HUVECs nå samløpet i ca 3-4 dager.
3. jegmmunofluorescent Farging
- Feste ECS i anordningen ved perfusjon av 2% paraformaldehyd i 30 minutter ved 4 ° C, etterfulgt av 1 x PBS skylling ved romtemperatur i 15 minutter, og 1% BSA blokkering i 30 minutter. Bruke en perfusjonshastighet som er den samme som den som anvendes for cellekultur.
- Permeabilize faste ECS for antistoffarging med 0,1% Triton X-100. Perfuse enheten med Triton for 5-7 min til etiketten VE-cadherin, og 3 min til etiketten F-aktin.
- Last antistoffene i enheten. Perfuse enheten med 1 x PBS i 15 min for å vaske ut de tidligere løsningene. legge ett og det primære antistoff mot VE-cadherin (anti-geit) i enheten ved en konsentrasjon på 2 ug / ml (totalvolumet er 20-50 pl). Hold apparatet i kjøleskap ved 4 ° C over natten. Perfuse det sekundære antistoff (esel anti-geit) ved en sprøytepumpe ved en konsentrasjon på 7 ug / ml for 45-60 min.
- Merk EC F-aktin med phalloidin. Perfuse enheten med 1x PBS for 15 min før manuell lasting phalloidin (10 ug / ml) i 7-10 min.
- Merk EC kjerner (se Materials List).
- Skyll enheten med 1x PBS, og opprettholde den ved 4 ° C til bildebehandling.
4. Fluorescens Imaging av endotel [Ca 2+] i
- Perfuse enheten med albumin (10 mg / ml) -Ringer løsning i 15 min ved 37 ° C. Bruk samme perfusjonshastighet som den som anvendes for cellekultur. Konsentrasjonene av alle komponenter av albumin-Ringers oppløsning er beskrevet i Materialer listen.
- Sett opp confocal system for EC [Ca 2+] i bildebehandling med Fluo-4 AM. Bruk en confocal mikroskopisk system for Ca 2+ bildebehandling. Bruk en argon laser (488 nm) for eksitasjon og sette utslipps bandet som 510-530 nm. Samle bildene med en 25X objektiv (vann nedsenking, NA: 0,95) på 512 x 512 scan format. Bruke et Z-trinn med 2 um og en avsøkningsintervallet for hver stabel av iMages av 20 sek.
- Perfuse enheten med Fluo-4 AM (5 mM) i 40 minutter ved 37 ° C, og deretter vaske ut lumen fluo-4 AM med albumin-Ringers oppløsning.
- Hente bilder av fluo-fire lastet microvessels. Samle baseline bildene i 10 min. Perfuse enheten med ATP (10 mm) og registrere endringer av fluorescens intensitet (FI) i 20 min.
5. Fluorescens Imaging av nitrogenoksid produksjon
- Perfuse enheten med albumin-Ringer-oppløsningen i 15 min. Bruke en perfusjonshastighet som er den samme som den som anvendes for cellekultur.
- Sett opp fluorescens imaging system for å måle ATP-indusert nitrogenoksid produksjon. Bruke et mikroskop utstyrt med et 12-bit digital CCD-kamera og en datastyrt utløser for nitrogenoksid måling. Bruk en 75 W xenon lampe som lyskilde.
Merk: Velg eksitasjon og emisjonsbølgelengden for DAF-2 DA med støyfilter (480/40 nm) og en dichroic speil(505 nm) med et band-pass barriere (535/50 nm). Bruk en 20X objektiv (NA: 0,75) for å samle bildene. For å minimalisere fotobleking, plasserer et nøytralt tetthetsfilter (0,5 N) i front av interferensfilter og begrenser eksponeringstiden til 0,12 sek. - Last cellene med DAF-2 DA (5 mm). Perfuse enheten med DAF-2-DA i ca 35-40 minutter ved 37 ° C. Spill grunnlinjen av DAF-2 fluorescens intensitet (FI DAF) etter den første lasting.
Merk: DAF-2-DA er kontinuerlig tilstede i perfusatet gjennom hele eksperimentet 7. - Samle DAF-2 bilder. Spill grunnlinjen av FI DAF i 5 min. Perfuse enheten med ATP (10 uM) og samles opp bildene i 30 minutter med 1 minutts intervaller. Samle alle bildene fra den samme gruppen av celler på samme fokusplanet.
6. Data Analysis
- velg region av interesse (Rois) fra de innsamlede bilder på enkelte cellenivå manuelt. HverROI dekker arealet av en enkelt celle som kan angis med den fluorescens omriss.
- Trekk bakgrunn fluorescens og beregne gjennomsnittet FI av hver Rois.
- Mål ATP-induserte endringer i EC [Ca 2+] i og NO produksjon. Kvantifisere ATP-induserte endringer i EC [Ca2 +] ved å beregne endringene i Fluo-4 FI (FI / FI 0 * 100, hvor FI 0 er den gjennomsnittlige referanse FI i løpet av albumin-Ringer perfusjon før tilsetning av ATP) minus den målte bakgrunn. Kvantifisere NO produksjonsmengden ved å gjennomføre den første differensial omdannelsen av FI DAF over tid.
Merk: Tidsforløpet for FI DAF representerer en kumulativ NO produksjon med tiden. Derfor er ingen produksjonsraten beregnet basert på profilen til FI DAF under både basal og ATP stimulert forhold. Detaljer om dataanalyse og forsøksprosedyrer er beskrevet i en tidligere publikasjon 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne delen viser noen av resultatene som oppnås med den kultiverte microvessel nettverk utviklet med denne protokollen. Microchannel mønster er en tre nivå forgrening nettverk (figur 1A). I denne design, en 159 mikrometer brede mor kanal grener i to 126 mikrometer brede kanaler, og greiner igjen inn fire 100 mikrometer brede datter kanaler. En 3D-numerisk simulering ble utført for å estimere skjærspenningsfordeling under strømningshastighet på 0,35 mL / min (figur 1 B), noe som tyder på tre forskjellige nivåer av skjærspenning innenfor dette microchannel nettverket. Den laminære strømningen innenfor de microchannels er anslått til å være hydrodynamisk stabil uten tilstedeværelse av forstyrret eller sekundære strøm. Etter en SU-8 mester mold ble fabrikkert med en standard fotolitografi prosess (figur 1C), ble en PDMS enhet fabrikkert gjennom myk litografi å gjenskape microchannel network design i en gjennomsiktig, luft gjennomtrengelig stillas (figur 1D - E). Etter EC poding (figur 1 F - G) og 3-4 dagers kontinuerlig perfusjon, ECS nådde konfluens og hell omfattet de indre overflater av mikrokanaler.
EC F-aktin og kjerner ble fluorescensmerkede innenfor nettverket og illustrert med konfokale bilder. Under skjærspenning på 1,0 dyn / cm2, omtrent 30% av HUVECs forlenget langs strømningsretningen med økte sentrale spenningsfibre, mens resten 70% beholdt sin brostein mønster med dominert perifer F-aktin 5. Skjær-indusert celleform endring synes mindre fremtredende enn at ofte observert i 2D statisk cellekulturer. Faktisk under in vivo betingelser, ECS har forskjellige celleformer i ulike typer fartøy, men ikke lett å endre celleform som respons på strømnings changes. Flere studier er nødvendig for å fastslå om denne forskjellen var resultatet av kanalen geometri og perfusjon miljø som er nærmere til in vivo-betingelser.
Vi har også med hell målt ATP-induserte endringer i EC [Ca 2+] i og NO produksjon (figur 4 og 5). ATP-induserte forbigående økning i EC [Ca 2+] i og ingen produksjon. Gjennomsnittlig maksimal FI fluo-4 var 187 ± 22% av basislinjen, som forekom ved 35 ± 10 sekunder etter starten av ATP perfusjon. NO produksjonshastigheten ble økt fra et basalnivå på 0,15 ± 0,05 AU pr min til 1,18 ± 0,37 AU per minutt i løpet av de første fem minuttene av ATP eksponering. Alle resultatene ble rapportert som gjennomsnitt ± standardfeil (SE). De kan sammenlignes med resultatene stammer fra individuelt perfuserte intakte venules 6,9,14,19.
Figur 1: mikrofluid Device Fabrication og EC belastning (A) Et skjematisk riss av microchannel nettverket.. Bredden og bifurkasjon vinkelen av mikrokanaler er antydet ved hvert forgreningsnivåer. (B) Den numeriske simulering av skjærspenningsfordeling. Strømningshastigheten er 0,35 mL / min. Høyden av microchannel etter fremkalling er 80 um. Disse to tallene har blitt forandret fra forrige publisering med ytterligere detaljer 5. (C) Utvikling av master mold. Hoved mold av microchannel nettverket er fabrikkert med SU-8 fotoresist på silisium wafer. (D) Fremgangsmåten ifølge myklitografi. PDMS Blandingen ble støpt på hoved formen og herdet i en ovn. (E) heft PDMS kanal til substratet. Substratet anvendt for denne enheten er en dekkglass spin belagt med et tynt lag av PDMS. Innløp og utløp er laget med en hole-puncher. (F og G) EC lasting. Omtrent 10 ul av celleløsning er plassert ved innløpet. En svak strøm blir så indusert ved å plassere en Pasteur pipette ved utløpet via kapillærstrøm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Confocal bilder av EF-F-aktin i dyrkede mikrokanalnett (A) En skjematisk visning av nettverket design.. De utvalgte regioner er vist i B - D, er angitt i grafen. (B - D) Confocal bilder av EF-F-aktin (rød) og kjerner (blå) av in vitro microvessel nettverk B-1. C 1 og D 1 er de projiserte bildene fra øverste halvdelen av microchannel bildestakker og B 2, C 2 og D 2 er bilde anslag fra nedre halvdel av bilde stabler. E. tverrsnitt angitt som 1-1 ', 2-2' og 3-3 "i B 1 - D 1, Scale bar = 100 mikrometer. Disse bildene er tilpasset fra forrige publisering fem. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Sammenligning av VE-cadherin fordeling i helstøpt microvessel nettverk med statisk kultivert EC mono og intakt rotte mesenteric venule (.
Figur 4: ATP-indusert økning i EC [Ca 2+ p>] i. Eksperimenter ble utført fra 4 enheter og 7 til 12 ROIs (individuell ECS) per enhet ble valgt for dataanalyse. (A) Tidsforløpet av ATP (10 mm) indusert forandringer i EC [Ca 2+] i (Fluo 4 FI / FI 0 × 100% ± SE) fra en representant eksperiment. (B) Bildene av representant eksperimentet (data er vist i A). Dette er en tidligere utgitt figur 5. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: ATP-indusert NO-produksjon Forsøk ble utført i 3-enheter og 11 til 12 ROIs (individuell ECS) pr anordning ble valgt for dataanalyse.. (En DAF ± SE, venstre Y-aksen) i egenkapitalbevis i henhold til basale forhold og etter eksponering for ATP. NO produksjonshastigheten (df / dt, stiplet linje), ble avledet fra den første differensial omdannelse av den akkumulerte FI DAF (høyre Y-akse). (B) Representative bilder fra ett eksperiment. FI DAF økes ytterligere etter en NO donor, natriumnitroprussid (SNP), ble tilsatt til perfusatet, noe som indikerer en tilstrekkelig mengde av intracellulær DAF-2 reagerer med NO. Dette er en tidligere utgitt figur 5. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikkelen presenterer vi detaljerte protokoller for utvikling av kulturmicrovessel nettverk, karakterisering av EF veikryss og cytoskjelettet F-aktin distribusjon, og de kvantitative målinger av EC [Ca 2+] i og NO produksjon ved hjelp av en microfluidic enhet. Den perfusert mikrofluidenhet gir en in vitro modell som gjør det mulig for en nær simulering av in vivo-mikrovaskulære geometrier og skjærstrømningsforhold. Siden den kultiverte microvessel nettverk kan dannes ved primære humane egenkapitalbevis, kan denne tilnærmingen tjene som et nyttig verktøy for å undersøke hvordan patologisk endrede blodkomponenter fra pasientprøver påvirke menneskeegenkapitalbevis ved direkte perfusjon av pasientblodprøver til de dyrkede microvessels og gi innsikt i klinisk problemer. De humane ECS utviklet microvessels kan også brukes for legemiddelscreening for å unngå mulige avvik i legemiddel respons mellom menneske- og dyrevev.
ve_content "> Substratet av microfluidic anordninger som er vist i denne protokollen er et glassdeksel-slip (150-180 um) spinn-belagt med et tynt lag av PDMS. Dette tynne laget av PDMS er essensiell for høy oppløsning og levende vev sanntid imaging, fordi de større numerisk apertur mål har vanligvis kort arbeidsavstand. den laminære strømningen inne i microchannel (Submillimeter område) har et meget lavt Reynolds tall, og trykkforskjellen er lineært relatert til strømningen, og dermed skjærspenningsfordelingen er utelukkende avhengig på kanalgeometri. Derfor kan det være godt kontrollert av høy nøyaktighet perfusjon pumpen 20. i foreliggende undersøkelse, skjærspenningen påført på HUVEC dyrket microvessel nettverk var mellom 1 til 10 dyn / cm 2, som er innenfor spekter av skjærspenning målt i venesystemet 21,22. makro~~POS=TRUNC-fluidsystemer slik som parallell strømningskammeret mangler kompliserte strømningsmønstre. i større skala strømningskammere (mm-cm gående), ECS er vanligvis bare vokst i bunnflaten (2D monolag), som mangler de geometriske likheter til microvessels in vivo. Når bredden av strømningskammeret er over 2 mm, blir den homogene strømning innesperret i en region som vanligvis er flere millimeter vekk fra utløpet / innløpet, og et par hundre mikron bort fra sideveggen 23. Når bredden av kammeret økes til størrelsesorden centimeter, vil strømningen differensierer til forskjellige strømlinjene og strømningshastigheter vil endre seg over hele området 24. I tillegg forbruker større målestokk strømningskammeret i det minste 100 ganger mer perfusatet for å oppnå den samme skjærspenningen som den i mikrokanaler. Skjærspenningen Fordelingen i microchannel nettverket kan simuleres ved hjelp av en numerisk modelleringsverktøy, og de stasjonære ikke-komprimer Navier-Stokes-ligningene kan bli løst ved de fleste element programvare.Den microfluidic enhet kan gjøres med en single maske microfabrication prosess. Suksessen til kultivert microvessel utvikling krever imidlertid ekstra tid til detaljene. Etter lasting løsningen inn i mikro, må hver enhet for å bli sjekket for boble fangst under mikroskopet før EF seeding. Dersom en boble inntreffer, er det fortsatt mulig å tvinge den ut på dette stadium ved å tilføre et hydraulisk trykk ved innløpet med en lukket utløp, som PDMS er et luft-gjennomtrengelig materiale. For å opprettholde en ønsket perfusjonshastighet, er nødvendig for alle de nål / slangekoblinger tettslutt uten lekkasje. Den matchet hole-puncher og rør størrelse er avgjørende for å oppnå en tettsittende. For å sikre en nøyaktig levering av strømningshastigheten, bør sprøyten på perfusjonen pumpen og anordningen være plassert på samme nivå. For å endre perfusate bør settes slangen være forsiktig kobles fra enheten for å unngå noen strekking. For å øke skjærspenning, trinn øker (for eksempel 10 trinn av økningen i 18 timer) er anbefalingended å unngå plutselige flyt endring forårsaket EC peeling.
Tidligere studier utført på individuelt perfuserte intakte microvessels indikerte at agonist-induserte økning i EC [Ca2 +], og den etterfølgende endotelisk nitrogenoksidsyntase (eNOS) aktivering og NO-produksjon er nødvendige signalisering for øket mikrovaskulær permeabilitet i henhold til inflammatoriske tilstander 6,7 , 9-13,25. I denne protokollen, velger vi ATP som representant agonist, siden det er ofte utgitt av røde blodceller, aggregerte blodplater, og skadet vev eller under betennelsestilstander i vivo. En fluorescens kalsiumindikator, Fluo-4 AM ble anvendt for å måle endringen i endotelial [Ca2 +] etter eksponering for ATP. EF [Ca 2+] Jeg responser i dyrkede microvessels er lik de som finnes i intakte microvessels 7,9. Måling EC NO produksjonen har vært teknisk utfordrende for biologer.Til dags dato har det ikke vært noen fluorescerende indikator som muliggjør påvisning av dynamiske endringer i NO-konsentrasjonen på lignende måte som kalsium indikatorer. DAF-2 DA har blitt mye brukt for å vurdere NO produksjon. Men riktig bruk, tolking, og dataanalyse må trekke brukernes oppmerksomhet. Siden kjemisk omdannelse av DAF-2 til DAF-2T, i nærvær av NO er irreversibel (en vei omdannelse) 26, den detekterte DAF fluorescensintensiteten profilen ikke representerer endringene i NO-konsentrasjon. I stedet viser det akkumulerte DAF-2T produksjon med tiden. Basert på denne kumulert DAF-2-fluorescens (FI DAF) kurve, NO produksjonshastigheten (df / dt) kan avledes ved den første differensial omdannelsen av FI DAF 7,11. Nemlig, helningen av kurven viser FI produksjonshastigheten NO og platåfasen indikerer ingen ytterligere økning av NO-produksjon. Etter konverteringen av data generert fra denne protokollen presented både basal NO produksjonsrate og endringene i NO-produksjon i respons til ATP med tidsmessig og romlig oppløsning på enkelte EU-nivåer i microvessel nettverket.
For tiden PDMS har blitt mye brukt for microfluidic anvendelser, da det er en optisk transparent, ikke-toksisk, og gassgjennomtrengelig myk elastomer 27-30. Men siden PDMS er ikke vann gjennomtrengelig, vi kunne ikke direkte måle permeabilitet EC monolayer. For å overvinne denne begrensningen, noen programmer endret kanalveggkonstruksjoner som integrerer en gjennomtrengelig membran i kanalen 31, eller lage en permeable "vindusåpninger" med mikro søyler eller mikro hull 32,33, mens andre har vært fokusert på modifisering av enhets materialer som ved hjelp av hydrogel enheter eller hydrogel / PDMS hybride enheter 17,34-36. Ulempene med slike enheter er deres sårbare natur til dehydrering og deres relativt svak mechanical egenskaper til å stå stress eller press. Fremtidig utvikling av gjennomtrengelig materiale med mekanisk styrke vil ytterligere forbedre enheten og dens potensial for bredere biologiske anvendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende interesser eller interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Heart, Lung, and Blood Institute gir HL56237, National Institute of Diabetes og Digestive og nyre sykdommer Institute DK97391-03, National Science Foundation (NSF-1227359 og EPS-1003907).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Acetone | Fisher Scientific | A929 | |
| Biopsy punch | Miltex | 33-31 AA | |
| Bovine Albumin | MP Biomedicals | 810014 | |
| Bovine Brain Extract (BBE) | Lonza | CC-4098 | |
| Cover-slip | Fisher Scientific | 12-542C | |
| DAF-2 DA | Calbiochem | 251505 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | 31390 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody | Life technologies | A-11055 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-250 | |
| DRAQ5 (nuclei staining) | Cell Signaling Technology | 4084 | |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | Sigma-Aldrich | E2759-15MG | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | |
| Fibronectin | Gibco | PHE0023 | |
| Fluo-4 AM | Life technologies | F-14201 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| Gentamicin (50 mg/ml) | Gibco | 15750-078 | |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | 12-548B | |
| Glass Pasteur pippette | VWR | 14672 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3393-10KU | |
| HEPES Buffered Saline Solution | Lonza | CC-5024 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | CC-2517 | |
| Isopropyl alcohol (IPA) | VWR | 89125 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030-081 | |
| Mammalian Ringer Solution Ingredient | |||
| NaCl (132 mM) | Fisher Scientific | S671-3 | |
| KCl (4.6 mM) | Fisher Scientific | P217-500 | |
| CaCl2 · 2H2O (2.0 mM) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| MgSO4 ·7H2O (1.2 mM) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Glucose (5.5 mM) | Fisher Scientific | BP350-1 | |
| NaHCO3 (5.0 mM) | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Hepes Salt (9.1 mM) | Research Organics | 6007H | |
| Hepes Acid (10.9 mM) | Research Organics | 6003H | |
| MCDB 131 Culture Medium | Life technologies | 10372-019 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Phalloidin (F-actin staining) | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life technologies | 14040-133 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Corporation | Sylgard 184 | |
| Scalpel | Exel Int | 29552 | |
| Scotch tape | 3M | 34-8711-3070-3 | |
| Silicon wafer | VWR | 14672 | |
| SU-8 photoresist | MicroChem | SU-8 2050 Y111072 | |
| SU-8 developer | MicroChem | Y020100 | |
| tissue culture flasks | Sigma-Aldrich | Z707503-100EA | |
| Triton X-100 | Chemical Book | T6878 | |
| Trypsin Neutralizer solution | Gibco | R-002-100 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Gibco | R-001-100 | |
| Tubing | Cole-Parmer | PTFE microbore tubing, 0.012" ID x 0.030" OD | |
| VE-cadherin | Santa Cruz Biotechnology | SC-6458 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biosafety Laminar hood | NuAire | NU-425 Class II, Type A2 | |
| CCD camera | Hamamatsu | ORCA | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SL | |
| Desiccator | Bel-Art | F42022 | |
| Hotplate | Wenesco | HP-1212 | |
| Incubator | Forma Scientific | 3110 | |
| Isotemp oven | Barnstead | 3608-5 | |
| Lithography bench | Karl Suss | MA6 Contact Lithography | |
| Optical microscope | Nikon | L200 ND & Diaphod 300 | |
| Shutter for the CCD camera | Sutter Instrument | Lambda 10-2 | |
| Plasma cleaner | PVA TePla/Harrick plasma | M4L/PDC-32G | |
| Spin coater | Brewer Science | Cee 200X | |
| Syringe pump system | Harvard Apparatus | 703005 | |
| Name of Software | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| CAD software | Autodesk | AutoCAD 2015 | |
| CFD simulation software | COMSOL | COMSOL Multiphysics 4.0.0.982 | |
| Images acquire and analyse for NO production | Universal Imaging | Metafluor |
References
- Curry, F. R. E., Adamson, R. H. Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge. Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).
- Michel, C. C., Curry, F. E.
- Rogers, J. A., Nuzzo, R. G.
- Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature. 507, 181-189 (2014).
- Li, X., Xu, S., He, P., Liu, Y. In vitro recapitulation of functional microvessels for the study of endothelial shear response, nitric oxide and [Ca2+]I. PLoS One. 10, 0126797 (2015).
- He, P., Pagakis, S. N., Curry, F. E. Measurement of cytoplasmic calcium in single microvessels with increased permeability. Am J Physiol. 258, 1366-1374 (1990).
- Zhou, X., He, P. Improved measurements of intracellular nitric oxide in intact microvessels using 4,5-diaminofluorescein diacetate. Am J Physiol-Heart C. 301, 108-114 (2011).
- Yuan, D., He, P. Vascular remodeling alters adhesion protein and cytoskeleton reactions to inflammatory stimuli resulting in enhanced permeability increases in rat venules. Journal of Applied Physiology. 113, 1110-1120 (2012).
- He, P., Zhang, X., Curry, F. E. Ca2+ entry through conductive pathway modulates receptor-mediated increase in microvessel permeability. Am J Physiol. 271, 2377-2387 (1996).
- Zhou, X., He, P. Endothelial [Ca2+]i and caveolin-1 antagonistically regulate eNOS activity and microvessel permeability in rat venules. Cardiovasc Res. 87, 340-347 (2010).
- Zhu, L., He, P. Platelet-activating factor increases endothelial [Ca2+] i and NO production in individually perfused intact microvessels. Am J Physiol-Heart C. 288, 2869-2877 (2005).
- He, P., Curry, F. E. Depolarization modulates endothelial cell calcium influx and microvessel permeability. Am J Physiol. 261, 1246-1254 (1991).
- He, P., Curry, F. E. Endothelial cell hyperpolarization increases [Ca2+]i and venular microvessel permeability. J Appl Physiol. 76 (1985), 2288-2297 (1994).
- Xu, S., Zhou, X., Yuan, D., Xu, Y., He, P. Caveolin-1 scaffolding domain promotes leukocyte adhesion by reduced basal endothelial nitric oxide-mediated ICAM-1 phosphorylation in rat mesenteric venules. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305, 1484-1493 (2013).
- Zadeh, M. H., Glass, C. A., Magnussen, A., Hancox, J. C., Bates, D. O. VEGF-Mediated Elevated Intracellular Calcium and Angiogenesis in Human Microvascular Endothelial Cells In Vitro are Inhibited by Dominant Negative TRPC6. Microcirculation. 15, 605-614 (2008).
- Tsai, M., et al. In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology. The Journal of clinical investigation. 122, 408-418 (2012).
- Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab Chip. 13, 1489-1500 (2013).
- D'Amico Oblak, T., Root, P., Spence, D. M. Fluorescence monitoring of ATP-stimulated, endothelium-derived nitric oxide production in channels of a poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic device. Analytical chemistry. 78, 3193-3197 (2006).
- Zhou, X. P., Yuan, D., Wang, M. X., He, P. N. H2O2-induced endothelial NO production contributes to vascular cell apoptosis and increased permeability in rat venules. Am J Physiol-Heart C. 304, 82-93 (2013).
- Lee, P. J., Hung, P. J., Rao, V. M., Lee, L. P. Nanoliter scale microbioreactor array for quantitative cell biology. Biotechnol Bioeng. 94, 5-14 (2006).
- Zakrzewicz, A., Secomb, T. W., Pries, A. R. Angioadaptation: Keeping the Vascular System in Shape. Physiology. 17, 197-201 (2002).
- Lipowsky, H. H., Kovalcheck, S., Zweifach, B. W. The distribution of blood rheological parameters in the microvasculature of cat mesentery. Circulation Research. 43, 738-749 (1978).
- Pisano, M., Triacca, V., Barbee, K. A., Swartz, M. A. An in vitro model of the tumor-lymphatic microenvironment with simultaneous transendothelial and luminal flows reveals mechanisms of flow enhanced invasion. Integr Biol (Camb). 7, 525-533 (2015).
- McCann, J. A., Peterson, S. D., Plesniak, M. W., Webster, T. J., Haberstroh, K. M. Non-uniform flow behavior in a parallel plate flow chamber : alters endothelial cell responses. Ann Biomed Eng. 33, 328-336 (2005).
- Curry, F. E. Modulation of venular microvessel permeability by calcium influx into endothelial cells. FASEB J. 6, 2456-2466 (1992).
- Kojima, H., et al. Detection and imaging of nitric oxide with novel fluorescent indicators: diaminofluoresceins. Anal Chem. 70, 2446-2453 (1998).
- Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442, 368-373 (2006).
- Lamberti, G., et al. Bioinspired microfluidic assay for in vitro modeling of leukocyte-endothelium interactions. Anal Chem. 86, 8344-8351 (2014).
- Myers, D. R., et al. Endothelialized microfluidics for studying microvascular interactions in hematologic diseases. J Vis Exp. , (2012).
- Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks. Jove-J Vis Exp. , e51025 (2014).
- Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (iBBB). Lab on a Chip. 12, (vol 12, pg 1784, 2012) 5282-5282 (2012).
- Shao, J. B., et al. Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress. Lab on a Chip. 9, 3118-3125 (2009).
- Yeon, J. H., et al. Reliable permeability assay system in a microfluidic device mimicking cerebral vasculatures. Biomed Microdevices. 14, 1141-1148 (2012).
- Golden, A. P., Tien, J. Fabrication of microfluidic hydrogels using molded gelatin as a sacrificial element. Lab Chip. 7, 720-725 (2007).
- Zheng, Y., et al. In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 9342-9347 (2012).
- Baker, B. M., Trappmann, B., Stapleton, S. C., Toro, E., Chen, C. S. Microfluidics embedded within extracellular matrix to define vascular architectures and pattern diffusive gradients. Lab Chip. 13, 3246-3252 (2013).
![Utvikling og karakterisering av<em> In Vitro</em> Microvessel Nettverk og kvantitative målinger av endotel [Ca<sup> 2+</sup>]<sub> i</sub> Og nitrogenoksid produksjon](https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/54014.jpg)
