Summary
Denne protokollen beskriver en metode for å isolere og dyrke metanephriske rudiments fra musembryoer.
Abstract
Målet med denne protokollen er å beskrive en metode for disseksjon, isolasjon og kultur av metanephriske rudimenter fra mus.
Under nyreutvikling av pattedyr, kommuniserer de to progenitorvevene, ureterisk knopp og metanephriske mesenkym, og fremkaller gjensidig cellulære mekanismer til slutt å danne samlingssystemet og nephronene i nyrene. Ettersom pattedyrsembryoer vokser intrauterin og derfor er utilgjengelige for observatøren, har en orgelkultur blitt utviklet. Med denne metoden er det mulig å studere epithelial-mesenkymale interaksjoner og cellulær oppførsel under nyreorganogenese. Videre kan opprinnelsen av medfødte nyrene og urogenitale malformasjoner undersøkes. Etter forsiktig disseksjon overføres de metanephriske rudimentene til et filter som flyter på dyrkningsmedium og kan holdes i en cellekultur-inkubator i flere dager. Men man må være klar over at forholdene erKunstig og kunne påvirke stoffskiftet i vevet. Inntrengningen av teststoffer kan også begrenses på grunn av den ekstracellulære matriksen og basalmembranen som er tilstede i eksplantatet.
En hovedfordel ved organkulturen er at eksperimentøren kan få direkte tilgang til orgelet. Denne teknologien er billig, enkel og tillater et stort antall modifikasjoner, for eksempel tilsetning av biologisk aktive stoffer, studier av genetiske varianter og anvendelse av avanserte bildebehandlingsteknikker.
Protocol
Mus ble opprettholdt i henhold til svenske forskrifter og EUs lovgivning (2010/63 / EU). Alle prosedyrer ble utført etter retningslinjene fra svensk etikkomité (tillatelse C79 / 9, C248 / 11 og C135 / 14). Prosedyrene ved Heidelberg Universitet med dyreprofiler har blitt godkjent av Regierungspräsidium Karlsruhe og dyrevelferdene ved Universitetet i Heidelberg.
1. Fremstilling av reagenser og materialer for kultur
MERK: Bruk en laminær hette for å minimere forurensning.
- På disseksjonsdagen ble pre-klyngen human Fc alene eller rekombinant kimært ephrinprotein fusjonert til humant Fc ved å blande det med anti-humane Fc geitantistoffer ved et molforhold på 1: 5 i steril fosfatbuffert saltløsning (PBS). Inkuber i 1 time ved 37 ° C 5 .
- Forbered kulturmediet ved å supplere Dulbeccos Modified Eagle Medium: NæringsstoffBlanding F-12 (DMEM / F12) med 1% penicillin / streptomycin (volum / volum), 1% glutamin (volum / volum), 1% insulin-transferrin selenium (volum / volum), 50 ug / ml human holo- Transferrin og 1,5 μg / ml amfotericin.
MERK: 10 ml medium er tilstrekkelig for 16 embryoer. - Legg til klynget rekombinant ephrinløsning ved en sluttkonsentrasjon på 20 μg / ml til dyrkningsmediet. Bruk klynget human Fc som kontroll.
- Forbered kulturplater ved å tilsette 500 μl dyrkningsmedium til hver brønn i en steril, ikke-belagt, platebundet polystyren 4-brønnplate.
- Ved bruk av sterile pincett, plasser forsiktig ett polykarbonatmembranfilter med en porestørrelse på 5 μm per brønn på toppen av mediet. Overfør den tilberedte platen til inkubatoren (37 ° C / 5% CO2). Sørg for at filteret forblir tørt på den øvre overflaten og flyter.
MERK: Ett filter er tilstrekkelig for to nyreanfall. - Ved hjelp av et knivblad, kutt ca 30 pipettespisser (volum: 100 μL) omtrentligY 1 mm fra spissen for å resultere i en bredere åpning. Sett tipsene tilbake i et pipettespissstativ.
2. Disseksjon av Metanephric Rudiments på E11.5
- Offer en tidsbestemt gravid mus ved E11.5 ved cervikal dislokasjon (eller bruk en metode godkjent av det lokale etikk komiteen).
- Fjern livmor og embryoer, som beskrevet av Brown et al. 6 . Fra dette punktet fremover, arbeid under et disseksjonsmikroskop.
- Ved å bruke nr. 5 urmakerfinger, kutte embryoen direkte under forbenene. Bruk en fersk petriskål for hvert embryo. Fjern bena og halen på embryoet. For å gjøre dette, ta tak i vevet som skal fjernes med ett par nr. 5 urmakerpinne og bruk tipsene til et andre par til å kutte.
- For å fjerne den ventrale organmassen, bruk spissene til et par tapper for å åpne embryonets kroppsvegg i sidelinjen i en radial-til-caudal retning.
- Klipp overfladisk, parallelt med tHan dorsal aorta. Bruk den blodfylte og dermed synlige dorsale aorta for orientering. Forsiktig adskilt den ventrale delen av kroppsveggen fra dorsaldelen ved hjelp av spissene av lukkede tanger og flip embryoen over. Klipp kroppsveggen lateralt i en rostral-til-caudal retning og bruk dorsal aorta for orientering, som for forrige side.
- Når den ventrale kroppsveggen har blitt skilt fra dorsallegemet, ta den med et par tapper og trekk forsiktig for å fjerne det, sammen med organmassen.
MERK: Metanephric anlagen forblir vanligvis festet til dorsal kroppsvegg. De er ovale, ~ 200 μm lange strukturer plassert på bakbenet. - Hold dorsal kroppsvegg med et par tapper, med ventralsiden vendt oppover. Ved hjelp av det andre paret tanger, ta tak i dorsal aorta ved sin røde ende og skyll forsiktig dorsal aorta fra dorsal kroppsvegg.
MERK: Både metanephriske nyrer holder vanligvis vedleggReddet til dorsal aorta. - Bruk et par tapper, kutt rostrally til nyrene anlagen for å fjerne aorta. Deretter må du forsiktig skille de to nyrene anlagen ved hjelp av tipsene til tangen.
- Fjern forsiktig av uønsket vev fra nyreanstrengene ved hjelp av tipsene til tangen. Vær forsiktig så du ikke ødelegger mesenchymet, da skade kan føre til dårlig vekst og ekskludering av eksplantatet fra videre analyse.
- Overfør nyrene anlagen separat ved hjelp av en mikroliter pipette og en bred åpen pipettespiss i 10 μl PBS til polykarbonatmembranfilteret i en 4-brønnplate.
MERK: På grunn av overflatespenning, vil eksplanteringen bli dekket med et tynt lag med medium. Et filter er tilstrekkelig for to nyreanfall.- Plasser hver av de to nyreanstrengene i midten av hver respektive halvdel av filteret. Overfør platen tilbake til inkubatoren ved 37 ° C / 5% CO 2 . Legg tallerkenen i inkubatoren til metanephric rudIments fra neste embryo er klare til å bli plassert på filteret.
- Gjenta trinn 2.3-2.9.1 for hvert embryo.
MERK: Med en viss praksis vil disseksjonsprosedyren ta ca 5 minutter per embryo. - Inkuber nyrene anlagene i 3 dager ved 37 ° C / 5% CO2.
3. Fremstilling av reagenser for fiksering og farging
- For å fremstille 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS uten kalsium og magnesium (vekt / volum), oppløs PFA ved 60 ° C i PBS kontinuerlig omrøring. Avkjøl til romtemperatur og bruk et papirfilter for å fjerne resterende partikler. Aliquot og hold ved 4 ° C for umiddelbar bruk eller frys for langvarig lagring.
FORSIKTIG: PFA er giftig. Bruk personlig verneutstyr som er angitt i de lokale sikkerhetsstandardene, og arbeid i en avtrekksdeksel. Kast bort avfall som følger institusjonelle retningslinjer og bruk av angitte avfallsholdere. - For å forberede permeabiliseringsoppløsning, fortynn Triton X-100I PBS uten kalsium og magnesium til 0,3% (volum / volum).
- For å forberede blokkering, legg til 5% (v / v) geit serum og 0,1% Triton X-100 til PBS uten kalsium og magnesium. Tilsett natriumazid til en sluttkonsentrasjon på 0,02% (vekt / volum). Oppbevares ved 4 ° C.
FORSIKTIG: Natriumazid er giftig. Håndter natriumazid i henhold til lokale forskrifter for sikkerhet og miljø.
MERK: Ved bruk av antistoffer for farging, bruk 5% serum fra arten, det sekundære antistoffet ble avledet fra å lage blokkeringsoppløsning. - Fortynn biotinylert Dolichorus biflorus agglutinin 1: 200 i blokkeringsløsning. Fortynn Alexa488-konjugert streptavidin 1: 200 i blokkeringsløsning.
- For å lage ferdigblandet medium for bruk (se tabell over materialer), tilsett 0,1 g vannoppløselig polyvinylalkoholbasert mucoadhesive / mL til 25% (w / v) glyserol i 0,1 M Tris-HCl (pH 8,5) . Varm til 50 ° C under kontinuerlig omrøring i 1 time, avkjøl, og juster pH til 8,0-8,5 ved å bruke 1M NaOH. Unngå høyere NaOH-konsentrasjoner. Tilsett 100 μg / ml N-propylgallat og timerosal til en sluttkonsentrasjon på 0,02% (vekt / volum). Rør i 30 minutter ved romtemperatur.
FORSIKTIG: Thimerosal er giftig. Håndter det i henhold til lokale sikkerhets- og miljøvernforskrifter.- Fyll innbøyningsmediet i 50 ml rør, balanser rotoren og sentrifuger ved 3 200 xg og romtemperatur i 10 minutter. Dekanter den klare løsningen i 15 ml rør og kast pelleten. Aliquot og lagre ved -20 ° C i flere uker. Når opptining er opptatt, hold oppløsningen ved 4 ° C. Varm til ~ 30 ° C umiddelbart før bruk.
- Forbered så mange glassglass som filtre med eksplanteringsmidler skal monteres. For dette lim to små deksler, 18 x 18 mm, på hver side av glassglasset ved hjelp av øyeblikkelig lim. Legg igjen en ~ 15 mm mellomrom for filteret.
4. Fiksering og farging
- Etter en dyrkingstid på 3Dager in vitro (div), fjern platene fra inkubatoren og aspirer forsiktig kulturmediet fra hver brønn ved hjelp av en mikropipett. Pass på at du ikke berører filteret og holder spissåpningen mot brønnens vegg.
- Tilsett 500 μl 4% PFA / PBS til hver brønn. Filtrene vil flyte på fikseringsmiddelet. Ved hjelp av en mikropipett, legg forsiktig PFA-fiksativet dråpevis for å senke filtrene. Inkuber ved romtemperatur i 30 minutter.
MERK: For alle følgende trinn må det utvises ikke å vaske ut eksplanteringene fra filteret. Hold åpningen på pipettespissen mot brønnens vegg. - Fjern PFA og skyll to ganger med 500 μL PBS, nedsenking av filteret. Tilsett 500 μl permeabiliseringsløsning til hver brønn og inkuber ved romtemperatur i 1 time.
- Skyll to ganger med 500 μl PBS og tilsett 500 μL blokkeringsløsning til hver brønn. Inkuber ved romtemperatur i 1 time.
- Erstatt blokkeringsløsningen med250 μl biotinylert Dolichorus biflorus agglutinin fortynnet 1: 200 i blokkeringsoppløsning og inkuberes ved 4 ° C i 24 timer.
- Fjern Dolichorus biflorus agglutinin løsning og skyll to ganger med 500 μL PBS per brønn.
- Tilsett 250 μL Alexa488-konjugert streptavidin fortynnet 1: 200 i blokkeringsløsning og inkuber ved 4 ° C i 24 timer. Alternativt inkuberes ved romtemperatur i 2 timer.
MERK: Et bedre signal-støyforhold oppnås når det inkuberes ved 4 ° C. - Skyll to ganger med 500 μl PBS per brønn. Ved hjelp av tapper, overfør filtene til de forberedte glassglassene, med eksplanteringsmiddelene vendt oppover. Monter med ~ 50-100 μL embedding medium. Deksel med 60 mm lang nr. 1,5 deksel. La embedding medium løsningen størkne i 2 timer ved romtemperatur i mørket. Fortsett til avbildning eller lagre lysbildene, pakket inn i folie, ved 4 ° C til klar til bilde.
- Bilde med et bredt felt epifluorescensmikroskop 7 </ Sup> koblet til en Hg-lampe og bruk en speil-enhet for blå excitasjon (eksitasjonsbåndpass, 460-495 nm, dikromatisk speil, 505 nm, og utslipp bandpass, 510-550 nm) og 20X Plan-Apochromat-objektiver, 0,75 numeriske åpning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metanephric nyre anlagen ble avledet fra gravide Black-6 innavlede mus på E11.5 og ble dyrket. Etter 3 dager hadde ureterbommen forgrenet opptil 5 ganger, noe som resulterte i en forgrening av den opprinnelig T-formede ureterisk knopp. Hver eksplanter ble fotografert, og antall segmenter og endepunkter ble kvantifisert for å bestemme forgreningsgenerasjonene og å beregne antall endepunkter per gren ( figur 1 ). ImageJ ( rd generasjon, den fjerde generasjonen ble nådd i bare 8% av de behandlede eksplantatene, sammenlignet med 35% av kontrolleksplanterne ( figur 1b ). Følgelig ble antall endepunkter per gren og endepunkter per mm 2 redusert i Eksplantater behandlet med klynget EphrinB2. I tillegg hadde en tredjedel av eksplantatene uvanlig morfologi i ureterisk budtips ( Figur 1 ). Disse resultatene antyder at EphrinB2 kan ha en begrensende effektPå ureterisk grenforgreningsprosessen, mest sannsynlig ved å aktivere EphA4 og EphB2-fremover signalering.
For et vellykket forsøk er det kritisk at metanephric mesenchym ikke blir skadet under disseksjon. Eventuell skade av mesenkymet reduserer det induktive potensialet, fører til redusert eller fraværende ureterisk knokforgrening, og kan være en kilde til forspenning. Eksemplet i figur 2A viser en eksplanterende hvor mesenchymet nesten mangler. Den ureteriske knotten brøt ikke utover T-trinnet. Figur 2B viser et eksempel hvor skaden av metanephric mesenchym førte til dårlig vekst og forgrening. Begge eksplanteringene må utelukkes fra analyse.
Figur 1: E11.5 Metanephric Kidney Anlagen dyrket for 3 div og behandlet med Clustered Rekombinant EphrinB2 eller ClustUtgjorde Human Fc som kontroll. ( A ) Metanephric nyre anlagene ble dissekert ved E11.5, dyrket for 3 div, og farget med biotinylert Dolichorus biflorus agglutinin og Alexa488-konjugert streptavidin. Eksplanteringene ble avbildet med et widefield-epifluorescensmikroskop med en eksitasjonsbåndpass på 460-495 nm, et dikromatisk speil på 505 nm, en emisjonsbåndpass på 510-550 nm og 20X Plan-Apochromat-linser. Anvendelsen av klynget rekombinant EphrinB2 (clEphrinB2) resulterte i redusert forgreningskompleksitet og misdannelse av ureterisk budtips (pilespiss). ( B ) Det venstre diagrammet viser forgreningsgenerasjoner i clEphrinB2-behandlede og kontrolleksplanter. Den fjerde generasjonen av forgrening ble nådd i bare 8% av de behandlede eksplantert stoff, sammenlignet med 35% av kontrolleksplanter. Antall sluttpunkter per gren (midtre graf) og sluttpunkter per område (høyre graf) ble redusert (sluttpunkter per gren CNT, 2,1 ± 0,09; clEphrinB2, 1,7± 0,08, P = 0,007 **; Endpoints per kvadrat millimeter: CNT, 31 ± 0,01; ClEphrinB2, 27 ± 0,02; P = 0,04 *; N = 23). Dataene presenteres som gjennomsnittlig ± SEM, og en unpaired Students t-test ble brukt. Skalbjelke = 100 μm. Denne figuren er blitt modifisert fra Peuckert et al. , 2016 3 . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Eksempler på To E11.5 Metanephric Kidney Anlagen som ble skadet under Disseksjonen, dyrket for 3 div, og ble farget med biotinylert Dolichorus Biflorus Agglutinin og Alexa488-konjugert Streptavidin. ( A og B ) Skaden av mesenkymet resulterte i dårlig eller fraværende vekst og ureterisk knokforgrening,Diskvalifisere eksplantatene fra videre analyse. ( A ) Metanephric nyre eksplanter etter 3 div, med fraværende ureterisk bud forgrening. Bare den første T-trinns grenen er synlig. ( B ) Metanephric nyre eksplanter etter 3 div, med dårlig ureterisk bud forgrening. Skalbjelke = 60 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette manuskriptet beskriver en metode for å isolere de utviklende metanephriske anlagen fra musembryoet og å dyrke organets rudiment. Denne metoden er en standardteknikk, som utviklet av Grobstein 8 og Saxén 9 , 10 , og ble tilpasset og modifisert av mange andre 11 , 12 . Suksessen til metoden avhenger hovedsakelig av varigheten av disseksjonen, da eksplanterende overlevelse og induktivt potensial reduseres med langvarig disseksjonstid. Det må også utvises forsiktighet for ikke å skade mesenkymen ved rengjøring av nyre rudimentet fra det omkringliggende vevet. Skader på metanephric mesenchym er ofte årsaken til eksplosjonenes dårlige vekst. Disseksjonshastighet og fine motoriske ferdigheter forbedres imidlertid sterkt med praksis.
Det kjemisk definerte mediet i den presenterte protokollen brukes ofte til å erstatteSerumholdig medium i primærcelle og in vitro organkultur og inneholder en blanding 1: 1 (v / v) av DMEM og Ham's F-12, supplert med insulin-transferrin-selen for å understøtte eksplantatets vekst og overlevelse. Glukose- og aminosyreopptak, lipogenese og intracellulær transport forenkles av insulin. Selen, en kofaktor for glutationperoxidase, fungerer som antioxidant. Transferrin er en jernbærer og bidrar til å beskytte mot oksygenradikaler. I embryonisk nyrekultur øker tilsetningen av transferrin til mediet tubulerdifferensiering og tymidininkorporering på en doseavhengig måte, med en maksimal effekt på rundt 50 μg / mL 13 . Derfor er human-holo-transferrin ytterligere tilsatt i mediet, hvilket resulterer i en endelig transferrinkonsentrasjon på ca. 55 ug / ml. Mange protokoller, som bruker en enklere, men kjemisk mindre definert sammensetning, med Eagle's Minimal Essential Medium(MEM) eller DMEM og 10% serum ( dvs. føtalt bovint serum, FBS) gir også meget tilfredsstillende resultater 12 , 13 , 14 , 15 . Det kan imidlertid forekomme variasjoner mellom forskjellige mange FBS. For å unngå slike variasjoner og å utelukke mulig interferens av vekstfaktorer tilstede i serumet med Eph-signalering ble serumfritt medium valgt. Avgjørelsen om bruk av serumfritt medium avhenger av eksperimentelle oppsett og vitenskapelig spørsmål. Serumfrie kulturbetingelser vil være spesielt nødvendige når det endelige målet er terapeutisk anvendelse. Amphotericin B, det anti-soppmiddel som inngår i denne protokollen, kan utelates. Kultiveringsperioden i det viste eksempel var 3 dager, men metanephriske nyre-rudiment kan dyrkes i opptil 10 dager 15 . I kulturer som overskrider 3 dager, bør mediet skiftes hver 48 time. Utviklingen av kidnØye rudiments in vitro rekapitulerer in vivo sekvensen av pre-tubular aggregater, nervevesikler, og komma- og S-formede legemer. Etter 3 dager in vitro har glomerulignende strukturer dannet 15 , 16 . I lengre kulturer øker eksplanteringsområdet ytterligere på grunn av fortsatt forgrening av ureterisk knopp. Etter ca 5 dager med kultur har nefronene segregert i distale, midtre og proksimale segmenter 16 .
Til tross for den relative lettheten og kostnadseffektiviteten til teknikken, som gir mulighet for allsidige bruksområder, bør enkelte hensyn tas i betraktning når du planlegger eksperimenter og tolker resultater. På grunn av den ekstracellulære matriksen og basalmembranen som er tilstede i de dyrkede organer, er diffusjonen av eksogene stoffer og partikler begrenset 17 . Videre kan de kunstige kulturbetingelsene og manipulasjonene forårsake forandringer i metabolismenIsm av vevet, og celleadferd som adskiller seg fra in vivo- situasjonen 15 , 18 . Mest merkbart mangler eksplantatene blodtilførsel, og glomeruli er avaskulære; Selv om nefronene blir segmenterte, er sonering og dannelsen av en medulla og løkker av Henle savnet 14 , 19 . Dermed er applikasjonsspekteret av embryonisk nyrekultur begrenset til de rørformede strukturer, deres forgreningsmorfologi og mesenkymale-epiteliale interaksjoner. Derfor kan ikke vitenskapelige spørsmål rettet mot nyrefunksjonen behandles.
Nylige modifikasjoner av kultimetoden hvor nyrerørreringer blir dyrket på belagt glass i lav volumaktivert organotypisk utvikling, til og med opp til cortico-medulær zonering med forlengede løkker av Henle 15 . Det er også verdt å merke seg at, nylig, en metode for å lagre og bevare levebrødEmbryonale nyrer ble publisert. Denne metoden muliggjør transport av embryonale nyre-rudiment ved E11.5 i flere dager, og tillater at de dyrkes senere. Dette er spesielt av interesse for samarbeid 20 . Naturen til helt nyre rudimentkulturen tillater en rekke metodiske tilpasninger, inkludert avanserte bildebehandlingsteknikker. For å unngå å forstyrre bevegelser under levende bildebehandling, anbefales det å bytte ut flytende med et fast filter, for eksempel et transwellinntak. Den presenterte teknologien har til og med blitt utvidet til kulturvevblokker som inneholder hele urogenitale kanalen. Ved bruk av denne utvidede kulturen kan ureterinnsetting i blæren undersøkes 21 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Leif Oxburgh og Derek Adams for generøst å dele sin kunnskap, Leif Oxburgh for de nyttige kommentarene til manuskriptet, og Stefan Wölfl og Ulrike Müller for deres tekniske støtte og Saskia Schmitteckert, Julia Gobbert, Sascha Weyer og Viola Mayer for hjelp i lab. Dette arbeidet ble støttet av Development, The Company of Biologists (til CP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 21331020 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140148 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14040117 | use for dissection |
| holo-Transferrin human | Sigma-Aldrich | T0665 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100x) | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Amphotericin B solution | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Thimerosal | Sigma-Aldrich | T5125 | |
| Propyl gallate | Sigma-Aldrich | 2370 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Biotinylated Dolichorus Biflorus Agglutinin | Vector Laboratories | B-1035 | |
| Alexa488 conjugated Streptavidin | Jackson Immuno Research | 016-540-084 | |
| Recombinant Mouse Ephrin-B2 Fc Chimera Protein, CF | R&D Systems | 496-EB | |
| Recombinant Human IgG1 Fc, CF | R&D Systems | 110-HG-100 | |
| Goat Anti-Human IgG Fc Antibody | R&D Systems | G-102-C | |
| Phosphate buffered saline tablets | Sigma-Aldrich | P4417 | use for fixation and immunostaining |
| Dumont #5, biologie tips, INOX, 11 cm |
agnthos.se | 0208-5-PS | 2 pairs of forceps are needed |
| Iris scissors, straight, 12 cm | agnthos.se | 03-320-120 | |
| Dressing Forceps, straight, delicate, 13 cm |
agnthos.se | 08-032-130 | |
| Petri dishes Nunclo Delta treated | Thermo Fisher Scientific | 150679 | |
| TMTP01300 Isopore Membrane Filter, polycarbonate, Hydrophilic, 5.0 µm, 13 mm, white, plain | MerckMillipore | TMTP01300 | |
| Nunclon Multidishes 4 wells, flat bottom |
Sigma-Aldrich | D6789-1CS | |
| Microscope cover glass 24 x 50 mm thickn. No.1.5H 0.17+/-0.005 mm | nordicbiolabs | 107222 | |
| Cover glasses No.1.5, 18 mm x 18 mm | nordicbiolabs | 102032 | |
| Slides ~76 x 26 x 1, 1/2-w. ground plain | nordicbiolabs | 1030418 | |
| VWR Razor Blades | VWR | 55411-055 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430828 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430055 | |
| Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 113V, creped | Sigma-Aldrich | WHA1213125 | |
| Fixed stage research mircoscope | Olympus | BX61WI | |
| Black 6 inbred mice, male, C57BL/6NTac | Taconic | B6-M | |
| Black 6 inbred mice,female, C57BL/6NTac | Taconic | B6-F | |
| Greenough Stereo Microscope | Leica | Leica S6 E |
References
- Saxén, L. Organogenesis of the kidney. Developmental and Cell Biology Series. 19, Cambridge University Press. (1987).
- Lindström, N. O., et al. Integrated β-catenin, BMP, PTEN, and Notch signalling patterns the nephron. eLife. 4, e04000 (2015).
- Peuckert, C., et al. Multimodal Eph/Ephrin signaling controls several phases of urogenital development. Kidney Int. 90 (2), 373-388 (2016).
- Pasquale, E. B. Eph receptor signalling casts a wide net on cell behaviour. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (6), 462-475 (2005).
- Bonanomi, D., et al. Ret Is a Multifunctional Coreceptor that Integrates Diffusible- and Contact-Axon Guidance Signals. Cell. 148 (2), 568-582 (2012).
- Brown, A. C., et al. Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney. J Vis Exp. (50), e2555 (2011).
- Olympus Support. , Available from: http://www.olympusamerica.com/cpg_section/cpg_archived_product_details.asp?id=817 (2016).
- Grobstein, C. Inductive interaction in the development of the mouse metanephros. J Exp Zool. 130, 319-340 (1955).
- Saxén, L., Toivonen, S. Primary Embryonic Induction. , Academic Press. London. (1962).
- Saxén, L., Koskimies, O., Lahti, A., Miettinen, H., Rapola, J., Wartiovaara, J. Differentiation of kidney mesenchyme in an experimental model system. Adv Morphog. 7, 251-293 (1968).
- Dudley, A. T., Godin, R. E., Robertson, E. J. Interaction between FGF and BMP signaling pathways regulates development of metanephric mesenchyme. Genes Dev. 13, 1601-1613 (1999).
- Perälä, N., et al. Sema4C-Plexin B2 signalling modulates ureteric branching in developing kidney. Differentiation. 81 (2), 81-91 (2011).
- Thesleff, I., Ekblom, P. Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney. J Embryol exp Morph. 82, 147-161 (1984).
- Watanabe, T., Costantini, F. Real-time analysis of ureteric bud branching morphogenesis. Dev Biol. 271, 98-108 (2004).
- Sebinger, D. D. R., Unbekandt, M., Ganeva, V. V., Ofenbauer, A., Werner, C., Davies, J. A. A Novel, Low-Volume Method for Organ Culture of Embryonic Kidneys That Allows Development of Cortico-Medullary Anatomical Organization. PLoS One. 5 (5), e10550 (2010).
- Ekblom, P., Miettinen, A., Virtanen, I., Wahlström, T., Dawnay, A., Saxén, L. In vitro segregation of the metanephric nephron. Dev Biol. 84 (1), 88-95 (1981).
- Davies, J. A., Unbekandt, M. siRNA-mediated RNA interference in embryonic kidney organ culture. Methods Mol Biol. 886, 295-303 (2012).
- Saxén, L., Lehtonen, E. Embryonic kidney in organ culture. Differentiation. 36 (1), 2-11 (1987).
- Bard, J. B. L. The development of the mouse kidney embryogenesis writ small. Curr Opin Genet Dev. 2, 589-595 (1992).
- Davies, J. A. A method for cold storage and transport of viable embryonic kidney rudiments. Kidney Int. 70 (11), 2031-2034 (2006).
- Batourina, E., et al. Distal ureter morphogenesis depends on epithelial cell remodeling mediated by vitamin A and Ret. Nat Genet. 32 (1), 109-115 (2002).
