Summary
Bu protokol, fare embriyolarından metanefrik temelleri izole etmek ve kültürlemek için bir yöntem açıklamaktadır.
Abstract
Bu protokolün amacı, fare metanfrizik temellerinin diseksiyonu, izolasyonu ve kültürü için bir yöntem tanımlamaktır.
Memeli böbrek gelişimi sırasında iki progenitör doku, üreterik tomurcuk ve metanefrik mezenşim, hücrenin mekanizmalarını birbirleriyle iletişim kurar ve karşılıklı olarak toplayıcı sistemi ve böbreğin nefronlarını oluştururlar. Memeli embriyolar intrauterin olarak büyür ve bu nedenle gözlemci tarafından erişilemez olduğundan, bir organ kültürü geliştirilmiştir. Bu yöntemle böbrek organogenezi sırasında epitelial mezenkimal etkileşimler ve hücresel davranışları incelemek mümkündür. Ayrıca konjenital böbrek ve ürogenital sistem malformasyonlarının kökeni de araştırılabilir. Dikkatle diseksiyon yapıldıktan sonra, metanfrrik temeller, kültür ortamında yüzen ve birkaç gün süreyle bir hücre kültürü inkübatöründe tutulabilen bir filtreye aktarılır. Bununla birlikte, koşullarınYapay ve dokudaki metabolizmayı etkileyebilir. Ayrıca, eksplantda bulunan ekstrasellüler matriks ve bazal membran nedeniyle test maddelerinin penetrasyonu sınırlı olabilir.
Organ kültürünün en önemli avantajlarından biri, deneycinin organa doğrudan erişebilmesidir. Bu teknoloji ucuz, basittir ve biyolojik açıdan aktif maddelerin eklenmesi, genetik varyantların incelenmesi ve gelişmiş görüntüleme teknikleri gibi çok sayıda değişikliğe izin verir.
Protocol
Fareler, İsveç yönetmeliklerine ve Avrupa Birliği mevzuatına (2010/63 / AB) göre korunmuştur. Bütün prosedürler İsveç Etik Komitesinin talimatlarına (C79 / 9, C248 / 11 ve C135 / 14 izinlerine) uygun olarak gerçekleştirildi. Heidelberg Üniversitesi'ndeki hayvan konularını içeren prosedürler Regierungspräsidium Karlsruhe ve Heidelberg Üniversitesi'nden Hayvan Refahı Memurları tarafından onaylanmıştır.
1. Kültür için Reaktiflerin ve Materyallerin Hazırlanması
NOT: Kirliliği en aza indirgemek için laminer bir akış kaputu kullanın.
- Diseksiyon günü, insana ait Fc'yi tek başına veya insan Fc'ye kaynaştırılmış rekombinant kimerik efrin proteini, anti-insan Fc keçi antikorları ile steril fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1: 5'lik bir molar oranda karıştırarak önceden kümeleyin. 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin 5 .
- Kültür ortamını, Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamını tamamlayarak hazırlayın: Besleyici% 1 penisilin / streptomisin (h / h),% 1 glutamin (h / h),% 1 insülin-transferrin-selenyum (h / h), 50 ug / mL insan holo- lanyum karışımı ile F-12 karışımı (DMEM / F12) Transferrin ve 1.5 ug / mL amfoterisin.
NOT: 16 embriyo için 10 mL ortam yeterlidir. - Kültür ortamına 20 μg / mL son konsantrasyonda kümelenmiş rekombinant efrin çözeltisi ekleyin. Kümelenmiş insan Fc'sini kontrol olarak kullanın.
- Steril, kaplanmamış, düz dipli polistiren 4 yuvalı plakanın her bir kuyusuna 500 μL kültür ortamı ilave ederek kültür plakaları hazırlayın.
- Steril forseps kullanarak dikkatli bir şekilde 5 μm / gözenek büyüklüğünde bir polikarbonat membran filtreyi ortamın üzerine yerleştirin. Hazırlanan plakayı kuluçka makinesine aktarın (37 ° C /% 5 CO 2 ). Filtrenin üst yüzeyde kuru kalmasını ve yüzmesini sağlayın.
NOT: İki böbrek anlagen için bir filtre yeterlidir. - Bir traş bıçağı kullanarak, yaklaşık 30 pipet ipucu (hacim: 100 uL) yaklaşıkY 1 mm daha geniş bir açılma ile sonuçlanacak şekilde. Uçları bir pipet uçlu rafa geri yerleştirin.
2. Metanfrik Temellerin E11.5'te Diseksiyonu
- E11.5'te servikal dislokasyon ile (veya yerel etik komitesince onaylanmış bir yöntemi kullanarak) zamana bağlı hamile bir fareyi kurban edin.
- Brown ve ark . Tarafından açıklandığı üzere uterus ve embriyoları çıkarın 6 . Bu noktadan itibaren diseksiyon mikroskopu altında çalışın.
- 5 nolu saatçi forseps kullanarak, forellerin altında doğrudan embriyo kesin. Her bir embriyo için taze bir petri kullanın. Bacakları ve embriyonun kuyruğunu çıkarın. Bunu yapmak için, bir çift No.5 saatçilik forsepsiyle çıkarılacak dokuyu alın ve kesmek için ikinci bir çiftin uçlarını kullanın.
- Ventral organ kütlesini çıkarmak için, embriyonun vücut duvarını bir burun deliğinden kaudal yönde yana doğru açmak için bir çift forsepsin uçlarını kullanın.
- Yüzeyel olarak, paralel olarak kesO dorsal aorta. Yöneltmek için kan dolu ve bu nedenle görünür dorsal aort kullanın. Kapalı forseps ipuçlarını kullanarak vücut duvarının ventral kısmını dorsal kısımdan dikkatlice ayırın ve embriyo üzerine çevirin. Vücut duvarı bir rostral-kaudal yönde lateral olarak kesin ve önceki yan için olduğu gibi yönlendirme için dorsal aortu kullanın.
- Ventral vücut duvarı dorsal vücuttan ayrıldıktan sonra, bir çift forsepsle tutun ve organ kütlesi ile birlikte dikkatle çekerek çıkarın.
NOT: Metanefrik anlagen genellikle dorsal vücut duvarına yapışır. Bunlar, oval, ~ 200 μm uzunluğunda yapıların arka bacaklar seviyesinde bulunur. - Dorsal vücut duvarını, ventral yüz yukarı bakacak şekilde bir çift forsepsle tutun. Diğer forseps çiftini kullanarak, dorsal aortayı rostral ucundan tutun ve dorsal aortayı dorsal vücut duvarından dikkatlice soyun.
NOT: Her iki metanefrik böbrek genellikle ekte kalırDorsal aorta yapıştırılmış. - Bir çift forseps kullanarak, aortu çıkarmak için rostral olarak böbrek anlagenine kestik. Daha sonra forseps ipuçlarını kullanarak iki böbrek anlagen dikkatlice ayırın.
- Forsep ipuçlarını kullanarak böbrek anlagenindeki istenmeyen dokuları dikkatlice soyun. Hasar kötü büyümeye ve eksplantın ek analizden çıkarılmasına neden olabileceğinden mezenşime zarar vermemeye özen gösterin.
- Böbrek anlagenini, bir mikrolitrre pipet ve 4 plaka içindeki polikarbon membran filtreye 10 μL PBS içinde geniş açık pipet kullanarak ayrı olarak aktarın.
NOT: Yüzey gerilimi nedeniyle, eksplant ince bir ortam tabakası ile örtülür. İki böbrek anlagen için bir filtre yeterlidir.- İki böbrek anlageninin her birini filtrenin ilgili yarısının ortasına yerleştirin. Plakayı 37 ° C /% 5 CO 2'de inkübatöre geri aktarın. Metanetrik rud gelinceye kadar plakayı inkübatöre bırakınBir sonraki embriyo örnekleri filtreye konmaya hazırdır.
- Her embriyo için 2.3-2.9.1 adımlarını tekrarlayın.
NOT: Bazı uygulamalarda, diseksiyon prosedürü, embriyo başına yaklaşık 5 dakika sürecektir. - 37 ° C /% 5 CO 2'de 3 gün boyunca böbrek anlagen inkübe edin.
3. Fiksasyon ve Boyama için Reaktiflerin Hazırlanması
- Kalsiyum ve magnezyum (w / v) olmadan PBS içinde% 4 paraformaldehit (PFA) hazırlamak için, PFA 60 ° C'de çözülür, sürekli karıştırılır. Oda sıcaklığına soğutun ve kalan parçacıkları çıkarmak için bir kağıt filtre kullanın. Derhal çalkalamak için 4 ° C'de tutun veya uzun süreli depolamada dondurun.
DİKKAT: PFA toksiktir. Yerel güvenlik standartlarında belirtilen kişisel koruyucu donanım kullanın ve bir davlumbazda çalışın. Kurumsal talimatları takip edip atık atın ve atık konteynırlarını kullanın. - Geçirgen hale getirme çözeltisi hazırlamak için, Triton X-100'ü seyreltinPBS içinde kalsiyum ve magnezyum olmadan% 0.3 (h / h).
- Bloklama çözeltisi hazırlamak için, kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS'ye% 5 (v / v) keçi serumu ve% 0.1 Triton X-100 ekleyin. % 0.02 (w / v) nihai konsantrasyona sodyum azid ekleyin. 4 ° C'de saklayın.
DİKKAT: Sodyum azid toksiktir. Sodyum azidi yerel güvenlik ve çevre koruma yönetmeliklerine uygun olarak kullanın.
NOT: Boyama için antikor kullanırken, ikincil antikorun bloke edici solüsyon yapmak için türetildiği türlerden% 5 serum kullanın. - Bloke edici çözeltide, biyotinlenmiş Dolichorus biflorus aglutinin 1: 200 seyreltin. Bloke edici çözeltide Alexa488-konjüge streptavidin 1: 200 seyreltin.
- 0.1 M Tris-HC1 (pH 8.5) içinde 0.1 g suda çözünür polivinil alkol bazlı muko yapışkan / mL ila% 25 (w / v) gliserol ilave etmek üzere, kullanıma hazır gömme ortamı yapmak için (materyal tablosuna bakın) . Sürekli çalkantı altında 50 ° C'ye 1 saat boyunca ısıtın, soğutun ve pH'ı 1 ile 8.0-8.5'e ayarlayınNaOH. Daha yüksek NaOH konsantrasyonlarından kaçının. % 0.02 (w / v) nihai konsantrasyona kadar 100 μg / mL N-propilgalat ve timerosal ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika karıştırın.
DİKKAT: Thimerosal toksiktir. Yerel güvenlik ve çevre koruma yönetmeliklerine uygun olarak tutun.- Gömülü ortamı 50 mL'lik tüplere doldurun, rotoru dengeye getirin ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında 3.200 xg'de santrifüjleyin. 15 mL'lik tüplere temiz bir solüsyon dökün ve pelleti atın. Birkaç hafta süreyle -20 ° C'de miktar ve depolar. Çözündükten sonra çözeltiyi 4 ° C'de tutun. Kullanımdan hemen önce ~ 30 ° C'ye kadar ısıtın.
- Eksplantlara sahip filtreler monte edilecek kadar çok cam slayt hazırlayın. Bunun için, anında yapışkan kullanarak cam sürgünün her iki yanında 18 x 18 mm'lik iki adet küçük lamelleri tutkal edin. Aralarında filtre için ~ 15 mm boşluk bırakın.
4. Fiksasyon ve boyama
- 3 kültür periyodundan sonraIn vitro (div) günler, kuluçka makinesinden plakaları çıkartın ve bir mikropipet kullanarak kültür ortamını her kuyucuktan dikkatle aspire edin. Filtreye dokunmamaya dikkat edin ve ucu açma kuyusunun duvarına doğru tutun.
- Her göze 500 uL% 4 PFA / PBS ekleyin. Filtreler fiksatif üzerine yüzer. Bir mikropipet kullanarak, filtreleri batırmak için PFA sabitleyiciyi damla damla dikkatle ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
NOT: Takip eden tüm adımlar için, eksplantları filtreden yıkamamaya özen gösterilmelidir. Pipet ucunun ağzına doğru açılmasını sağlayın. - PFA'yı çıkarın ve 500 ul PBS ile yıkayın, filtreyi suya batırın. Her göze 500 μL permeabilizasyon solüsyonu ilave edin ve 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin.
- 500 μL PBS ile iki kez durulayın ve her oyuğa 500 μL engelleyici çözüm ekleyin. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
- Bloklama çözeltisini şu şekilde değiştirin:Bloke edici çözeltide 1: 200 oranında seyreltilmiş 250 uL biyotinlenmiş Dolichorus biflorus aglutinin ve 4 ° C'de 24 saat inkübe edin.
- Dolichorus biflorus aglutinin solüsyonunu çıkarın ve her göz başına 500 μL PBS ile iki kez durulayın.
- Bloke edici çözelti 1: 200 seyreltilmiş 250 uL Alexa488-konjuge streptavidin ekleyin ve 24 saat boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Alternatif olarak, oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe edin.
NOT: 4 ° C'de inkübe edildiğinde daha iyi bir sinyal-gürültü oranı elde edilir. - Kuyu başına iki kez 500 μL PBS ile durulayın. Forseps kullanarak, filtreleri hazırlanan cam slaytlara, eksplantlar yukarı bakacak şekilde nakletin. ~ 50-100 μL embedding aracı ile monte edin. 60 mm uzunluğunda No. 1.5 lamelleri ile kaplayın. Gömülü orta solüsyonun karanlıkta oda sıcaklığında 2 saat süreyle katılaşmasına izin verin. Resim hazır oluncaya kadar 4 ° C'de folyoya sarılmış slaytları görüntülemeye veya saklamaya devam edin.
- Geniş alan epifluoresan mikroskopu ile görüntü 7 </ Sup> bir Hg lambasına bağlanmış ve mavi uyarılma için bir ayna ünitesi (uyarma bandı geçişi, 460 - 495 nm, çift renk ayna, 505 nm ve emisyon bandı geçişi, 510 - 550 nm) ve 20X Plan-Apokrom lensleri, 0.75 sayısal açıklık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metanefrik böbrek anlagen E11.5 gebe Black-6 yakın cinsinden farelerden türetilmiş ve kültürlenmiştir. Üç gün sonra üreter tomurcuğu 5 kez dallandı ve başlangıçta T şeklindeki üreter tomurcuğunun dalgalanmasına neden oldu. Her eksplant fotoğraflandı ve dallanma nesillerini belirlemek ve dal başına bitiş noktalarının sayısını hesaplamak için bölümlerin ve uç noktaların sayıları nicelleştirildi ( Şekil 1 ). Image 4. nesil, kontrol eksplantlarının% 35'ine kıyasla, tedavi edilen eksplantların yalnızca% 8'inde ulaşılmıştır ( Şekil 1b ). Buna göre, dal başına bitiş noktası sayısı ve mm2 başına bitiş noktası sayısı azalmıştır. Eksplantlar kümelenmiş EphrinB2 ile tedavi edildi Ek olarak, eksplantların üçte birinde üreter tomurcuklanma ipuçlarında olağan dışı morfoloji vardı ( Şekil 1 ) .Bu sonuçlar EphrinB2'nin kısıtlayıcı bir etkiye sahip olabileceğini düşündürdüBüyük olasılıkla EphA4 ve EphB2 ileri sinyalizasyonunu aktive ederek üretere tomurcuk dallanma işlemi üzerinde.
Başarılı bir deney için metanefrik mezenkimin diseksiyon sırasında hasar görmemesi kritik önem taşır. Mezenkitin herhangi bir yaralanması, endüktif potensiyeli azaltır, üreterik tomurcuk dallanmasının azalmasına veya var olmamasına neden olur ve bir önyargı kaynağı olabilir. Şekil 2A'daki örnek, mezenşimin neredeyse eksik olduğu bir eksplant gösterir. Üreter tomurcuğu T aşamasının ötesine geçemedi. Şekil 2B , metanefrik mezenşimin hasarının yetersiz büyümeye ve dallanmaya neden olduğu bir örneği göstermektedir. Her iki eksplant da analiz dışı bırakılmalıdır.
Şekil 1: E11.5 3 bölgede yetiştirilen ve Kümelenmiş Rekombinant EphrinB2 veya Çıplak İle Tedavi Edilen Metanefrik Böbrek Anlagenİnsan Fc'sini Kontrol Olarak Kullandım. ( A ) Metanfrik böbrek anlagen, E11.5'te parçalandı, 3 delik için kültürlendi ve biyotinlenmiş Dolichorus biflorus aglutinin ve Alexa488-konjüge streptavidin ile boyandı. Eksplantlar, 460-495 nm'lik bir uyarım bandı geçişi, 505 nm'lik bir dikromatik ayna, 510-550 nm'lik bir emisyon bandı geçişi ve 20X Plan-Apokromatik lensler ile geniş alanlı bir epifloresan mikroskop ile görüntülendi. Kümelenmiş rekombinant EphrinB2'nin (clEfrinB2) uygulaması, üreter tomurcuk uçlarının dallanmanın karmaşıklığını ve malformasyonunu azaltmıştır (ok başı). ( B ) Sol grafik, clEphrinB2 ile tedavi edilen ve kontrol eksplantlarındaki dallanma nesillerini göstermektedir. 4. nesil dallanma, işleme yapılan eksplantların sadece% 8'inde ulaşıldı, buna karşın kontrol eksplantlarının% 35'inde idi. Bölme başına bitiş noktası sayısı (orta grafik) ve alan başına bitiş noktası sayısı (sağ grafik) azaldı (dallardaki CNT başına uç noktalar, 2.1 ± 0.09; clEphrinB2, 1.7± 0.08, P = 0.007 **; Kare milimetre başına bitiş noktaları: CNT, 31 ± 0.01; ClEphrinB2, 27 ± 0.02; P = 0.04 *; N = 23). Veriler ortalama ± SEM olarak sunuldu ve eşleştirilmemiş bir Student t testi kullanıldı. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakam, Peuckert ve ark. Tarafından değiştirildi . , 2016 3 . Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Disseksiyon sırasında hasar gören, 3 delikli kültürlenen ve Biotinile Dolichorus Biflorus Agglutinin ve Alexa488-konjuge Streptavidin ile boyanan İki E11.5 Metanefrik Böbrek Anlagen örneği. ( A ve B ) Mezenkimanın hasarı yetersiz büyüme ve üreterik tomurcuk dallanması ile sonuçlandı,Eksplantları daha ileri analizlerden diskalifiye etme. ( A ) Metilenfrik böbrek eksplantları 3 div sonra, üreter tomurcuk dallanmaz. Sadece ilk T-kademesi dalı görünür. ( B ) Kötü üreter tomurcuk dallanarak 3 div sonra metanefrik böbrek eksplant. Ölçek çubuğu = 60 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu el yazması, fare embriyosundan gelişen metanefrik anlagen'in izole edilmesi ve organ öncüllerinin kültürlenmesi için bir yöntem açıklamaktadır. Bu yöntem, Grobstein 8 ve Saxén 9 , 10 tarafından geliştirilen standart bir tekniktir ve diğerleri 11 , 12 tarafından uyarlanmış ve değiştirilmiştir. Yöntemin başarısı, eksplantların sağkalımı ve endüktif potansiyelin, uzamış diseksiyon süresi ile azalması nedeniyle, çoğunlukla diseksiyonun süresine bağlıdır. Çevredeki dokudan böbrek rudimanını temizlerken mezenşime zarar vermemek için dikkatli olunmalıdır. Metanefrik mesenşimin hasar görmesi, eksplantların yetersiz büyümesinin sebebi olur. Bununla birlikte, diseksiyon hızı ve ince motor becerileri uygulama ile büyük ölçüde gelişir.
Sunulan protokoldeki kimyasal olarak tanımlanmış ortam,Primer hücre ve in vitro organ kültüründe serum içeren madde içerir ve eksplantların büyümesini ve hayatta kalmasını desteklemek için insülin transferrin-selenyum ile takviye edilmiş 1: 1 (h / h) DMEM ve Ham's F-12 karışımı içerir. Glukoz ve amino asit alımı, lipogenezis ve hücre içi ulaşım insülin tarafından kolaylaştırılır. Selenyum, glutatyon peroksidazının bir kofaktörüdür ve antioksidan olarak işlev görür. Transferrin demir taşıyıcıdır ve oksijen radikallerine karşı koruma sağlar. Embriyonik böbrek kültüründe, transferin, ortama ilavesi, tübü diferansiasyonunu ve timidin birleşmesini doz bağımlı bir şekilde arttırır ve maksimum 50 μg / mL'lik bir etki sağlar13. Dolayısıyla, insan-holo- transferrin ilave olarak, yaklaşık 55 ug / mL'lik bir nihai transferrin konsantrasyonuyla sonuçlandırılır. Eagle Minimal Essential Medium ile daha basit ama kimyasal olarak daha az tanımlanmış bir bileşim kullanan birçok protokol(MEM) veya DMEM ve% 10 serum ( örn., Fetal sığır serumu, FBS) de 12,13,14,15 çok tatmin edici sonuçlar verir. Bununla birlikte, farklı FBS lotları arasındaki farklılıklar olabilir. Bu varyasyonlardan kaçınmak ve serumda Eph sinyali veren büyüme faktörlerinin muhtemel etkileşimini dışlamak için, serumdan arınmış ortam seçildi. Serumsuz besiyeri kullanılıp kullanılmayacağı, deneysel düzene ve bilimsel soruna bağlıdır. Nihai amaç terapötik uygulamalardığında, serum-serbest kültür koşulları özellikle gereklidir. Bu protokole dahil olan anti-fungal ajan olan Amfoterisin B atlanabilir. Sunulan örnekte kültür süresi 3 gündür, ancak metanefrik böbrek esasları 10 gün 15'e kadar kültürlenebilir. 3 günden fazla kültürlerde, ortam 48 saatte bir değiştirilmelidir. Ölenlerin gelişimiIn vitro çalışmalarda pre-borular agrega, böbrek veziküllerin ve virgül ve S-şekilli cisimlerin in vivo dizileri yeniden özetlenir. In vitro 3 gün sonra, glomerüler benzeri yapılar 15 , 16 oluşturdu. Daha uzun kültürlerde, ekstraktör alanı, üreter tomurcuğunun dallanmasına bağlı olarak daha da artar. Yaklaşık 5 günlük kültürde nefronlar distal, orta ve proksimal bölmelere 16 ayrılmıştır.
Tekniğin göreli kolaylığı ve maliyet etkinliğine rağmen, çok yönlü uygulamalara izin verilirken, deneyler planlanırken ve sonuçların yorumlanmasında bazı hususlar akılda tutulmalıdır. Kültür organlarında bulunan ekstraselüler matriks ve bazal membran nedeniyle, eksojen ajanların ve parçacıkların difüzyonu sınırlıdır ( 17) . Dahası, yapay kültür şartları ve manipülasyonları, metabolizmada değişikliğe neden olabilirDokunun ism ve in vivo durum 15 , 18 farklı hücre davranışı. En belirgin olan, eksplantların kan dolaşımının olmaması ve glomerüllerin avasküler olması; Nefronlar bölünmüş halde olmasına rağmen, bölgeye ayrılma ve bir medulla oluşumu ve Henle döngüleri eksik 14 , 19 . Böylelikle, embriyonik böbrek kültürünün uygulama spektrumu boru yapıları, dallanma morfolojisi ve mezenkimal epitelyal etkileşimlerle sınırlıdır. Sonuç olarak, böbrek fonksiyonlarını hedef alan bilimsel sorular ele alınamıyor.
Böbrek referanslarının kaplanmış cam üzerinde düşük hacimde büyüyen kültür yönteminin son modifikasyonları, Henle 15'in genişletilmiş döngüleri ile bile kortiko-medüller zonasyona kadar organotipik gelişimi sağladı. Ayrıca, son zamanlarda, yaşamanın saklanması ve korunması için bir yönteminEmbriyonik böbrekler yayınlandı. Bu yöntem, embriyonik böbrek örneklerinin E11.5'te birkaç gün taşınmasını sağlar ve daha sonra kültürlenmelerine izin verir. Bu özellikle işbirliklerine ilgi duyuyor 20 . Tüm böbrek rudım kültürünün doğası ileri görüntüleme teknikleri de dahil olmak üzere çeşitli metodolojik uyarlamalara izin verir. Canlı görüntüleme sırasında rahatsız edici hareketlerden kaçınmak için, yüzen aracın yerine yerleştirilmiş bir iç filtre gibi sabit bir filtre ile değiştirilmesi önerilir. Sunulan teknoloji, tüm ürogenital sistemi içeren kültür dokusu bloklarına kadar genişletilmiştir. Bu genişletilmiş kültürü kullanarak, mesaneye üreter girişi araştırılabilir 21 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar Leif Oxburgh'a ve Derek Adams'a, teknik destekleri için Stefan Wölfl ve Ulrike Müller ve teknik destekleri için Saskia Schmitteckert, Julia Gobbert, Sascha Weyer ve Viola Mayer'e yardım etmek için el yazmalarına yararlı yorumlar için Leif Oxburgh'u cömertçe paylaşmaktan dolayı teşekkür ederler. laboratuvarı. Bu çalışma Biyologlar Şirketi Geliştirme (CP) tarafından desteklendi .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 21331020 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140148 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14040117 | use for dissection |
| holo-Transferrin human | Sigma-Aldrich | T0665 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100x) | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Amphotericin B solution | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Thimerosal | Sigma-Aldrich | T5125 | |
| Propyl gallate | Sigma-Aldrich | 2370 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Biotinylated Dolichorus Biflorus Agglutinin | Vector Laboratories | B-1035 | |
| Alexa488 conjugated Streptavidin | Jackson Immuno Research | 016-540-084 | |
| Recombinant Mouse Ephrin-B2 Fc Chimera Protein, CF | R&D Systems | 496-EB | |
| Recombinant Human IgG1 Fc, CF | R&D Systems | 110-HG-100 | |
| Goat Anti-Human IgG Fc Antibody | R&D Systems | G-102-C | |
| Phosphate buffered saline tablets | Sigma-Aldrich | P4417 | use for fixation and immunostaining |
| Dumont #5, biologie tips, INOX, 11 cm |
agnthos.se | 0208-5-PS | 2 pairs of forceps are needed |
| Iris scissors, straight, 12 cm | agnthos.se | 03-320-120 | |
| Dressing Forceps, straight, delicate, 13 cm |
agnthos.se | 08-032-130 | |
| Petri dishes Nunclo Delta treated | Thermo Fisher Scientific | 150679 | |
| TMTP01300 Isopore Membrane Filter, polycarbonate, Hydrophilic, 5.0 µm, 13 mm, white, plain | MerckMillipore | TMTP01300 | |
| Nunclon Multidishes 4 wells, flat bottom |
Sigma-Aldrich | D6789-1CS | |
| Microscope cover glass 24 x 50 mm thickn. No.1.5H 0.17+/-0.005 mm | nordicbiolabs | 107222 | |
| Cover glasses No.1.5, 18 mm x 18 mm | nordicbiolabs | 102032 | |
| Slides ~76 x 26 x 1, 1/2-w. ground plain | nordicbiolabs | 1030418 | |
| VWR Razor Blades | VWR | 55411-055 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430828 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430055 | |
| Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 113V, creped | Sigma-Aldrich | WHA1213125 | |
| Fixed stage research mircoscope | Olympus | BX61WI | |
| Black 6 inbred mice, male, C57BL/6NTac | Taconic | B6-M | |
| Black 6 inbred mice,female, C57BL/6NTac | Taconic | B6-F | |
| Greenough Stereo Microscope | Leica | Leica S6 E |
References
- Saxén, L. Organogenesis of the kidney. Developmental and Cell Biology Series. 19, Cambridge University Press. (1987).
- Lindström, N. O., et al. Integrated β-catenin, BMP, PTEN, and Notch signalling patterns the nephron. eLife. 4, e04000 (2015).
- Peuckert, C., et al. Multimodal Eph/Ephrin signaling controls several phases of urogenital development. Kidney Int. 90 (2), 373-388 (2016).
- Pasquale, E. B. Eph receptor signalling casts a wide net on cell behaviour. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (6), 462-475 (2005).
- Bonanomi, D., et al. Ret Is a Multifunctional Coreceptor that Integrates Diffusible- and Contact-Axon Guidance Signals. Cell. 148 (2), 568-582 (2012).
- Brown, A. C., et al. Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney. J Vis Exp. (50), e2555 (2011).
- Olympus Support. , Available from: http://www.olympusamerica.com/cpg_section/cpg_archived_product_details.asp?id=817 (2016).
- Grobstein, C. Inductive interaction in the development of the mouse metanephros. J Exp Zool. 130, 319-340 (1955).
- Saxén, L., Toivonen, S. Primary Embryonic Induction. , Academic Press. London. (1962).
- Saxén, L., Koskimies, O., Lahti, A., Miettinen, H., Rapola, J., Wartiovaara, J. Differentiation of kidney mesenchyme in an experimental model system. Adv Morphog. 7, 251-293 (1968).
- Dudley, A. T., Godin, R. E., Robertson, E. J. Interaction between FGF and BMP signaling pathways regulates development of metanephric mesenchyme. Genes Dev. 13, 1601-1613 (1999).
- Perälä, N., et al. Sema4C-Plexin B2 signalling modulates ureteric branching in developing kidney. Differentiation. 81 (2), 81-91 (2011).
- Thesleff, I., Ekblom, P. Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney. J Embryol exp Morph. 82, 147-161 (1984).
- Watanabe, T., Costantini, F. Real-time analysis of ureteric bud branching morphogenesis. Dev Biol. 271, 98-108 (2004).
- Sebinger, D. D. R., Unbekandt, M., Ganeva, V. V., Ofenbauer, A., Werner, C., Davies, J. A. A Novel, Low-Volume Method for Organ Culture of Embryonic Kidneys That Allows Development of Cortico-Medullary Anatomical Organization. PLoS One. 5 (5), e10550 (2010).
- Ekblom, P., Miettinen, A., Virtanen, I., Wahlström, T., Dawnay, A., Saxén, L. In vitro segregation of the metanephric nephron. Dev Biol. 84 (1), 88-95 (1981).
- Davies, J. A., Unbekandt, M. siRNA-mediated RNA interference in embryonic kidney organ culture. Methods Mol Biol. 886, 295-303 (2012).
- Saxén, L., Lehtonen, E. Embryonic kidney in organ culture. Differentiation. 36 (1), 2-11 (1987).
- Bard, J. B. L. The development of the mouse kidney embryogenesis writ small. Curr Opin Genet Dev. 2, 589-595 (1992).
- Davies, J. A. A method for cold storage and transport of viable embryonic kidney rudiments. Kidney Int. 70 (11), 2031-2034 (2006).
- Batourina, E., et al. Distal ureter morphogenesis depends on epithelial cell remodeling mediated by vitamin A and Ret. Nat Genet. 32 (1), 109-115 (2002).
