Summary
Este protocolo descreve um método para isolar e cultivar rudimentos metanefricos de embriões de ratinho.
Abstract
O objetivo deste protocolo é descrever um método para a dissecção, isolamento e cultura de rastreios metanefric do rato.
Durante o desenvolvimento do rim mamífero, os dois tecidos progenitorais, o broto ureterico e o mesênquima metanéfrico, comunicam-se e induzem reciprocamente mecanismos celulares para formar eventualmente o sistema colector e os nefrões do rim. À medida que os embriões de mamíferos crescem intra-uterinos e, portanto, são inacessíveis ao observador, desenvolveu-se uma cultura de órgãos. Com este método, é possível estudar interações epitélio-mesenquimais e comportamento celular durante a organogênese do rim. Além disso, a origem das malformações congênitas do rim e do trato urogenital pode ser investigada. Após dissecção cuidadosa, os rudimentos metanéfricos são transferidos para um filtro que flutua no meio de cultura e podem ser mantidos numa incubadora de cultura de células durante vários dias. Contudo, deve ter-se em conta que as condiçõesArtificial e poderia influenciar o metabolismo no tecido. Além disso, a penetração das substâncias de teste poderia ser limitada devido à matriz extracelular e à membrana basal presentes no explante.
Uma vantagem principal da cultura do órgão é que o experimentador pode ganhar o acesso direto ao órgão. Esta tecnologia é barata, simples e permite um grande número de modificações, como a adição de substâncias biologicamente ativas, o estudo de variantes genéticas e a aplicação de técnicas de imagem avançadas.
Protocol
Os ratinhos foram mantidos de acordo com a regulamentação sueca ea legislação da União Europeia (2010/63 / UE). Todos os procedimentos foram realizados seguindo as diretrizes do Comitê de Ética Sueco (autorizações C79 / 9, C248 / 11 e C135 / 14). Procedimentos na Universidade de Heidelberg envolvendo animais sujeitos foram aprovados pelo Regierungspräsidium Karlsruhe e os agentes de bem-estar animal na Universidade de Heidelberg.
1. Preparação de Reagentes e Materiais para a Cultura
NOTA: Use uma capa de fluxo laminar para minimizar a contaminação.
- No dia da dissecção, Fc humano pré-agrupamento ou proteína de efrina quimérica recombinante fundida a Fc humano por mistura com anticorpos de cabra Fc anti-humanos numa razão molar de 1: 5 em solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS). Incubar durante 1 h a 37 ° C 5 .
- Preparar o meio de cultura suplementando Dulbecco Modified Eagle Medium: NutrientMistura F-12 (DMEM / F12) com penicilina / estreptomicina a 1% (v / v), glutamina a 1% (v / v), insulina transferrina selénio (v / v) a 50 μg / Transferrina e 1,5 μg / mL de anfotericina.
NOTA: 10 mL de meio é suficiente para 16 embriões. - Adicionar solução de efrínina recombinante agrupada a uma concentração final de 20 μg / mL ao meio de cultura. Use o Fc humano agrupado como controle.
- Preparar placas de cultura por adição de 500 μL de meio de cultura a cada poço de uma placa de 4 poços de poliestireno estéril, não revestido, de fundo plano.
- Usando pinças esterilizadas, coloque cuidadosamente um filtro de membrana de policarbonato com um tamanho de poro de 5 μm por poço em cima do meio. Transferir a placa preparada para a incubadora (37 ° C / 5% CO 2 ). Certifique-se de que o filtro permanece seco na superfície superior e flutua.
NOTA: Um filtro é suficiente para dois anlagen de rim. - Usando uma lâmina de barbear, corte aproximadamente 30 pontas de pipeta (volume: 100 μL) approximatelY 1 mm da ponta para resultar numa abertura mais larga. Coloque as pontas de volta em um rack de ponta de pipeta.
2. Dissecção de Rudimentos Metanefricos em E11.5
- Sacrifique um rato com gestação cronometrada em E11.5 por deslocamento cervical (ou usando um método aprovado pelo comitê de ética local).
- Remova o útero e os embriões, como descrito por Brown et al 6 . Deste ponto em diante, trabalhar sob um microscópio de dissecção.
- Usando pinças de relojoeiro No. 5, corte o embrião diretamente sob as patas dianteiras. Use um prato de Petri fresco para cada embrião. Remova as pernas ea cauda do embrião. Para fazer isso, pegue o tecido a ser removido com um par de fórceps de relojoeiro No. 5 e use as pontas de um segundo par para cortar.
- Para remover a massa do órgão ventral, use as pontas de um par de fórceps para abrir lateralmente a parede do corpo do embrião em uma direção rostral para caudal.
- Corte superficialmente, paralelo a tAorta dorsal. Use a aorta dorsal cheia de sangue e portanto visível para orientação. Cuidadosamente separar a parte ventral da parede do corpo da parte dorsal usando as pontas da pinça fechada e virar o embrião sobre. Corte a parede do corpo lateralmente em uma direção rostral-para-caudal e usando a aorta dorsal para a orientação, como para o lado anterior.
- Uma vez que a parede do corpo ventral foi separada do corpo dorsal, agarrá-lo com um par de fórceps e puxe cuidadosamente para removê-lo, juntamente com a massa do órgão.
NOTA: O anlagen metanefric permanece geralmente unido à parede do corpo dorsal. São estruturas ovais, ~ 200 μm de comprimento, localizadas ao nível dos membros posteriores. - Segure a parede do corpo dorsal com um par de fórceps, com o lado ventral voltado para cima. Usando o outro par de fórceps, pegue a aorta dorsal em sua extremidade rostral e cuidadosamente descascar a aorta dorsal da parede do corpo dorsal.
NOTA: Ambos os rins metanefric geralmente permanecem anexarÀ aorta dorsal. - Usando um par de fórceps, corte rostralmente para o rim anlagen para remover a aorta. Em seguida, cuidadosamente separar o anlagen dois rins usando as pontas do fórceps.
- Cuidadosamente descascar tecido não desejado do rim anlagen usando as pontas do fórceps. Tome cuidado para não danificar o mesênquima, uma vez que os danos podem resultar em crescimento fraco e exclusão do explante de uma análise posterior.
- Transferir o anlagen renal separadamente usando uma pipeta de microlitro e uma ponta de pipeta aberta em 10 μL de PBS para o filtro de membrana de policarbonato em uma placa de 4 poços.
NOTA: Devido à tensão superficial, o explante será coberto com uma fina camada de meio. Um filtro é suficiente para dois rim anlagen.- Coloque cada um dos dois anlagen renal no centro de cada respectiva metade do filtro. Transferir a placa de volta para a incubadora a 37 ° C / 5% de CO2. Deixar a placa na incubadora até que o metanephric rudImensos do próximo embrião estão prontos para serem colocados no filtro.
- Repita os passos 2.3-2.9.1 para cada embrião.
NOTA: Com alguma prática, o procedimento de dissecção levará cerca de 5 min por embrião. - Incubar o anlagenio renal durante 3 dias a 37 ° C / 5% CO 2 .
3. Preparação de Reagentes para Fixação e Coloração
- Para preparar paraformaldeído a 4% (PFA) em PBS sem cálcio e magnésio (p / v), dissolver a PFA a 60 ° C em PBS, agitando continuamente. Arrefecer até à temperatura ambiente e utilizar um filtro de papel para remover as restantes partículas. Alíquota e manter a 4 ° C para uso imediato ou congelar para armazenamento de longo prazo.
CUIDADO: PFA é tóxico. Usar o equipamento de proteção individual especificado nas normas de segurança locais e trabalhar em um exaustor. Descarte resíduos de acordo com as diretrizes institucionais e usando recipientes de resíduos designados. - Para preparar a solução de permeabilização, diluir Triton X-100Em PBS sem cálcio e magnésio até 0,3% (v / v).
- Para preparar a solução de bloqueio, adicionar 5% (v / v) de soro de cabra e 0,1% de Triton X-100 a PBS sem cálcio e magnésio. Adicionar azida de sódio a uma concentração final de 0,02% (p / v). Armazenar a 4 ° C.
CUIDADO: A azida sódica é tóxica. Manipular azida de sódio de acordo com os regulamentos locais de segurança e protecção ambiental.
NOTA: Quando se utilizam anticorpos para coloração, utilizar soro a 5% da espécie a partir da qual se derivou o anticorpo secundário para se obter uma solução de bloqueio. - Diluir a aglutinina de Dolichorus biflorus biotinilada 1: 200 em solução de bloqueio. Diluir estreptavidina conjugada com Alexa488 1: 200 em solução de bloqueio.
- Para fazer um meio de incorporação pronto a usar (ver a tabela de materiais), adicione 0,1 g de mucoadesivo / ml a base de álcool polivinílico solúvel em água a 25% (p / v) de glicerol em Tris-HCl 0,1 M (pH 8,5) . Aquecer a 50 ° C sob agitação contínua durante 1 h, arrefecer e ajustar o pH para 8,0-8,5 usando 1M NaOH. Evitar concentrações mais elevadas de NaOH. Adicionar 100 μg / mL de N-propilgalato e timerosal até uma concentração final de 0,02% (p / v). Agitar durante 30 min à temperatura ambiente.
CUIDADO: O timerosal é tóxico. Manuseie-o de acordo com os regulamentos locais de segurança e protecção ambiental.- Encher o meio de incorporação em tubos de 50 mL, equilibrar o rotor e centrifugar a 3.200 xg e à temperatura ambiente durante 10 min. Decantar a solução límpida em tubos de 15 mL e descartar a pastilha. Alicuotar e armazenar a -20 ° C durante várias semanas. Uma vez descongelado, mantenha a solução a 4 ° C. Aquecer a ~ 30 ° C imediatamente antes da utilização.
- Preparar como muitos slides de vidro como filtros com explantes devem ser montados. Para isso, cola dois pequenos lamínulas, 18 x 18 mm, em ambos os lados da lâmina de vidro usando adesivo instantâneo, deixe um espaço de ~ 15 mm para o filtro entre.
4. Fixação e coloração
- Após um período de cultura de 3Dias in vitro (div), remover as placas da incubadora e aspirar cuidadosamente o meio de cultura de cada poço utilizando uma micropipeta. Certifique-se de não tocar no filtro e manter a abertura da ponta para a parede do poço.
- Adicionar 500 μL de PFA a 4% / PBS a cada poço. Os filtros flutuam no fixador. Usando uma micropipeta, adicione cuidadosamente o fixador PFA gota a gota para submergir os filtros. Incubar à temperatura ambiente durante 30 min.
NOTA: Para todas as etapas seguintes, deve-se ter cuidado para não lavar os explantes do filtro. Mantenha a abertura da ponta da pipeta em direção à parede do poço. - Remover o PFA e enxaguar duas vezes com 500 μL de PBS, submergindo o filtro. Adicionar 500 μL de solução de permeabilização a cada poço e incubar à temperatura ambiente durante 1 h.
- Enxaguar duas vezes com 500 μL de PBS e adicionar 500 μL de solução de bloqueio a cada poço. Incubar à temperatura ambiente durante 1 h.
- Substitua a solução de bloqueio por250 μL de aglutinina biotinilada de Dolichorus biflorus diluída a 1: 200 em solução de bloqueio e incubar a 4 ° C durante 24 h.
- Remover a solução de aglutinina de Dolichorus biflorus e enxaguar duas vezes com 500 μL de PBS por poço.
- Adicionar 250 μL de estreptavidina conjugada com Alexa488 diluída a 1: 200 em solução de bloqueio e incubar a 4 ° C durante 24 h. Alternativamente, incubar à temperatura ambiente durante 2 h.
NOTA: Uma melhor relação sinal-ruído é alcançada quando incubada a 4 ° C. - Enxágüe duas vezes com 500 μL de PBS por poço. Usando pinças, transfira os filtros para as lâminas de vidro preparadas, com os explantes voltados para cima. Monte com ~ 50-100 μL de meio de incorporação. Cubra com os lamínulas No. 1.5 de 60 mm de comprimento. Permitir que a solução de meio de incorporação solidifique durante 2 h à temperatura ambiente no escuro. Proceda à imagem ou guarde os slides, envoltos em papel alumínio, a 4 ° C até à imagem.
- Imagem com um microscópio de epifluorescência de campo largo 7 </ Sup> acoplado a uma lâmpada de Hg e utilizar uma unidade de espelho para excitação azul (onda de excitação, 460-495 nm, espelho dicromático, 505 nm, e passagem de emissão, 510-550 nm) e lentes 20X Plan-Apochromat, 0,75 numérico abertura.
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Representative Results
O anlagenio metan�rico de rim foi derivado de murganhos consangu�eos Black-6 gr�idos a E11,5 e foram cultivados. Após 3 dias, o botão ureteriano ramificou-se até 5 vezes, resultando em uma ramificação do botão ureter inicialmente em forma de T. Cada explante foi fotografado e os números de segmentos e pontos finais foram quantificados para determinar as gerações de ramificação e calcular o número de pontos finais por ramo ( Figura 1 ). ( Figura 1b ), o número de pontos de extremidade por ramo e pontos de extremidade por mm 2 foi reduzido na proporção de 10% dos explantes tratados, em comparação com 35% dos explantes de controle ( Figura 1b ). Explantes tratados com Ephrin B2 agrupado.Além disso, um terço dos explantes tinham uma morfologia incomum nas pontas do botão ureteric ( Figura 1 ) Estes resultados sugerem que EphrinB2 pode ter um efeito restritivoSobre o processo de ramificação do botão ureteric, muito provável ativando EphA4 e EphB2 que sinaliza para diante.
Para uma experiência bem sucedida, é crítico que o mesênquima metanefrico não seja danificado durante a dissecção. Qualquer lesão do mesênquima diminui o potencial indutivo, leva a ramificação ureteriana reduzida ou ausente do botão e pode ser uma fonte de viés. O exemplo na Figura 2A mostra um explante onde o mesênquima está quase ausente. O botão ureteral não se ramificou além do T-estágio. A Figura 2B mostra um exemplo onde o dano do mesênquima metanéfrico conduziu a um crescimento e ramificação fracos. Ambos os explantes devem ser excluídos da análise.
Figura 1: Anlagen de Rim Metan�rico E11.5 Cultivado para 3 div e tratado com Ephrin B2 ou Clustre RecombinanteFc Humano como Controle. ( A ) Anlagenio metan�rico de rim foi dissecado a E11.5, cultivado durante 3 div, e corado com aglutinina biotinilada de Dolichorus biflorus e estreptavidina conjugada com Alexa488. Os explantes foram fotografados com um microscópio de epifluorescência de campo largo com um passo de excitação de 460-495 nm, um espelho dicromático de 505 nm, um passo de emissão de 510-550 nm e lentes de 20X Plan-Apochromat. A aplicação de EphrinB2 aglomerado recombinante (clEphrinB2) resultou em reduzida complexidade de ramificação e malformação das pontas de gemas uretericas (ponta de flecha). ( B ) O gráfico da esquerda mostra gerações de ramificação em clEphrinB2-tratados e explantes de controlo. A 4 ª geração de ramificação foi atingida em apenas 8% dos explantes tratados, em comparação com 35% dos explantes de controle. O número de pontos finais por ramo (gráfico médio) e endpoints por área (gráfico à direita) foi reduzido (pontos finais por ramo CNT, 2,1 ± 0,09, clEphrinB2, 1,7± 0,08, P = 0,007 **; Pontos finais por milímetro quadrado: CNT, 31 ± 0,01; ClEphrinB2, 27 ± 0,02; P = 0,04 *; N = 23). Os dados são apresentados como a média ± SEM e foi utilizado um teste t de Student não emparelhado. Barra de escala = 100 um. Este número foi modificado de Peuckert et al. , 2016 3 . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Exemplos de dois anlágenos de rim metanéfricos E11.5 que foram danificados durante a dissecção, cultivados durante 3 div, e corados com aglutinina biotinilada de Dolichorus Biflorus e Streptavidina conjugada com Alexa488. ( A e B ) O dano do mesênquima resultou em crescimento pobre ou ausente e ramificação do botão ureteral,Desqualificando os explantes de uma análise posterior. ( A ) Explante renal metanéfrico após 3 div, com ausência de ramificação do botão ureteral. Apenas o primeiro ramo em T é visível. ( B ) Explante renal metanéfrico após 3 div, com fraca ramificação do botão ureteral. Barra de escala = 60 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este manuscrito descreve um método para isolar o desenvolvimento de metanéfric anlagen do embrião de rato e para cultivar os rudimentos de órgãos. Este método é uma técnica padrão, como desenvolvido por Grobstein 8 e Saxen 9 , 10 , e foi adaptado e modificado por muitos outros 11 , 12 . O sucesso do método depende principalmente da duração da dissecção, como sobrevivência do explante e diminuição do potencial indutivo com tempo de dissecção prolongado. Cuidado também deve ser tomado para não danificar o mesênquima quando a limpeza do rudimento do rim do tecido circundante. O dano do mesênquima metanéfrico é muitas vezes a razão para o crescimento fraco dos explantes. No entanto, a velocidade de dissecção e as habilidades motoras finas melhoram muito com a prática.
O meio quimicamente definido no protocolo apresentado é comumente usado paraContendo soro em cultura de células primárias e in vitro e contém uma mistura 1: 1 (v / v) de DMEM e F-12 de Ham, suplementada com insulina-transferrina-selénio para suportar o crescimento e a sobrevivência dos explantes. A captação de glicose e aminoácidos, a lipogénese e o transporte intracelular são facilitados pela insulina. O selênio, um co-fator para a glutationa peroxidase, funciona como antioxidante. Transferrina é um transportador de ferro e ajuda a proteger contra os radicais de oxigênio. Na cultura de rim embrionário, a adição de transferrina ao meio aumenta a diferenciação dos túbulos ea incorporação de timidina de uma forma dependente da dose, com um efeito máximo em torno de 50 μg / mL 13 . Por conseguinte, a holo-transferrina humana é adicionalmente suplementada no meio, resultando numa concentração final de transferrina de cerca de 55 μg / mL. Muitos protocolos, que utilizam uma composição mais simples mas quimicamente menos definida, com o Meio Mínimo Essencial de Eagle(MEM) ou DMEM e 10% de soro ( isto é, soro de bovino fetal, FBS) também dão resultados muito satisfatórios 12 , 13 , 14 , 15 . No entanto, podem ocorrer variações entre lotes diferentes de FBS. Para evitar tais variações e para excluir a possível interferência dos factores de crescimento presentes no soro com a sinalização de Eph, foi escolhido meio isento de soro. A decisão de usar um meio sem soro depende da configuração experimental e da questão científica. As condi�es de cultura sem soro ser� particularmente necess�ias quando o objectivo final �a aplica�o terap�tica. A anfotericina B, o agente antifúngico incluído neste protocolo, pode ser omitida. O período de cultura no exemplo apresentado foi de 3 dias, mas os rudimentos de rim metanéfricos podem ser cultivados até 10 dias 15 . Em culturas superiores a 3 dias, o meio deve ser trocado a cada 48 h. O desenvolvimento de kidnOs rudimentos in vitro recapitulam in vivo a seqüência de agregados pré-tubulares, vesículas renais e corpos em forma de V e S. Após 3 dias in vitro , foram formadas estruturas tipo glomerular 15 , 16 . Em culturas mais longas, a área do explante aumenta ainda mais devido à continuação da ramificação do botão ureteral. Com cerca de 5 dias de cultura, os nefrões têm segregação nos segmentos distal, médio e proximal 16 .
Apesar da relativa facilidade e eficiência de custo da técnica, permitindo aplicações versáteis, algumas considerações devem ser mantidas em mente ao planejar experimentos e interpretar resultados. Devido à matriz extracelular e membrana basal presente nos órgãos cultivados, a difusão de agentes exógenos e partículas é limitada 17 . Além disso, as condições de cultura artificial e manipulações podem causar alterações no metabolismoIsmo do tecido e comportamento celular que difere da situação in vivo 15 , 18 . Mais notavelmente, os explantes não têm fornecimento de sangue, e os glomérulos são avasculares; Embora os nephrons se tornem segmentados, zonation e a formação de um medulla e os laços de Henle estão faltando 14 , 19 . Assim, o espectro de aplicação da cultura de rim embrionário é limitado às estruturas tubulares, à sua morfologia de ramificação e às interacções mesenquimal-epiteliais. Consequentemente, as questões científicas que visam a função renal não podem ser abordadas.
Modificações recentes do método de cultura em que rudimentos de rim são cultivadas em vidro revestido em um desenvolvimento organotípico de baixo volume habilitado mesmo até zonação cortico-medular com laços estendidos de Henle 15 . Vale ressaltar também que, recentemente, um método para armazenar e preservarRins embrionários foi publicado. Este método permite o transporte de rudimentos de rim embrionário em E11.5 por vários dias e permite que eles sejam cultivados mais tarde. Isto é especialmente de interesse em colaborações 20 . A natureza da cultura de rudimento de rim completo permite uma variedade de adaptações metodológicas, incluindo técnicas de imagem avançadas. Para evitar movimentos perturbadores durante a imagem ao vivo, recomenda-se substituir o flutuante por um filtro fixo, como um inserto transwell. A tecnologia apresentada foi mesmo expandida para cultura de blocos de tecido contendo todo o tracto urogenital. Utilizando esta cultura expandida, a inserção do ureter na bexiga pode ser investigada 21 .
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem a Leif Oxburgh e Derek Adams por compartilhar generosamente seus conhecimentos, Leif Oxburgh pelos comentários úteis sobre o manuscrito, e Stefan Wölfl e Ulrike Müller pelo seu apoio técnico e Saskia Schmitteckert, Julia Gobbert, Sascha Weyer e Viola Mayer pela ajuda na Laboratório Este trabalho foi apoiado por Desenvolvimento, A Empresa de Biólogos (a CP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 21331020 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140148 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14040117 | use for dissection |
| holo-Transferrin human | Sigma-Aldrich | T0665 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100x) | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Amphotericin B solution | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Thimerosal | Sigma-Aldrich | T5125 | |
| Propyl gallate | Sigma-Aldrich | 2370 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Biotinylated Dolichorus Biflorus Agglutinin | Vector Laboratories | B-1035 | |
| Alexa488 conjugated Streptavidin | Jackson Immuno Research | 016-540-084 | |
| Recombinant Mouse Ephrin-B2 Fc Chimera Protein, CF | R&D Systems | 496-EB | |
| Recombinant Human IgG1 Fc, CF | R&D Systems | 110-HG-100 | |
| Goat Anti-Human IgG Fc Antibody | R&D Systems | G-102-C | |
| Phosphate buffered saline tablets | Sigma-Aldrich | P4417 | use for fixation and immunostaining |
| Dumont #5, biologie tips, INOX, 11 cm |
agnthos.se | 0208-5-PS | 2 pairs of forceps are needed |
| Iris scissors, straight, 12 cm | agnthos.se | 03-320-120 | |
| Dressing Forceps, straight, delicate, 13 cm |
agnthos.se | 08-032-130 | |
| Petri dishes Nunclo Delta treated | Thermo Fisher Scientific | 150679 | |
| TMTP01300 Isopore Membrane Filter, polycarbonate, Hydrophilic, 5.0 µm, 13 mm, white, plain | MerckMillipore | TMTP01300 | |
| Nunclon Multidishes 4 wells, flat bottom |
Sigma-Aldrich | D6789-1CS | |
| Microscope cover glass 24 x 50 mm thickn. No.1.5H 0.17+/-0.005 mm | nordicbiolabs | 107222 | |
| Cover glasses No.1.5, 18 mm x 18 mm | nordicbiolabs | 102032 | |
| Slides ~76 x 26 x 1, 1/2-w. ground plain | nordicbiolabs | 1030418 | |
| VWR Razor Blades | VWR | 55411-055 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430828 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430055 | |
| Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 113V, creped | Sigma-Aldrich | WHA1213125 | |
| Fixed stage research mircoscope | Olympus | BX61WI | |
| Black 6 inbred mice, male, C57BL/6NTac | Taconic | B6-M | |
| Black 6 inbred mice,female, C57BL/6NTac | Taconic | B6-F | |
| Greenough Stereo Microscope | Leica | Leica S6 E |
References
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