Summary
Este protocolo describe un método para aislar y cultivar rudimentos metanefricos de embriones de ratón.
Abstract
El objetivo de este protocolo es describir un método para la disección, aislamiento y cultivo de rutinas metanefricas de ratón.
Durante el desarrollo del riñón de los mamíferos, los dos tejidos progenitores, el brote ureteral y el mesénquima metanéfrico, se comunican y inducen recíprocamente mecanismos celulares para formar eventualmente el sistema colector y los nefrones del riñón. A medida que los embriones de mamíferos crecen intrauterinos y por lo tanto son inaccesibles para el observador, se ha desarrollado un cultivo de órganos. Con este método, es posible estudiar las interacciones epiteliales-mesenquimales y el comportamiento celular durante la organogénesis renal. Además, se puede investigar el origen de las malformaciones congénitas del riñón y del tracto urogenital. Después de una disección cuidadosa, los rudimentos metanefricos se transfieren a un filtro que flota sobre el medio de cultivo y puede mantenerse en una incubadora de cultivo celular durante varios días. Sin embargo, hay que tener en cuenta que las condiciones sonArtificial y podría influir en el metabolismo en el tejido. Además, la penetración de sustancias de ensayo podría estar limitada debido a la matriz extracelular y la membrana basal presentes en el explante.
Una ventaja principal de la cultura de órganos es que el experimentador puede obtener acceso directo al órgano. Esta tecnología es barata, sencilla y permite un gran número de modificaciones, como la adición de sustancias biológicamente activas, el estudio de variantes genéticas y la aplicación de técnicas de imagen avanzada.
Protocol
Los ratones se mantuvieron de acuerdo con la normativa sueca y la legislación de la Unión Europea (2010/63 / UE). Todos los procedimientos se realizaron siguiendo las directrices del Comité Sueco de Ética (permisos C79 / 9, C248 / 11, y C135 / 14). El Regierungspräsidium Karlsruhe y los Oficiales de Bienestar Animal de la Universidad de Heidelberg han aprobado procedimientos en la Universidad de Heidelberg sobre animales.
1. Preparación de reactivos y materiales para la cultura
NOTA: Use una campana de flujo laminar para minimizar la contaminación.
- En el día de la disección, la Fc humana previa a la agrupación o la proteína de efrina quimérica recombinante se fusionaron a Fc humano mezclándola con anticuerpos de cabra Fc antihumanos en una proporción molar de 1: 5 en solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS). Incubar durante 1 h a 37 ° C 5 .
- Preparar el medio de cultivo suplementando Dulbecco's Modified Eagle Medium: NutrientMezcla F-12 (DMEM / F12) con 1% de penicilina / estreptomicina (v / v), 1% de glutamina (v / v), 1% de insulina-transferrina-selenio (v / v) Transferrina y 1,5 μg / ml de anfotericina.
NOTA: 10 ml de medio son suficientes para 16 embriones. - Añada una solución concentrada de efrina recombinante a una concentración final de 20 μg / ml al medio de cultivo. Utilice Fc humano agrupado como control.
- Preparar las placas de cultivo añadiendo 500 μl de medio de cultivo a cada pocillo de una placa estéril de 4 pocillos de poliestireno de fondo plano sin recubrimiento.
- Usando fórceps estériles, coloque cuidadosamente un filtro de membrana de policarbonato con un tamaño de poro de 5 μm por pocillo en la parte superior del medio. Transferir la placa preparada a la incubadora (37 ° C / 5% CO 2 ). Asegúrese de que el filtro permanezca seco en la superficie superior y flote.
NOTA: Un filtro es suficiente para dos anlagen de riñón. - Utilizando una cuchilla de afeitar, corte aproximadamente 30 puntas de pipeta (volumen: 100 μl) aprox.Y 1 mm de la punta para dar lugar a una abertura más amplia. Coloque las puntas de nuevo en un rack pipette-tip.
2. Disección de Rudimentos Metanefricos en E11.5
- Sacrifique a un ratón embarazado cronometrado en E11.5 por dislocación cervical (o usando un método aprobado por el comité de ética local).
- Retirar el útero y los embriones, según lo descrito por Brown et al 6 . A partir de este punto, trabajar bajo un microscopio de disección.
- Usando la pinza de relojería No. 5, corte el embrión directamente debajo de las patas delanteras. Utilice un plato de petri fresco para cada embrión. Quitar las piernas y la cola del embrión. Para ello, agarra el tejido que se va a quitar con un par de fórceps relojero nº 5 y usa las puntas de un segundo par para cortar.
- Para retirar la masa del órgano ventral, use las puntas de un par de pinzas para abrir lateralmente la pared del cuerpo del embrión en una dirección rostral a caudal.
- Corte superficialmente, paralelo a tLa aorta dorsal. Utilice la aorta dorsal llena de sangre y por lo tanto visible para la orientación. Separar cuidadosamente la parte ventral de la pared del cuerpo de la parte dorsal usando las puntas de la pinza cerrada y voltear el embrión. Corte la pared del cuerpo lateralmente en una dirección rostral a caudal y usando la aorta dorsal para la orientación, como para el lado anterior.
- Una vez que la pared del cuerpo ventral se ha separado del cuerpo dorsal, agárralo con un par de fórceps y tire con cuidado para quitarlo, junto con la masa del órgano.
NOTA: El metanéfrico anlagen suele permanecer unido a la pared del cuerpo dorsal. Son estructuras ovales de ~ 200 μm de largo situadas al nivel de las extremidades posteriores. - Sujete la pared del cuerpo dorsal con un par de fórceps, con el lado ventral hacia arriba. Utilizando el otro par de pinzas, agarrar la aorta dorsal en su extremo rostral y cuidadosamente pelar la aorta dorsal de la pared del cuerpo dorsal.
NOTA: Ambos riñones metanefricos generalmente se mantienen unidosA la aorta dorsal. - Usando un par de fórceps, corte rostralmente al riñón anlagen para eliminar la aorta. Luego, cuidadosamente separar los dos anlagen renal utilizando las puntas de la pinza.
- Cuidadosamente quitar el tejido no deseado del riñón anlagen con las puntas de la pinza. Tenga cuidado de no dañar el mesénquima, ya que el daño puede resultar en un pobre crecimiento y la exclusión del explante de un análisis posterior.
- Transferir el anlagen renal por separado con una pipeta de microlitros y una punta de pipeta abierta en 10 μL de PBS al filtro de membrana de policarbonato en una placa de 4 pocillos.
NOTA: Debido a la tensión superficial, el explante se cubrirá con una fina capa de medio. Un filtro es suficiente para dos anlagen renal.- Coloque cada uno de los dos anlagen renal en el centro de cada mitad respectiva del filtro. Transferir la placa de nuevo a la incubadora a 37 ° C / 5% de CO 2 . Dejar la placa en la incubadora hasta que el ron metanefricImentes del siguiente embrión están listos para ser colocados en el filtro.
- Repita los pasos 2.3-2.9.1 para cada embrión.
NOTA: Con cierta práctica, el procedimiento de disección tomará aproximadamente 5 min por embrión. - Incubar el riñón anlagen durante 3 días a 37 ° C / 5% de CO 2 .
3. Preparación de reactivos para fijación y tinción
- Para preparar paraformaldehído (PFA) al 4% en PBS sin calcio y magnesio (p / v), disolver el PFA a 60 ° C en PBS, agitando continuamente. Enfriar a temperatura ambiente y utilizar un filtro de papel para eliminar las partículas restantes. Alícuota y mantener a 4 ° C para su uso inmediato o congelar para el almacenamiento a largo plazo.
PRECAUCIÓN: La PFA es tóxica. Use el equipo de protección personal especificado en las normas de seguridad locales y trabaje en una campana extractora de humos. Deseche los desechos siguiendo las pautas institucionales y usando contenedores de desecho designados. - Para preparar la solución de permeabilización, diluir Triton X-100En PBS sin calcio y magnesio hasta 0,3% (v / v).
- Para preparar la solución de bloqueo, añadir 5% (v / v) de suero de cabra y 0,1% Triton X-100 a PBS sin calcio y magnesio. Añadir azida sódica hasta una concentración final de 0,02% (p / v). Almacenar a 4 ° C.
PRECAUCIÓN: La azida sódica es tóxica. Manipular la azida sódica de acuerdo con las normas locales de seguridad y protección del medio ambiente.
NOTA: Cuando se usan anticuerpos para la tinción, use suero al 5% de la especie de la que se derivó el anticuerpo secundario para hacer la solución de bloqueo. - Diluir la aglutinina de Dolichorus biflorus biotinilada 1: 200 en solución de bloqueo. Diluir Alexa488-streptavidin conjugado 1: 200 en solución de bloqueo.
- Para preparar un medio de incrustación listo para usar (véase la tabla de materiales), añadir 0,1 g de mucoadhesivo / ml a base de alcohol polivinílico soluble en agua a glicerol al 25% (p / v) en Tris-HCl 0,1 M (pH 8,5) . Calentar a 50 ° C bajo agitación continua durante 1 h, enfriar y ajustar el pH a 8,0-8,5 usando 1M de NaOH. Evitar mayores concentraciones de NaOH. Añadir 100 μg / ml de N-propilgalato y timerosal hasta una concentración final de 0,02% (p / v). Se agita durante 30 minutos a temperatura ambiente.
PRECAUCIÓN: El timerosal es tóxico. Manipularlo de acuerdo con las normas locales de seguridad y protección del medio ambiente.- Llenar el medio de inclusión en tubos de 50 ml, equilibrar el rotor y centrifugar a 3.200 xg ya temperatura ambiente durante 10 min. Decantar la solución transparente en tubos de 15 mL y desechar el gránulo. Alícuota y almacenar a -20 ° C durante varias semanas. Una vez descongelado, mantener la solución a 4 ° C. Caliente a ~ 30 ° C inmediatamente antes de usar.
- Prepare tantos portaobjetos de vidrio como los filtros con explantes deben montarse. Para ello, pegue dos pequeños cubreobjetos, 18 x 18 mm, a cada lado de la diapositiva de vidrio con adhesivo instantáneo, Deje un espacio de ~ 15 mm para el filtro entre.
4. Fijación y tinción
- Después de un período de cultivo de 3Días in vitro (div), retirar las placas de la incubadora y aspirar cuidadosamente el medio de cultivo de cada pocillo usando una micropipeta. Asegúrese de no tocar el filtro y mantenga la punta abierta hacia la pared del pozo.
- Añadir 500 μl de PFA al 4% / PBS a cada pocillo. Los filtros flotarán sobre el fijador. Usando una micropipeta, agregue cuidadosamente el fijador PFA gota a gota para sumergir los filtros. Incubar a temperatura ambiente durante 30 min.
NOTA: Para todos los pasos siguientes, se debe tener cuidado de no lavar los explantes del filtro. Mantenga la abertura de la punta de la pipeta hacia la pared del pozo. - Retire el PFA y enjuague dos veces con 500 μl de PBS, sumergiendo el filtro. Añadir 500 μl de solución de permeabilización a cada pocillo e incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
- Enjuagar dos veces con 500 μL de PBS y añadir 500 μL de solución de bloqueo a cada pocillo. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
- Reemplace la solución de bloqueo por250 μl de aglutinina biotinilada Dolichorus biflorus diluida 1: 200 en solución de bloqueo e incubar a 4 ° C durante 24 h.
- Retire la solución de aglutinina de Dolichorus biflorus y enjuague dos veces con 500 μl de PBS por pocillo.
- Añadir 250 μL de estreptavidina conjugada con Alexa488 diluida 1: 200 en solución de bloqueo e incubar a 4 ° C durante 24 h. Alternativamente, incubar a temperatura ambiente durante 2 h.
NOTA: Se consigue una mejor relación señal / ruido cuando se incuba a 4 ° C. - Enjuague dos veces con 500 μl de PBS por pocillo. Usando fórceps, transfiera los filtros a las diapositivas de vidrio preparadas, con los explantes hacia arriba. Montar con ~ 50-100 μl de medio de incrustación. Cubrir con cubreobjetos No. 1.5 de 60 mm de largo. Dejar que la solución del medio de incrustación se solidifique durante 2 h a temperatura ambiente en la oscuridad. Proceda a la formación de imágenes o almacene las diapositivas, envueltas en papel de aluminio, a 4 ° C hasta que esté listo para la imagen.
- Imagen con un microscopio de epifluorescencia de campo ancho 7 </ Sup> acoplado a una lámpara de Hg y utilizar una unidad de espejo para la excitación azul (paso de banda de excitación, 460 - 495 nm, espejo dicromático, 505 nm y paso de banda de emisión, 510 - 550 nm) y 20X Plan - Apochromat, 0,75 numérico abertura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El anlagen renal metanéfrico se obtuvo a partir de ratones endocrinos Black-6 preñados a E11.5 y se cultivaron. Después de 3 días, la yema ureterica se había ramificado hasta 5 veces, dando como resultado una ramificación de la yema ureterica inicialmente en forma de T. Se fotografió cada explante y se cuantificaron los números de segmentos y puntos finales para determinar las generaciones de ramificación y para calcular el número de puntos finales por rama ( Figura 1 ). ( Figura 1b ), con lo que se redujo el número de endpoints por rama y los puntos finales por mm 2 en la muestra Explantes tratados con Ephrin B2 en racimo.Además, un tercio de los explantes tenían una morfología inusual en las puntas de la yema ureteral ( Figura 1 ) Estos resultados sugieren que EphrinB2 podría tener un efecto restrictivoEn el proceso de ramificación del brote ureteric, muy probablemente activando EphA4 y señalización delantera de EphB2.
Para un experimento exitoso, es crítico que el mesénquima metanéfrico no se dañe durante la disección. Cualquier lesión del mesénquima disminuye el potencial inductivo, conduce a la reducción o ausencia de la ramificación del brote ureteral, y podría ser una fuente de sesgo. El ejemplo de la figura 2A muestra un explante donde el mesénquima está casi desaparecido. El brote ureteral no se ramifica más allá de la etapa T. La Figura 2B muestra un ejemplo en el que el daño del mesénquima metanéfrico condujo a un crecimiento y ramificación deficientes. Ambos explantes deben ser excluidos del análisis.
Figura 1: Anlagen de riñón metanefrico E11.5 cultivado para 3 div y tratado con EphrinB2 recombinante agrupada o ClustLa Fc humana como control. ( A ) Se diseccionaron anafetas de riñón metanefricos a E11.5, se cultivaron durante 3 div, y se tiñeron con aglutinina biotinilada de Dolichorus biflorus y estreptavidina conjugada con Alexa488. Los explantes se fotografiaron con un microscopio de epifluorescencia de campo ancho con un paso de banda de excitación de 460-495 nm, un espejo dicromatico de 505 nm, un paso de banda de 510-550 nm y lentes 20x Plan-Apochromat. La aplicación de cluster EphrinB2 recombinante (clEphrinB2) dio lugar a la reducción de la complejidad de ramificación y la malformación de las puntas de uretero brote (punta de flecha). ( B ) El gráfico de la izquierda muestra las generaciones de ramificación en clEphrinB2-tratados y explantes de control. La 4 ª generación de ramificación se alcanzó en sólo el 8% de los explantes tratados, en comparación con el 35% de los explantes de control. Se redujo el número de puntos finales por rama (gráfico medio) y puntos finales por área (gráfico de la derecha) (puntos finales por rama CNT, 2,1 ± 0,09, clEphrinB2, 1,7 Pm 0,08, P = 0,007 **; Puntos finales por milímetro cuadrado: CNT, 31 ± 0,01; ClEphrinB2, 27 pm 0,02; P = 0,04 *; N = 23). Los datos se presentan como la media ± SEM y se usó una prueba t de Student no emparejada. Barra de escala = 100 μm. Esta figura se ha modificado de Peuckert et al. , 2016 3 . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Ejemplos de dos anlágenos de riñón metanefricos E11.5 que se dañaron durante la disección, se cultivaron durante 3 div, y se tiñeron con aglutinina biotinilada de Dolichorus Biflorus y estreptavidina conjugada con Alexa488. ( A y B ) El daño del mesénquima dio como resultado un crecimiento pobre o ausente y una ramificación del brote ureteral,Descalificando los explantes de un análisis posterior. ( A ) explante de riñón metanéfrico después de 3 div, con ausencia de ramificación del brote ureteral. Sólo la primera rama en T es visible. ( B ) explante de riñón metanéfrico después de 3 div, con mala ramificación del brote ureteral. Barra de escala = 60 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este manuscrito describe un método para aislar el desarrollo de metanfric anlagen del embrión de ratón y para cultivar los órganos rudiments. Este método es una técnica estándar, desarrollada por Grobstein 8 y Saxén 9 , 10 , y fue adaptada y modificada por muchos otros 11 , 12 . El éxito del método depende principalmente de la duración de la disección, ya que la supervivencia del explante y el potencial inductivo disminuyen con el tiempo de disección prolongado. También se debe tener cuidado de no dañar el mesénquima cuando se limpia el rudimento del riñón del tejido circundante. El daño del mesénquima metanéfrico es a menudo la razón para el crecimiento pobre de los explantes. Sin embargo, la velocidad de disección y las habilidades motoras finas mejoran enormemente con la práctica.
El medio químicamente definido en el protocolo presentado se utiliza comúnmente para reemplazar elConteniendo suero en células primarias y cultivo de órganos in vitro y contiene una mezcla 1: 1 (v / v) de DMEM y F-12 de Ham, suplementada con insulina-transferrina-selenio para apoyar el crecimiento y la supervivencia de los explantes. La absorción de glucosa y aminoácidos, la lipogénesis y el transporte intracelular son facilitados por la insulina. El selenio, un cofactor para la glutatión peroxidasa, funciona como antioxidante. La transferrina es un soporte de hierro y ayuda a proteger contra los radicales de oxígeno. En el cultivo de riñón embrionario, la adición de transferrina al medio aumenta la diferenciación de los túbulos y la incorporación de timidina de una manera dependiente de la dosis, con un efecto máximo alrededor de 50 μg / mL 13 . Por lo tanto, la holo-transferrina humana se suplementa adicionalmente en el medio, dando como resultado una concentración final de transferrina de aproximadamente 55 μg / ml. Muchos protocolos, que utilizan una composición más simple, pero químicamente menos definida, con el medio esencial mínimo de Eagle(MEM) o DMEM y suero al 10% ( es decir, suero bovino fetal, FBS) también dan resultados muy satisfactorios 12 , 13 , 14 , 15 . Sin embargo, pueden producirse variaciones entre diferentes lotes de FBS. Para evitar tales variaciones y excluir la posible interferencia de los factores de crecimiento presentes en el suero con señalización Eph, se eligió el medio exento de suero. La decisión de utilizar un medio exento de suero depende de la configuración experimental y de la cuestión científica. Las condiciones de cultivo libres de suero serían particularmente necesarias cuando el objetivo final es la aplicación terapéutica. La anfotericina B, el agente antifúngico incluido en este protocolo, puede omitirse. El período de cultivo en el ejemplo presentado fue de 3 días, pero los rudimentos metanéfricos de riñón se pueden cultivar hasta 10 días 15 . En cultivos superiores a 3 días, el medio debe ser cambiado cada 48 h. El desarrollo de kidnLos rudimentos in vitro recapitulan in vitro la secuencia in vivo de agregados pre-tubulares, vesículas renales y cuerpos con forma de coma y S. Después de 3 días in vitro , se han formado estructuras tipo glomerular 15 , 16 . En cultivos más largos, el área del explante aumenta aún más debido a la ramificación continuada de la yema ureteral. Alrededor de 5 días de cultivo, los nefrones se han segregado en segmentos distal, medio y proximal 16 .
A pesar de la relativa facilidad y rentabilidad de la técnica, que permite aplicaciones versátiles, algunas consideraciones deben tenerse en cuenta al planificar los experimentos e interpretar los resultados. Debido a la matriz extracelular y membrana basal presente en los órganos cultivados, la difusión de agentes exógenos y partículas es limitada [ 17] . Además, las condiciones de cultivo artificial y las manipulaciones pueden causar cambios en el metabolismoIsmo del tejido, y comportamiento celular que difiere de la situación in vivo 15 , 18 . Más notablemente, los explantes carecen de suministro de sangre, y los glomérulos son avasculares; Aunque los nefrones se segmentan, la zonación y la formación de una médula y lazos de Henle faltan 14 , 19 . Por lo tanto, el espectro de aplicación del cultivo de riñón embrionario se limita a las estructuras tubulares, su morfología de ramificación, y las interacciones mesenquimales-epiteliales. En consecuencia, no se pueden abordar las cuestiones científicas dirigidas a la función renal.
Las modificaciones recientes del método de cultivo en el que se desarrollan rudimentos renales en vidrio revestido en un desarrollo organotípico de bajo volumen habilitado incluso hasta zonación cortico-medular con bucles extendidos de Henle 15 . También vale la pena señalar que, recientemente, un método para almacenar y preservarRiñones embrionarios. Este método permite el transporte de rudimentos embrionarios de riñón a E11.5 durante varios días y permite que se cultiven más tarde. Esto es especialmente de interés en las colaboraciones [ 20] . La naturaleza de la cultura de rudimiento de riñón entero permite una variedad de adaptaciones metodológicas, incluyendo técnicas avanzadas de formación de imágenes. Para evitar movimientos perturbadores durante la imagen en vivo, se recomienda reemplazar el flotante con un filtro fijo, como una inserción transwell. La tecnología presentada incluso se ha expandido para cultivar bloques de tejido que contienen todo el tracto urogenital. Usando este cultivo expandido, la inserción de uréter en la vejiga puede ser investigado [ 21] .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Leif Oxburgh y Derek Adams por compartir generosamente sus conocimientos, Leif Oxburgh por los útiles comentarios sobre el manuscrito, y Stefan Wölfl y Ulrike Müller por su apoyo técnico y Saskia Schmitteckert, Julia Gobbert, Sascha Weyer y Viola Mayer por su ayuda en el laboratorio. Este trabajo fue apoyado por Desarrollo, La Empresa de Biólogos (a CP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 21331020 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140148 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14040117 | use for dissection |
| holo-Transferrin human | Sigma-Aldrich | T0665 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100x) | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Amphotericin B solution | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Thimerosal | Sigma-Aldrich | T5125 | |
| Propyl gallate | Sigma-Aldrich | 2370 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Biotinylated Dolichorus Biflorus Agglutinin | Vector Laboratories | B-1035 | |
| Alexa488 conjugated Streptavidin | Jackson Immuno Research | 016-540-084 | |
| Recombinant Mouse Ephrin-B2 Fc Chimera Protein, CF | R&D Systems | 496-EB | |
| Recombinant Human IgG1 Fc, CF | R&D Systems | 110-HG-100 | |
| Goat Anti-Human IgG Fc Antibody | R&D Systems | G-102-C | |
| Phosphate buffered saline tablets | Sigma-Aldrich | P4417 | use for fixation and immunostaining |
| Dumont #5, biologie tips, INOX, 11 cm |
agnthos.se | 0208-5-PS | 2 pairs of forceps are needed |
| Iris scissors, straight, 12 cm | agnthos.se | 03-320-120 | |
| Dressing Forceps, straight, delicate, 13 cm |
agnthos.se | 08-032-130 | |
| Petri dishes Nunclo Delta treated | Thermo Fisher Scientific | 150679 | |
| TMTP01300 Isopore Membrane Filter, polycarbonate, Hydrophilic, 5.0 µm, 13 mm, white, plain | MerckMillipore | TMTP01300 | |
| Nunclon Multidishes 4 wells, flat bottom |
Sigma-Aldrich | D6789-1CS | |
| Microscope cover glass 24 x 50 mm thickn. No.1.5H 0.17+/-0.005 mm | nordicbiolabs | 107222 | |
| Cover glasses No.1.5, 18 mm x 18 mm | nordicbiolabs | 102032 | |
| Slides ~76 x 26 x 1, 1/2-w. ground plain | nordicbiolabs | 1030418 | |
| VWR Razor Blades | VWR | 55411-055 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430828 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430055 | |
| Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 113V, creped | Sigma-Aldrich | WHA1213125 | |
| Fixed stage research mircoscope | Olympus | BX61WI | |
| Black 6 inbred mice, male, C57BL/6NTac | Taconic | B6-M | |
| Black 6 inbred mice,female, C57BL/6NTac | Taconic | B6-F | |
| Greenough Stereo Microscope | Leica | Leica S6 E |
References
- Saxén, L. Organogenesis of the kidney. Developmental and Cell Biology Series. 19, Cambridge University Press. (1987).
- Lindström, N. O., et al. Integrated β-catenin, BMP, PTEN, and Notch signalling patterns the nephron. eLife. 4, e04000 (2015).
- Peuckert, C., et al. Multimodal Eph/Ephrin signaling controls several phases of urogenital development. Kidney Int. 90 (2), 373-388 (2016).
- Pasquale, E. B. Eph receptor signalling casts a wide net on cell behaviour. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (6), 462-475 (2005).
- Bonanomi, D., et al. Ret Is a Multifunctional Coreceptor that Integrates Diffusible- and Contact-Axon Guidance Signals. Cell. 148 (2), 568-582 (2012).
- Brown, A. C., et al. Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney. J Vis Exp. (50), e2555 (2011).
- Olympus Support. , Available from: http://www.olympusamerica.com/cpg_section/cpg_archived_product_details.asp?id=817 (2016).
- Grobstein, C. Inductive interaction in the development of the mouse metanephros. J Exp Zool. 130, 319-340 (1955).
- Saxén, L., Toivonen, S. Primary Embryonic Induction. , Academic Press. London. (1962).
- Saxén, L., Koskimies, O., Lahti, A., Miettinen, H., Rapola, J., Wartiovaara, J. Differentiation of kidney mesenchyme in an experimental model system. Adv Morphog. 7, 251-293 (1968).
- Dudley, A. T., Godin, R. E., Robertson, E. J. Interaction between FGF and BMP signaling pathways regulates development of metanephric mesenchyme. Genes Dev. 13, 1601-1613 (1999).
- Perälä, N., et al. Sema4C-Plexin B2 signalling modulates ureteric branching in developing kidney. Differentiation. 81 (2), 81-91 (2011).
- Thesleff, I., Ekblom, P. Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney. J Embryol exp Morph. 82, 147-161 (1984).
- Watanabe, T., Costantini, F. Real-time analysis of ureteric bud branching morphogenesis. Dev Biol. 271, 98-108 (2004).
- Sebinger, D. D. R., Unbekandt, M., Ganeva, V. V., Ofenbauer, A., Werner, C., Davies, J. A. A Novel, Low-Volume Method for Organ Culture of Embryonic Kidneys That Allows Development of Cortico-Medullary Anatomical Organization. PLoS One. 5 (5), e10550 (2010).
- Ekblom, P., Miettinen, A., Virtanen, I., Wahlström, T., Dawnay, A., Saxén, L. In vitro segregation of the metanephric nephron. Dev Biol. 84 (1), 88-95 (1981).
- Davies, J. A., Unbekandt, M. siRNA-mediated RNA interference in embryonic kidney organ culture. Methods Mol Biol. 886, 295-303 (2012).
- Saxén, L., Lehtonen, E. Embryonic kidney in organ culture. Differentiation. 36 (1), 2-11 (1987).
- Bard, J. B. L. The development of the mouse kidney embryogenesis writ small. Curr Opin Genet Dev. 2, 589-595 (1992).
- Davies, J. A. A method for cold storage and transport of viable embryonic kidney rudiments. Kidney Int. 70 (11), 2031-2034 (2006).
- Batourina, E., et al. Distal ureter morphogenesis depends on epithelial cell remodeling mediated by vitamin A and Ret. Nat Genet. 32 (1), 109-115 (2002).
