Lagdelte alginat konstruktioner: En platform for Co-kultur af Heterogene Cell populationer

Introduction

Trykbelastning bærende væv, såsom ledbrusk eller intervertebrale skiver består af heterogene vævsområder, der er kritiske for både biomekanisk funktion og passende mekanisk-transduktion i vævet. Ikke alene er cellulær organisation og funktion adskiller i forskellige regioner, men de ekstracellulære matricer (ECM) er også varieres i sammensætning og organisation. For eksempel ledbrusk består af tre primære zoner med varierende cellemorfologi, mekanisk funktion, og ECM. Forskelle i deres ECM fører til differential bærende ansvar; det overfladiske lag er primært involveret i trækstyrke reaktion at indlæse, mens de midterste og dybe zoner er primært ansvarlige for reaktion på komprimering ^1. Ligeledes, i det intervertebrale disk, en gel-lignende kerne pulposus omgivet af en lamellar annulus fibrose og cellerne inden for disse to forskellige områder opleve forskellige typer af biofysiske stimuli2. I disse typer af væv, celler og de ​​ekstracellulære matricer i vævet lag interagere med hinanden som vævet undergår og reagerer på mekaniske kræfter.

Sammenfatning af sådanne heterogene vævsstrukturer er fortsat en udfordring i tissue engineering og regenerativ medicin, og vores forståelse af deres biologiske betydning er begrænset. Der er behov for dyrkning platforme til analyse stratificerede væv samt co-kulturer af forskellige populationer af celler i én konstruktion. I ledbrusk tissue engineering, har stillads-mindre lagdelte konstruktioner blevet konstrueret ved at udnytte evnen hos zoneinddeles chondrocytter at deponere varieret ECM at efterligne de forskellige lag af dette væv ^3,4. Imidlertid lagdelte hydrogel konstruktioner giver mulighed for at undersøge interaktionen af ​​forskellige typer af cellepopulationer, der mangler evnen til at danne en robust væv uafhængigt. For eksempel, forskellige popgørelser af mesenkymale stamceller kan co-dyrkes i lagdelte konstruktioner. Sådanne lagdelte stilladser er blevet anvendt med begge chondrocytter og differentierende mesenchymstamceller til forbedret vævsmanipulering ^5. Ikke alene kan forskellige cellepopulationer co-dyrket i lignende hydrogel lag, men en enkelt celletype kan også dyrkes i lag, der er blevet manipuleret til at have varierende stivhed eller biokemisk indhold at fremkalde forskellige reaktioner fra celler ^6,7.

Mange forskellige biomateriale hydrogeler er blevet anvendt til lag cellepopulationer for bruskvæv engineering såsom de, der anvender polyethylenglycol eller polyvinylalkohol baser ^7-9. Men alginathydrogeler er en af ​​de enkleste biomaterialer fra at skabe lagdelte stilladser for at studere heterogene cellepopulationer i co-kultur. Mens agarose hydrogeler også nemt dannes, alginathydrogeler har den ekstra fordel at tillade let erolation af celler fra 3-D konstruktionen til analyse af individuelle celler som det tidligere er ¹⁰ blevet beskrevet. I tidligere undersøgelser har bi-lagdelte alginathydrogeler blevet dannet i tynde plader og fra disse plader blev snit skåret (f.eks. Ved hjælp af en biopsitang) til særlige anvendelser såsom til analyse af biokemisk indhold eller grænsefladespændinger shear egenskaber ^11,12. En anden fremgangsmåde til dannelse af tynde alginat ark er blevet beskrevet med potentiale for lagdeling i flere lag, men stadig ville kræve ændring af hydrogel til anvendelse i mekanisk prøvning ^13.

Her præsenteres en metode til reproducerbar skabe bi-lag alginat hydrogel diske til brug i co-dyrkning forskellige populationer af celler. Dette alginat disk platform besidder adskillige fordele. Primært reproducerbar form og lille størrelse er befordrende for mekanisk stimulering af de indlejrede celler uden at kræve en biopsi puNCH ​​eller anden fysisk ændring af hydrogel til mange anvendelser. Derudover forbliver høj under aflejringsprocessen cellelevedygtighed, og efter geldannelse en klar adskillelse af de to cellepopulationer i gelen er synlig med ingen indledende overlappende område.

Protocol

1. Forberedelse til Dannelse af alginat Discs

1. Der fremstilles en 4% (vægt / volumen) alginat opløsning i 1x Dulbeccos phosphatbufferet saltvand uden tilsat calciumchlorid eller magnesiumchlorid og sted i et 37 ° C vandbad. Koncentrationer af alginatopløsningen kan variere, men 1 - 4% (vægt / volumen) anbefales alginatopløsninger.
2. Bland alginatopløsningen i et forhold på 1: 1 med varm celledyrkningsmedier base (f.eks Dulbeccos modificerede Eagle-medium.) For den ønskede celletype. Alginat koncentration er nu halvdelen af den oprindelige koncentration, dvs.., 2% (vægt / volumen). Sterilisere alginat / media opløsning anvendelse af sterile 0,2 um nylon sprøjtefiltre.
3. Forbered et bad af steril 102 mM calciumchlorid-dihydrat i sterilt vand med tilstrækkelig opløsning til at nedsænke forme (~ 200 - 300 ml).
4. Saml den sterile "geldannelse mug" (6 mm diameter x 3 mm høje cylindriske brønde i en 3 i x 3 i aluminiumsplade, se
5. Skær tykt filtrerpapir (trækpapir filterpapir) og cellen mikrosigten membran (10 um porestørrelse) til størrelserne af de øverste og nederste endeplader og placere dem i calciumchlorid bad indtil mætning, ca. 1 min. Hvis det ønskes, sterilisere den tykke filterpapir og mikrosigten membran via autoklave eller ultraviolet lys i 30 minutter før anvendelse.
6. Set-up halvdelen (nederste halvdel) af formen konstruktionen.
   1. Placer følgende punkter oven hinanden i følgende rækkefølge og mildne anvendelse af en steril spatel: stor endeplade (3 cm x 3 tommer), tykt filtrerpapir, og derefter mikrosigten membran.
   2. Vend og tryk formen på en stak papirservietter til at sikre tab af overskydende calciumchloridopløsning.
   3. Placere "geldannelse støbeform" med de cylindriske brønde oven på cell mikrosigten membran og forsigtigt fastgør formen sammen på to sider ved hjælp af bindemiddel klip i venstre og højre side. Sørg for at efterlade nok plads til den øverste endeplade (1,5 cm x 3 i) for at dække brøndene helt senere.
7. Opsætning anden halvdel (den øverste halvdel) af formen konstruktionen.
   1. Placer følgende punkter oven hinanden i følgende rækkefølge og udglatte: lille endeplade, tykt filtrerpapir, mikrosigten membran.
   2. Vend og tryk denne halvdel af formen på en stak papirservietter til at sikre tab af overskydende calciumchloridopløsning. Fastgør ikke denne halvdel af formen ved hjælp af bindemiddel klip på dette tidspunkt.

Dyrke celler som anbefalet producentens instruktioner. Høst de ønskede celler for at integrere i de lagdelte alginathydrogeler. Den anbefalede celletæthed er 1 - 2 ud x 10 ⁶ celler / ml, men dette kan varieres afhængigt af de ønskede eksperimenter.
Bemærk: Når du bruger denne metodefor at gøre lag med forskellige celletyper, så sørg for at kulturen to celletyper i parallel for lagdeling. Mesenkymale stamceller (MSC'er) udsået ved en celledensitet på 1 x 10 ⁶ celler / ml vil blive anvendt som et eksempel for den følgende protokol. Cell nummer og disc nummer kan skaleres til eksperimenter efter behov.

1. En til to uger før indlejring, frø mesenkymale stamceller ved en celletæthed på 3.000 - 5.000 celler / ^cm2 i 10 ml basal vækstmedier (Dulbeccos Modified Eagle Medium, 10% kalvefosterserum, 2% L-glutamin, 1 % ikke-essentielle aminosyrer, 1% Penicillin / streptomycin) i T-75 kolber.
2. Fjern brugte medier hver 2 - 3 dage, og erstat med 10 ml basal vækstmedium indtil cellerne De 80 - 90% sammenflydende.
3. At høste celler, fjern brugte medier, og pipette 3 ml 1x Dulbeccos phosphatbufferet saltvand uden tilsat calciumchlorid eller magnesiumchlorid til skylning celler. Fjern denne løsning, pipette 3 ml 0,25% Trypsin-EDTA på celler, der vokser i T-75 kolber, og der inkuberes i 5 minutter ved 37 ° C. Efter cellerne er løftet fra det klæbende overflade, tilsættes 6 - 9 ml basal vækstmedium.
4. Centrifugér MSC'er ved 600 xg i 5 minutter ved stuetemperatur, aspireres supernatanten, og resuspender i 1 - 5 ml af basal vækstmedier. Tæl celler ved hjælp af et hæmocytometer hjælp enhedens anvisninger.
5. Fjern 1 x 10 ⁶ celler fra den totale celle resuspension, centrifuge under anvendelse af de samme betingelser, og aspireres supernatanten.

2. Dannelse af Cell Seedede alginat Discs

1. Resuspender cellepelleten med 1 ml af den sterile alginat / media løsning til at opnå en celletæthed på 1 x 10 ⁶ celler / ml. Cellen-alginat blanding vil være homogent uklar, når cellerne blandes i passende.
2. Pipetter 130 pi af celle-alginat blandingen i seks 6 mm diameter x 3 mm høje brønde i den nederste halvdel af støbeformenkonstruere dråbevis, for ikke at skabe nogen bobler. En let konveks menisk skal være synlig over kanten af ​​hver brønd.
3. udglatte omhyggeligt den øverste halvdel af formen konstrukt under anvendelse af en steril spatel og vende den, således at cellen mikrosigten membran er på toppen af ​​brøndene. Placer formen konstruere oven af ​​brøndene, og sørg for at dække brøndene indeholder cellen og alginat blanding helt.
4. Løft indlæst støber konstruktion og, mens der trykkes fast ned på midten, bindemiddel klip de resterende to sider (top og bund) til at fastgøre den øverste og nederste halvdele af støbeformen konstruktionen. De celle-alginat-løsninger bør være sikkert puttet i brøndene på dette tidspunkt.
5. Fordyb den fastgjorte skimmel konstruktionen i 102 mM calciumchlorid bad, og sørg for, at hele konstruktionen er neddykket. Der inkuberes i cellekultur hætte ved stuetemperatur i 90 min.
6. Ved afslutningen af ​​90 min, fjerne formen konstruktionen fra 102 mM calciumchloridbad og sted på en stak af papirhåndklæder i cellekultur hætte. Fjern alle fire bindemiddel klip og adskille de to halvdele af formen konstruktion. Hydrogeler dannet i brøndene bør ikke have nogen bobler og bør fylde brøndene fuldstændigt.
7. Ved hjælp af en spatel, omhyggeligt spore kanten af ​​brøndene indeholder hydrogelerne til omhyggeligt løsne og kile ud hydrogelerne. Efter fjernelse af de hydrogeler fra formen konstruktionen, drop hydrogelerne direkte i et bad med 1x Dulbeccos phosphatbufferet saltvand med calciumchlorid og magnesiumchlorid. Dæk gelerne helt at vaske overskydende calciumchloridopløsning til 1 - 5 min.
8. Overfør hydrogelerne i basal vækstmedie opløsning i ønsket skålen (f.eks., 6 brønds plader), der fuldstændig dækker hydrogelerne. Der inkuberes i mindst 1 time i cellekultur inkubator ved 37 ° C og _5% CO2 før fortsætter til lagdeling trin.
   Bemærk: Hydrogeler indeholder celler kan holdes icellekulturen inkubator på ubestemt tid på dette tidspunkt indtil lagdeling af geler med en anden cellepopulation ønskes, forudsat at mediernes ændringer opfyldes hver 2 - 3 dage.

3. Lagdeling af alginat Discs

1. Under den sidste halve time af 1 times inkubation, indsamle og fremstille sterile forme og løsning til annealing gelerne.
   1. Forbered "cutting formen" ved at fastgøre en støbeform, der har brønde halvdelen af ​​højden af ​​den "geldannelse mold" (6 mm i diameter x 1,5 mm høje brønde i en 3 cm x 3 i aluminiumsplade) til en endeplade (3 ix 3 i aluminiumsplade) ved hjælp af bindemiddel klip på venstre og højre side.
   2. Forbered "annealing formen" ved at fastgøre en støbeform, der er 3 mm større i diameter end de "geldannelse støbeform" (9 mm diameter x 3 mm høje brønde i en 3 i x 3 i aluminiumsplade) til en endeplade (3 ix 3 i aluminiumsplade) ved hjælp af bindemiddel klip på venstre og højre side.
   3. Forbered en opløsning af100 mM natriumcitrat / 30 mM EDTA (natriumcitratdihydrat, ethylendiamintetraeddikesyre tetranatriumsalt dihydrat) i sterilt vand.
2. Fjern geler af ønskede cellepopulationer (i dette eksempel, to skiver med hMSC'er) fra medierne i fadet, og anbringes i de "skære mug" brønde. Hver gel skal passe stramt i brøndene med halvdelen af ​​gelen fremspringende over formen.
3. Ved hjælp af en skalpel, slice gelen langs overfladen af ​​formen (dette vil skære hydrogelen i halve). Flip den øverste halvdel af gelen og placere den i en åben form godt. Den halve af gelen bør også passe stramt ind i formen godt, men nu begge halve geler bør være højden af ​​formen med cut indre overflade synlig. Gentag med anden gel.
   Bemærk: Advarsel: Kun de indre snitflader vil danne lagdelte diske. Brug af de ydre overflader vil resultere i halvdele adskillende. Det formodes, at tekstur fra mikrosigten membranen overført på gelen overflade forhindrers succes hærdningsprocessen.
4. Læg et stykke tørt celle mikrosigten membran oven på brøndene, og sørg for, at mikrosigten membranen er i kontakt med alle de gel halvdele skal udglødet og dækker dem helt. Placer tykt filtrerpapir oven på mikrosigten membran, og sørg for at dække geler helt.
5. Afpipetteres en opløsning af 100 mM natriumcitrat / 30 mM EDTA (Natriumcitratdihydrat, Ethylendiamintetraeddikesyre tetranatriumsalt dihydrat) på tykt filtrerpapir, indtil den er mættet. Ca. 750 pi er tilstrækkelig til fire brønde.
6. Inkuber gelerne i 1 min ved stuetemperatur. Fjern derefter cellen mikrosigten membran og tykt filtrerpapir og kassere dem. Fjern bindemiddel klip og åbne formen.
7. For hver udglødet gel, overføre en natriumcitrat / EDTA-behandlet halvdelen af ​​hydrogelen til den tilberedte "annealing støbeform" med skærefladen opad. Dette vil være en halvdel af det annealede construct.
8. Ved hjælp af en spatel, elevator og placere en anden natriumcitrat / EDTA-behandlede halv-gel (kan indeholde en anden celletype) på gelen allerede i "annealing støbeform", flipping denne anden halv-gel, således at snitfladen er i kontakt med skærefladen af ​​gelen allerede i "annealing formen".
9. Tryk forsigtigt ned på de to geler under anvendelse af en spatel for at fjerne eventuelle bobler mellem de to geler. Også flytte gelerne efter behov for at sikre, at de er direkte oven på hinanden.
10. Løft forsigtigt "annealing formen" og nedsænkes i 102 mM calciumchlorid bad i 30 minutter. Dæk ikke brøndene med en endeplade.
11. Efter 30 min inkubation, fjerne "annealing mug" og placere den på køkkenrulle. Fjern bindemiddel klip og adskille formen fra endepladen.
12. Ved hjælp af en spatel, indsamle de annealede geler og placere dem i en 1x Dulbeccos phosphatbufferet saltvand med calciumchlorid og magnesium chlorid bad for at vaske gelerne. Efterfølgende overføre annealede hydrogeler til cellekulturmediet i en ønsket skålen (f.eks., 6-brønds plade) i kultur.

Representative Results

Figur 1 viser dannelse og lagdeling af de alginathydrogeler. Afsluttet bi-lag geler udviser en fuldstændig indledende separation af cellepopulationer, som vist i figur 2. Cellelevedygtighed af humane mesenchymstamceller) indlejret i disse hydrogeler og lagdelte forbliver højt og sammenligneligt med bulk hydrogeler som vist i figur 3. Levedygtighed blev vurderet efter udglødning, udskæring gelerne lodret for at få adgang til centrum og derefter farvning af levende celler i de annealede geler med en levende celle tracker, CMFDA (grøn) og de døde celler (rød) med ethidium homodimer-1 under anvendelse af producentens anvisninger. Konfokale Z-stakke blev taget af skærefladen under anvendelse af et fluorescensmikroskop ca. 100 um ind i gelen. Disse billeder blev projiceret ind én 2D-billede. Levende og døde celler blev derefter kvantificeret under anvendelse af partikel analysator funktion i ImageJ software.

class = "jove_content" fo: holde-together.within-side = "1"> Vi ønskede at kontrollere, at disse lagdelte hydrogeler, mangler celler, ville være i stand til at modstå cyklisk kompression, ligner den, der er nødvendig for at fremkalde en chondrogen respons. Vi fandt, at hydrogelerne do forbliver intakte efter syv dage i kultur og efterfølgende unconfined cyklisk kompression i 4 timer ved 1 Hz fra 0 - 10% belastning. Men efter isolering peak stress fra hver cyklus og analysere udviklingen over fire timers stimulering, de tendenser viser, at de lagdelte hydrogeler har en anden reaktion på den cykliske kompression sammenlignet med bulk, ikke-lagdelt, hydrogeler. Cyklisk kompression over fire timer resulterede i signifikant forskellige (p = 0,03) peak stress tendenser mellem lagdelte og ikke-lagdelte geler (figur 4). Statistik blev afsluttet ved hjælp af t-test (alfa = 0,05).

jpg "/>
Figur 1:. Skematisk af Layered Hydrogel Formation A. Billede af stablede form til tilsætning af 2% alginat + celleblandingen med en afbildning af stablingsrækkefølgen for bunden og toppen formhalvdele. B. Skematisk skildrer procedure for lagdeling af gelen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2:. Repræsentant Adskillelse af cellepopulationer i Layered Hydrogel Model cellelinje 293FT HEK-celler blev enten farvet med levende celle tracker CMFDA (grøn) eller CMTPX (rød). Hver af disse cellegrupper blev indlejret i 2% (vægt / volumen) alginat diske, og derefter halvdele af disse diske blev lagt sammen. Et stykke blev skåret fra CMTPX side for at identificere det under billedbehandling. Scale bar = 100 & #181; m. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3:. High Cell rentabilitet inden Layered Hydrogel efter Lagdeling er fuldført humane mesenchymstamceller indlejret i bulk- og bi-lagdelte hydrogeler blev farvet med levende celle (grøn) tracker CMFDA og døde celler (rød) blev farvet med ethidium homodimer-1 . Levedygtighed fortsat høj for begge hydrogel grupper efter lagdeling processen. Scale bar = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure. 4: signifikant forskellige tendenser af Layered Hydrogel Cyklisk Compression Reaktion på Cyklisk Compression Hydrogeler blev inkuberet i en cellekultur inkubator i syv dage og efterfølgende udsat for 0 - 10% unconfined cyklisk kompression i fire timer ved 1 Hz. Peak belastninger (± SEM) for hver cyklus blev isoleret og tendenserne over lastning analyserede periode. Tendenser under unconfined cyklisk kompression fra 0 - 10% belastning for lagdelt (n = 9) og bulk (n = 8) geler er signifikant forskellige (p = 0,03). Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Her beskriver vi en protokol for dannelsen af lagdelte alginat hydrogel diske til at studere co-kulturer af multiple cellepopulationer, såsom dem i fysiologisk lagdelt væv, fx brusk. Lagdelte strukturer, såsom den beskrevne kultur platform, kan anvendes til at undersøge samspillet mellem to forskellige cellepopulationer undergivet samme kultur miljøet eller under belastning.

Alginat er en anionisk lineært polysaccharid, der har vist sig at være biokompatible og er med succes blevet anvendt til brusk biologi og vævsmanipulering forskning ^12,14. Alginathydrogeler dannes under anvendelse divalente kationer til tværbinding, f.eks., Calciumioner. Disse tværbindinger kan fortrydes ved at fjerne kationerne ved anvendelse af en chelator, såsom natriumcitrat eller EDTA, og denne proces er tidligere blevet anvendt til at isolere chondrocytter, der er dyrket i gelerne ^3,4,12. Tilsvarende samme principhar også været anvendt med succes til at klæbe alginat ark i dobbeltlag eller endda klynger af alginat perler sammen ^11,12,15. Den her beskrevne platform bygger på denne samme proces, men anvendes til at danne små skiveformede lagdelte hydrogeler. Dette er en to-trins proces, hvor det første, er alginat diske dannes under anvendelse af forme nedsænket i et calcium-rige bad. Disse bliver så skåret i halve og behandlet med en calciumchelaterende løsning på lokalt frigive kalciumioner fra den tværbundne alginat. Ved at placere disse behandlede overflader sammen og re-nedsænkning af diske i et calcium-rige løsning, der krydsbindinger reformeret, hvilket gør bi-lag konstruktioner. Disse små lagdelte geler fjerne behovet for biopsi slag til at generere nemme at kultur prøver kompatible med assays og eksperimenter såsom mekanisk afprøvning, som vist i figur 4, for derved at minimere spild af oftentimes ædle celler såvel som fabrikation materialer.

Som vist iFigur 3 er denne proces med dannelse og lagdeling hydrogelerne resulterede i tilsvarende høj levedygtighed som kontrol eller bulk-hydrogeler hvilket indikerer, at denne procedure ikke overdrevent beskatte til cellepopulationen trods længden og fravær af påfyldning næringsstoffer. Manglen på en indledende overlappende område i gelen tillader fysisk adskillelse under indledende co-kultur og evnen til at iagttage ændringer af denne grænseflade over tid. Undersøgelser har vist, at denne grænseflade over lange kultur perioder kan miste definition grund cellulær cross-infiltration og deponering af ekstracellulær matrix ^11. Mens den oprindelige lagdelte disken ikke indeholder nogen adhæsionsmolekyler, som ekstracellulære matrix er deponeret, er der også et potentiale for at undersøge sammenlægning af cellepopulationer og de skiftende grænsefladen mellem lagene.

Disse bi-lag diske kan bruges nemt til dynamisk kompression stimulation. Vi var i stand til at bekræfte, at THESe hydrogeler modstå dynamiske komprimering uden adskillelse af halvdele. Men i løbet af denne proces blev spidsbelastning udvises af de lagdelte hydrogeler under den fire timer cyklisk kompression fundet at være signifikant forskellig fra det ikke-lagdelt, bulk, hydrogeler. Dette resultat antyder kompleks, ikke-lineær stamme overførsel mellem lagene og afslører et behov for en fysisk lagdelt kontrol gel, f.eks., Bi-lag hydrogel med den samme cellepopulation / tilstand i hvert lag, en vigtig detalje at bemærke, når man planlægger den eksperimentelle design for undersøgelser med mekanisk belastning. Bedre forståelse af de observerede forskelle kan opnås gennem datamodellering af rumlige mekanik inden for disse geler. Ikke alene vil sådanne analyser at tydeliggøre stammen fordeling og overførsel mellem lagene, men det ville også være medvirkende til fortolkning cellulær adfærd i disse lagdelte geler, især med lag af varierende mekaniske egenskaber.

Denne kultur platform was udviklet til forskning applikationer til at undersøge forholdet mellem forskellige cellepopulationer i 3D kultur. Det er således begrænset af sin manglende skalerbarhed for kliniske anvendelser. Alternative metoder til oprettelse af lagdelte hydrogeler, såsom 3D-print, kan i sidste ende være mere klinisk relevant på grund af forventede fremtidige skalerbarhed fremskridt, kontrol over mikrostruktur i skiven interiør, og customizability af makroskala geometriske funktioner. For forskningsansøgninger, som præsenteres her, alginat diske ikke selvstændigt give vedhæftning dele for celler, som kan begrænse dens anvendelse til andre celletyper. Den sammenlignelige alternativ til alginat, når de overvejer brugervenlighed er agarose, der lider lignende begrænsninger. Endvidere er det kræver brug af enzymer til at frigive celler til nedstrøms analyse, mens alginat krydsbindinger kan fjernes ved hjælp af calcium chelatdannere. Primært vil denne kultur platform hjælpe med at forbedre understanding af relationer mellem cellepopulationer i hydrogeler og potentielt virkningerne af mekanisk stimulering af disse co-kulturer. Denne forståelse vil derefter informere udvikling af terapier for heterogene væv, især lastning bærer væv såsom ledbrusken eller intervertebrale skiver.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alginic Acid sodium salt	Sigma Aldrich	A1112	Solution made in wt% using DPBS (-/-)
1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-/-)	Gibco Life Technologies	14190
1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (+/+)	Gibco Life Technologies	14190
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco Life Technologies	11965	Example. Use desired medium type
Syringe Filters (0.02 μm Nylon)	FisherBrand	0979C
Calcium Chloride Dihydrate	Fisher Bioreagents	BP510	Prepare solution in sterile water
Criterion Blotter Filter Paper	Biorad	1704085	Cut to size of endplates for mold formation
Cell Microsieve Membrane (10 μm pore size)	Biodesign Inc of New York	N10R	Cut to size of endplates for mold formation
Sodium citrate dihydrate	FisherScience	S93364
Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate (EDTA)	FisherBioreagent	BP121
Fetal Bovine Serum	Gibco Life Technologies	26140	Used in example mesenchymal stem cell basal growth media
Penicilin/Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco Life Technologies	15140	Used in example mesenchymal stem cell basal growth media
L-Glutamine (200 mM)	Gibco Life Technologies	25030081	Used in example mesenchymal stem cell basal growth media
Non-essential Amino Acids (100x)	Gibco Life Technologies	11140050	Used in example mesenchymal stem cell basal growth media