Summary
このプロトコルは、細胞分化およびアフリカツメガエル胚発生の間にマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（MAPK）活性を調節するための光発生戦略を記載する。この方法は、哺乳動物細胞培養物およびアフリカツメガエル胚のような多細胞生きている生物において、高い空間的および時間的分解能を有するMAPKシグナル伝達経路の可逆的活性化を可能にする。
Abstract
キナーゼ活性は、細胞増殖、分化、移動、およびアポトーシスを含む多数の細胞機能にとって重要である。初期胚発生の間、キナーゼ活性は非常に動的であり、胚全体に広がっている。薬理学的アプローチおよび遺伝的アプローチは、キナーゼ活性をプローブするために一般的に使用される。残念なことに、これらの戦略を使用して優れた空間的および時間的解像度を達成することは困難です。さらに、生細胞および多細胞生物において可逆的様式でキナーゼ活性を制御することは実現可能ではない。そのような制限は、発達および分化の間のキナーゼ活性の定量的理解を達成するためのボトルネックのままである。この研究は、光活性化可能タンパク質シロイヌナズナクリプトクローム2（CRY2）およびクリプトクローム相互作用塩基性ヘリックスループヘリックス（CIBN）のN末端ドメインを含むバイシストロン系を利用する光発生戦略を提示する。リバーシマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）シグナル伝達経路の活性化は、生細胞における光媒介タンパク質転位を介して達成される。このアプローチは、哺乳類の細胞培養物および生きている脊椎動物の胚に適用することができる。このバイシストロン系は、類似の活性化機構を有する他のキナーゼの活性を制御するために一般化され、他のモデル系にも適用することができる。
Introduction
増殖因子は、増殖、分化、遊走、およびアポトーシスを含む広範囲の細胞機能に関与し、胚発生、老化および精神状態の調節1,2,3,4,5などの多くの生物学的事象において中心的な役割を果たす。 5 。多くの増殖因子は、複雑な細胞内シグナル伝達カスケードを介してシグナル伝達する。これらのシグナル伝達事象は、しばしば可逆的なタンパク質リン酸化によって正確に制御された様式で操作される6,7。従って、タンパク質リン酸化を担うプロテインキナーゼのシグナル伝達結果の理解は基本的に重要である。
異なる成長因子は、それらがdistを刺激するにもかかわらず、むしろ一般的な細胞内シグナル伝達ネットワークを介して作用するinct細胞応答8,9 。レセプターチロシンキナーゼの一般的な細胞内メディエーターには、Ras、Raf、細胞外シグナル調節キナーゼ（ERK）、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）/ ERKキナーゼ（MEK）、ホスホイノシチド3-キナーゼ（PI3K）、AktおよびホスホリパーゼCガンマ（PLCγ） 10,11 。シグナリングの多様性および特異性は、シグナル伝達活性の空間的および時間的調節に依存することが示唆されている12 。例えば、ラット褐色細胞腫細胞（PC12）において、細胞増殖をもたらす表皮成長因子（EGF）刺激は、ERK経路を一時的に活性化する9 。一方、細胞分化につながる神経成長因子（NGF）による刺激は、ERK経路を持続的に活性化させる9,13。培養rにおいて海馬ニューロンでは、脳由来神経栄養因子（BDNF）による一過性シグナル伝達が原発性神経突起伸長を促進するが、持続シグナル伝達は神経突起分岐の増加14につながる。初期胚発生の間、リン酸化されたERK活性は時間的に動的であり、胚6に広がっている。初期のアフリカツメガエル胚発生中の最近の遺伝子スクリーニングでは、下流の原発性増殖因子経路の2つのERKおよびAktシグナル伝達カスケードがステージ特異的活性化プロファイルを示すことが示された7 。したがって、キナーゼシグナル伝達結果の理解は、十分な分解能でキナーゼ活性の空間的および時間的特徴を調べることができるツールを必要とする。
開発中のシグナル伝達の動的性質を調べるための従来の実験的アプローチは、望ましい空間的および時間的解像度を欠く。例えば、薬理学的アプローチは、細胞または組織中のシグナル伝達を刺激または抑制するための生体分子または生体分子である。これらの小分子の拡散性は、その作用を特定の関心領域15に制限することを困難にする。遺伝的アプローチ（ 例えば、遺伝子導入、Cre-Loxシステム、または突然変異誘発）は、しばしば標的遺伝子発現またはタンパク質活性の不可逆的な活性化または抑制を導く16,17,18。 Tet-On / Tet-Offシステム19は、遺伝子転写の改善された時間的制御を提供するが、テトラサイクリンの拡散に依存するため、厳密な空間制御を欠いている。化学的に誘導されたタンパク質二量体化20または光未結合化21,22,23,24の最近の進展は、シグナリングネットワークの時間的制御を可能にする。しかしながら、空間制御は、ケージド化学物質の拡散性のために依然として困難である。
タンパク質 - タンパク質相互作用を制御するために光のパワーを利用する最近の出現するオプトジェネティックアプローチは、高い時空間精度および可逆性を有するシグナル伝達経路の調節を可能にする。ニューロンの発火を制御する初期の成功の直後に、遺伝子の転写、翻訳、細胞遊走、分化、およびアポトーシスなどの他の細胞プロセスを制御するためにオプトジェネティクスが拡張されている28,29,30,31,32,33 、 34 。 pを使った戦略（CRY2）タンパク質とクリプトクローム相互作用塩基性ヘリックスループヘリックス（CIBN）のN末端ドメインは、最近、哺乳動物細胞およびアフリカツメガエル胚のRaf1キナーゼ活性を制御するために開発された35 。 CRY2は、青色光刺激によりCIBNに結合し、CRY2 / CIBNタンパク質複合体は暗所で自発的に解離する。青色光は、CRY2補因子、フラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）を励起し、これはCRY2の構造変化およびその後のCIBNへの結合をもたらす。 CRY2 W374A突然変異体は光とは無関係にCIBNに結合するが、CRY2 D387A突然変異体は青色下でCIBNに結合しないが、CRY2の構成的に活性な（W374A）突然変異体およびフラビン欠損（D387A）突然変異体は、軽い刺激36,37 。私が記述した光発生系このプロトコールは、野生型CRY2およびCIBNを用いて、生存細胞におけるタンパク質転位置媒介性Raf1活性化を誘導する。 Raf1の膜動員がその活性を増強することが知られている38 。このシステムでは、タンデムCIBNモジュールが原形質膜に固定され、CRY2-mCherryがRaf1 35の N末端に融合される。青色光が存在しない場合、CRY2-mCherry-Raf1は細胞質にとどまり、Raf1は不活性である。青色光刺激は、CRY2-CIBN結合を誘導し、Raf1が活性化される原形質膜にRaf1を動員する。 Raf活性化は、Raf / MEK / ERKシグナル伝達カスケードを刺激する。 CRY2-およびCIBN-融合タンパク質の両方は、バイシストロン性の遺伝子系においてコードされる。この戦略は、Aktのような他のキナーゼを制御するために一般化することができ、その活性化状態は細胞39内のタンパク質転座によってもターンオンすることができる。この研究は、哺乳動物細胞培養におけるこの光発生戦略を実施するための詳細なプロトコールを提示するresおよび多細胞生物である。
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Protocol
動物研究は、イリノイ州研究所動物衛生管理委員会（IACUC）およびイリノイ大学動物資源学部（DAR）が定めたガイドラインに従って行われた。
1. BHK21哺乳動物細胞培養におけるタンパク質局在の光発生誘発
注：ステップ1.1-1.3は、典型的には短い作動距離を有する高倍率対物レンズ（ 例えば、 63Xまたは100X）で画像化するために細胞培養チャンバーを組み立てる方法を提供する。これらの目的は、イメージング基板として薄いガラスカバースリップ（ 例えば、 ＃1.5,170μmの厚さ）を必要とする。あるいは、ガラス底細胞培養皿/スライドを使用することができる。そのような場合、ステップ1.1-1.3はスキップすることができます。
- ガラスカバースリップのクリーニング
- カバースリップホルダーに30枚のガラスカバースリップを置きます。
- 600mLのプラスチックビーカーに、20gの洗剤と400mLの暖かい水道水を加えます。プラックマグネチックスターラーでビーカーに加え、すべての洗剤が溶解するまで攪拌する。ティッシュペーパーを使用してフォームを取り外します。
- 100mm×15mmペトリ皿の底を攪拌棒からのスペーサーおよびカバースリップホルダーの表面として使用する。洗浄プロセス中に適切な流れを維持するために、ペトリ皿に3-4の排水孔を作ってください。
- 排水穴を作るには、はんだこてを加熱し、換気フード内でプラスチックに焼き付けます。
注意：加熱されたはんだこてを素手で触れないでください。 - ビーカー内のペトリ皿上にカバースリップホルダーを置きます。室温で2時間〜一晩撹拌する。
- 500mLの脱イオン水で1000mLのビーカーで3回洗浄する。洗剤溶液は再使用することができます。
- 鉗子を使用して個々のカバースリップを拾います。カバースリップを190プルーフ（95％）エタノールに1分間浸します。
- カバースリップを滅菌フード内で乾燥させる。使用するまでカバースリップを滅菌プラスチック容器に入れて保管します。
- ポリ-L-リジン（PLL）コーティングされたカバースリップの作製
- ホウ酸1.24gと四ホウ酸二ナトリウム1.9gを400mLの水に溶解して0.1Mのホウ酸塩緩衝液を調製する。 10M NaOHでpHを8.5に調整する。
- PLLをボレート緩衝液に溶解して最終濃度を1mg / mLにする。 50 mLの滅菌遠心チューブに分注します。
- 10cmの組織培養皿に50mLのPLLコーティング溶液を加える。 PLL溶液を温めるために37℃のインキュベーターに皿を置きます。
- 滅菌フードでカバーガラス容器（ステップ1.1.8）を開きます。
- 洗浄したカバースリップを、組織培養皿内の予め加温したPLL溶液に1つずつ浸します。すべての表面を浸してください。
- 一晩37℃のCO 2インキュベーターにカバースリップを入れて皿を置きます。各coverslipを取り出し、滅菌カバースリップホルダーに置きます。オートクレーブした超純水（18.2MΩおよび＃183; cmの抵抗率）を滅菌フード内の1000mLビーカーに入れた。
- 滅菌フード内のカバースリップホルダー内でカバースリップを乾燥させる。使用するまでカバースリップを滅菌プラスチック容器に入れて保管します。
- ポリジメチルシロキサン（PDMS）細胞培養チャンバーの組み立て
- プラスチック容器内で、40gのPDMSベースを秤量し、4gの硬化剤を添加して、PDMSおよび硬化剤の10：1w / w比を達成する。ピペットチップで2分間攪拌してPDMS /硬化剤を混合する。あるいは、遠心ミキサーを使用してください。
- 鋳型として直径4インチのビーカーを使用して、アルミホイルのホルダーを作成します。アルミニウムホイルホルダーを15cmのペトリ皿に置きます。このアルミホイルホルダー内に4インチのシリコンウェーハを置きます。
- 混合したPDMS溶液をホルダーに注ぎます。薄いガラス棒を使用して、ウェーハのエッジに静かに触れてください。ウェーハの下に閉じ込められた気泡を取り除きます。
- 15cmのペトリ皿を真空チャンバーに挿入するPDMS溶液を脱気する。気泡が発生しなくなるまで、約20分間脱気を続ける。その間に、対流オーブンを65℃に予熱してください。
- 慎重に15cmペトリ皿をオーブンの中に置きます。 2時間インキュベートする。
- プレートをオーブンから取り出します。ガラスロッドを使用して、PDMSの端に穏やかに触れ、完全に架橋するようにします。そうでない場合は、PDMSがしっかりと固着しなくなるまで、長くインキュベートしてください。
- プレートからアルミニウム箔を取り出し、シリコンウェーハから剥がします。エッジから出発して、硬化したPDMSをシリコンウェーハから注意深く剥離する。
注意：ウェハを破損する可能性があるため、あまりにも大きな力をかけないでください。 - PDMSを20mm×30mmの長方形の片に切り、24mm×40mmのカバースリップにカミソリの刃をはめてください。
- チゼル状のブレードを使用して、各PDMSピースの中央から10 mm x 20 mmの長方形の開口部を切断します。
- 手順1.1で説明した洗剤プロトコルを使用してPDMSチャンバーを洗浄します。
- 清浄なフード内でPDMSチャンバを乾燥させる。アルミ箔で覆われたオートクレーブ可能な容器に乾燥チャンバーを置きます。
- 容器を重力（121℃、15psi）で30分間オートクレーブし、容器を室温で保存する。
- BHK21細胞の培養およびトランスフェクション
- BHK21細胞培養用の培地500 mLを、FBS50 mLと100×Penn-Strep-Glutamine（10,000 U / mLペニシリン、10 mg / mLストレプトマイシン、および29.2 mg / mL L -グルタミン）。 FBSの最終濃度が10％であることを確認する。
- 生存細胞イメージング用の非HEPES CO 2非依存性培地10mLを分注する。
注記：CO 2非依存性培地は、CO 2インキュベータなしで細胞増殖を支援し、大気条件下で細胞を撮像するのに理想的である。詳細については、材料リストを参照してください。 BHK21細胞系に加えて、他のタイプの哺乳動物細胞もまた、同様の結果。 - 1つのオートクレーブされた滅菌PDMSチャンバー（ステップ1.3）を滅菌フード内の滅菌PLL被覆カバースリップ（ステップ1.2）に置くことによって、細胞培養装置を組み立てる。
- 各デバイスを滅菌60 mmのペトリ皿に置きます。
- 0.25％トリプシン0.5 mLを使用して、12ウェル組織培養プレートの1つのウェルから細胞を剥がす。血球計算盤で細胞密度を数える。 200μLの細胞培養培地を用いて、チャンバー内に20,000のBHK21細胞（約10,000細胞/ cm 2 ）をプレートする。
- プラスミド調製キットでDNAプラスミドを調製します（材料リストを参照）。
注：CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaXの設計と機能は図1A - 1Bに示されています。 - 細胞プレーティングから24時間後、CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaXプラスミド50-100ngを製造者のプロトコールに従ってトランスフェクションする。
- トランスフェクションの3時間後、mエチジウムを新鮮な培養培地200μLに添加し（ステップ1.4.1）、培養物を37℃、5％CO 2インキュベーター中でインキュベートすることによって、細胞を一晩回復させる。
- 蛍光生細胞イメージング
- コンピュータ、光源、顕微鏡、カメラの電源を入れます。プロトコルの残りの部分については、共焦点蛍光顕微鏡（100倍の油浸対物レンズを備えています）を使用してください。
注：倒立落射蛍光顕微鏡を使用することもできます。 - 200μLのCO 2非依存性培地で細胞培養培地を交換する。
- 顕微鏡に細胞を置く前に、データ取得プロトコルを設定してください。光発生刺激には488 nm励起FITCチャンネルを使用します。トランスフェクトした細胞の位置を特定し、mCherry標識タンパク質の細胞局在を追跡するために、561 nm励起TRITCチャネルを使用します。
- FITCおよびTRITCチャンネルのゲインをそれぞれ120および200に設定します。 2.2のピクセル滞在時間を使用する1; sおよび512 x 512ピクセルのサイズ。
- 対物窓にパワーメータを近づけて、488 nm光のパワーを測定します。 CIBN-CRY2PHR会合を誘発するには、2μW（焦点で約10,000W / cm 2 ）の総出力で十分である。
- 5秒の間隔と2分間の合計取得時間でタイムスタンプの取得を設定します。
- 目的の窓に適切な屈折率整合材（浸漬油）を塗布する。位相コントラストモードを使用して、カバーガラス表面のセルに焦点を合わせます。
- 顕微鏡ステージを動かすことにより、561nmの光の下でトランスフェクションされた細胞を見つける。
注意：光活性化可能なタンパク質間の会合を活性化するので、このステップでは青色光を使用しないでください。 - トランスフェクションされた細胞が見つかると、データ取得を開始します。
注：正常にトランスフェクトされた細胞は、FITC（2CIBN-GFP-CaaX由来）およびTRITC（CRY2-mCherry-Raf1）チャネルの両方で蛍光を示すはずである（ 図1C-D - FITCおよびTRITCチャンネルの両方に一連のタイムスタンプ付き画像を記録する（ 図1D ）。
- CRY2-CIBNタンパク質複合体の自発的解離をプローブするために、Txredチャネル単独で20秒間、30秒間隔で別のタイムスタンプを記録する。
- データ解析のためにタイムスタンプ付きの画像を保存します。
- コンピュータ、光源、顕微鏡、カメラの電源を入れます。プロトコルの残りの部分については、共焦点蛍光顕微鏡（100倍の油浸対物レンズを備えています）を使用してください。
- 画像解析
- 画像40から強度を抽出することができる画像分析ソフトウェアを用いて画像を開く。
- 2つの代表的なスナップショットを選択してください：1つは青色光の露光前、もう1つは青色光の後の露光です。
- バックグラウンド、原形質膜、および細胞質にまたがる細胞を横切る線を描く。この線に沿って強度を投影します。値を保存し、それらをプロットして露光前後の差を比較します（ 図1D ）。
- タンパク質結合の動力学を分析するために、セレク細胞膜における1つの代表的な関心領域（ROI）、細胞質における1つのROI、およびバックグラウンドにおける1つのROIを含む。
- 画像スタックの原形質膜（I PM ）、細胞質（I CYT ）、およびバックグラウンド（I BKD ）の平均強度を取得する。
- 以下の式を使用して各画像の膜/細胞質ゾル強度の比を計算する：
- 比対時間をプロットし、CRY2-CIBN（ 図1E -F ）の結合動態または解離動態を決定する。
2. CO 2インキュベータにおける長期光刺激用LEDアレイの構築
注：実験設定の全体図は図2Aに示されています。
- 2つのパン生地に12個の青色LEDを挿入してLEDアレイを作ってください電流制限抵抗を接続します。
注：30 Vの電源では、4個のLEDを直列に接続することができ、電流制限抵抗によって輝度を制御することができます。 - ブレッドボードをアルミボックスに入れます。
注：アルミニウムボックスの高さは2インチにする必要があります。この高さは、発散光スポットのサイズが1つのウェルのサイズと同じであるため、12ウェル組織培養プレートの照明に最適です。 - 2本の金属線を使用して電源に接続してください。ライトボックスがCO 2インキュベーターの中に置かれているときは、電線の長さが十分であることを確認してください。
- ライトボックスのカバーには透明な光拡散板を使用してください（ 図2C ）。
- 電圧入力の範囲で各LEDの出力を較正します。 24時間のPC12細胞分化アッセイには、0.2mW / cm 2の出力を使用する。生きているアフリカツメガエルの胚または外植片に5mW / cm 2のパワーを使用するアッセイ。
PC12細胞分化の光発生誘導
- 細胞培養およびトランスフェクション
- F12K 407.5mLとウマ血清75mLとFBS12.5mL + 100×Penn-Strep-Glutamine（ウマ血清およびFBSの最終濃度）5mLを混合することにより、ラット褐色細胞腫（PC12）細胞培養用培地500mLを調製する。 ：それぞれ15％および2.5％）。 99容量のF12K培地に1倍量の完全培地を混合することにより低血清培地を作成する。
- 300,000細胞/ウェルまたは75,000細胞/ cm 2の密度で12ウェルプレート中のプレートPC12細胞。
- 細胞プレーティングの24時間後にCRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaXで細胞をトランスフェクションする（ステップ1.4.7と同様）。各ウェルに1.2μgのDNAを使用する。 5％CO 2を補充した37℃インキュベーター内で細胞を培養培地中で一晩回復させる。トランスフェクションの16時間後にトランスフェクション効率を確認してください。
注：30〜50％トランスフェクション・エフェクト十分な細胞数を確保するためには十分な成果が得られるはずです。 - トランスフェクションの24時間後に培地を低血清培地に交換する。 12ウェルプレートの1ウェルあたり1 mLの培地を使用する。
- 光誘発PC12細胞分化
- CO 2インキュベーターにLEDアレイを置きます。 1対のワイヤを使用して電源に接続します。 LEDの電力を0.2 mW / cm 2に設定します。トランスフェクトされたPC12細胞を含む12ウェルプレート（ステップ3.1.3）をLEDアレイのウィンドウ上に置く。 5％CO 2を補充した37℃インキュベーターで24時間連続照明を照射する。
- 蛍光生細胞イメージング
- 顕微鏡とサンプルの準備については、1.5.1-1.5.4の手順に従ってください。
- シングルスナップショットのデータ収集を設定します。 GFPチャネルとTxredチャネルの両方に200ミリ秒を使用します。
- トランスフェクションされた細胞の画像をGFPおよびTxredの両方のチャンネルでキャプチャします。約200細胞を記録する各条件についてls。データ分析のためにファイルを保存します。
- 画像解析
- トランスフェクトされた細胞の総数に対する分化細胞のパーセンテージを数えます。
- 細胞を数えるには、画像分析ソフトウェアの任意の細胞計数モジュールを使用します。
- 分化した細胞を手動で数える。
注：分化した細胞は、少なくとも1つの神経突起が細胞体よりも認識可能に長いものと定義される（ 図 3A〜3B ）。 - 未分化細胞を用いてステップ3.4.3を繰り返す。
- 次の式を使用して微分比を計算します。
4. アフリカツメガエル胚におけるキナーゼ活性の光発生制御
- 緩衝液の調製
- 1X Marc's Modified Ringer（MMR）の1Lを調製する：100mMNaCl、2mMのKCl、1mMのMgCl 2、2mMのCaCl 2 、および5mMのHEPES; pH 7.5。
- mRNAの調製
- CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaXプラスミドDNA（2μg）を1μLのApaI（50 unit）で37℃で2時間消化します。
- 線状化したDNAを60μLの100％エタノールで沈殿させます。室温で5分間12,000×gで回転させてDNAをペレット化する。慎重に上清を除去し、70％エタノール60μLで再度ペレットを洗浄する。 12,000×gで室温でさらに5分間スピンします。慎重に上清を除去し、6μLのRNaseフリーH 2 OでDNAペレットを再懸濁する。
- 1μgの線状化DNAを2μLのSP6 RNAポリメラーゼ、リボヌクレオチド混合物（10mM ATP、CTP、およびUTP; 2mM GTP;および8mMキャップ類似体）2μLと20μLのヌクレアーゼ -室温で1時間自由水を加える。
- Dを削除するNAテンプレートを37℃で少なくとも15分間DNase Iで消化し、シリカ膜スピンカラムを使用して合成RNAを精製します。
- 30μLのヌクレアーゼフリー水と30μLのLiCl沈殿溶液を添加して反応を停止し、RNAを沈殿させます。徹底的に混合し、-20℃で30分間冷却する。
- 12,000×gで15分間4℃で遠心分離し、RNAをペレット化する。
- 慎重に上清を除去する。 RNAを1 mLの70％エタノールで1回洗浄し、40μLのヌクレアーゼフリー水に再懸濁する。
- スピンカラムに40μLのRNAをロードする。取り込まれていないヌクレオチドとキャップを除去するために、12,000×gで1分間4℃で遠心分離する。
- アフリカツメガエルの胚
- Sive らによって記載されたプロトコールに従う。 アフリカツメガエルの胚を得る。
- mRNAマイクロインジェクション
- 製作するキャピラリープラーでガラスキャピラリーを引っ張ることによるマイクロインジェクション用の針。プーリングプログラムをheat = 355、pull strength = 80、velocity = 50、time = 100に設定します。
- ゼリーコートを3％システイン（0.2x MMRで希釈）で処理することにより胚から除去する。
- 胚をマイクロインジェクションのために3％ポリスクロースおよび0.5x MMR溶液に移す。 CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX RNAを各胚に500ng〜1ng注入する。
注：1 ng以上の用量の注射は、青色光非依存性のMAPKシグナル伝達の活性化をもたらす。
- キナーゼ活性の光発生刺激
- 培養は、3％ポリスクロース、室温で0.5×MMR溶液中の胚をミッド胃吻合段階（段階12）に達するまでマイクロインジェクションした。次に、0.2x MMR溶液で胚を培養する。
- 胚または外植片を12ウェルプレートに移す。 12ウェルプレートを自宅で作成したLEDアレイ（ステップ2.5）に置き、青色 - 白色t（475nm）処理。
- 胚または外植片の完全な青色照明を確実にするために、12ウェルプレートの上部に鏡を置く。
- 青色光の出力を5 mW / cm 2に調整します。
注：ブルーライト処理は、3％ポリスクロース、0.5x MMR溶液、または0.2x MMR溶液のいずれかの所望の時点で行うことができる。 - 任意の時間に胚を収穫する。組織学的、ウエスタンブロット、または遺伝子発現解析に使用してください。
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Representative Results
光活性化可能なタンパク質対のレシオメトリックな発現： 図1Aは、ブタ・テスコビルム（teschovirum）由来の二重特異性光学原性構築物であるCRY2-mCherry-Raf1-P2A-CIBN-CIBN-GFP-CaaX（CRY2-2A-2CIBNと呼ばれる） 1 2A（P2A）ペプチドであり、哺乳動物細胞株42の中で最も高いリボソームスキッピング効率を示す。以前の研究では、CIBN-GFP-CaaX：CRY2-mCherry-Raf1の最適比は2：1であることが判明した35 。この構成は、CRY2-mCherry-Raf1（ 図1B ）の十分な膜補充および活性化を可能にする。 CRY2-2A-2CIBNを単独でトランスフェクトした細胞は、落射照明下（ 図1C ）または共焦点顕微鏡下（ 図1D ）のいずれかで、GFPおよびTxred蛍光チャネルの両方において透明な蛍光を示す。青色光媒介膜CRY2-mCherry-Raf1（ 図1D ）の動員は、共焦点顕微鏡法ではっきりと検出することができる。会合は、青色光曝露後数秒以内に起こり（ 図1E ）、CRY2-CIBNタンパク質複合体は、約5.5分の半減期で解離する（ 図1F ）。
神経成長因子の非存在下での光制御PC12細胞分化：成長因子シグナル伝達における興味深い観察は、一般的な下流シグナリング経路（ 例えば、 ERK、PI3K-AktおよびPLCγ）がシグナル伝達応答において多様性および特異性を引き出すことである。成長因子媒介シグナル伝達のより良い理解は、個々のカスケードの正確な空間的調節を可能にする技術を可能にすることによって達成することができる。このプロトコールで導入された光学原性アプローチは、特定の活性化を可能にするそのような技術の1つを示すnのRaf / MEK / ERKシグナル伝達経路を高時間分解能で阻害する。このアプローチは、その膜受容体へのNGF結合プロセスをバイパスするので、シグナル伝達動態はもはや内因性受容体に依存しない。代わりに、刺激光の時間的プロファイルを変調することによって、正確な運動制御を達成することができる（ 図2A ）。したがって、このアプローチは、キナーゼ活性のシグナル伝達動態を研究するための新しい可能性を開く。さらに、この実験的セットアップは、細胞内シグナル伝達の研究にオプソジェネティックアプローチを統合する非常に簡単で経済的な方法を提供する（ 図2B -2D ）。 PC12細胞分化アッセイのために、0.2mW / cm 2での24時間連続光刺激は、有意な神経突起伸長を誘導するのに十分である（ 図3A ）。ネガティブコントロール（光を含まないトランスフェクト細胞を含む）（ 図3B）および光を伴うまたは伴わない非トランスフェクト細胞（ 図 3C〜3D）は、有意な神経突起伸長を示さない。このパワーでは、構成的に活性なRaf1（CA-Raf1）でトランスフェクトされた細胞は正常分化を受ける（ 図3E ）。特に、バイシストロニック光学原性構築物でトランスフェクトされた細胞は、2つの構築物で同時トランスフェクトされた細胞よりも有意に高い分化比を生じ、CA-Raf1によって誘導される値に達する（ 図3F ）。分化比は、分化した細胞の数を、GFP蛍光によって誘導されたトランスフェクトされた細胞の数で割ることによって計算される。分化した細胞は、細胞本体35のサイズよりも長い少なくとも1つの神経突起を有するものとして定義される。分化比におけるこの増強は、1）バイシストロン系を有する光活性化可能タンパク質のより良好な送達、および2）CIBNとCRY2のタイムリーな発現比35 。
生きたXenopus laevis胚におけるRaf / MEK / ERKシグナル伝達経路の可逆的光発生刺激： X. laevisは、遺伝子転写、シグナル伝達、および胚発生を研究するための十分に確立されたモデル生物である。以前の研究は、Raf / MEK / ERK経路の活性化が細胞運命の変化をもたらし、テールバッド段階43で異所性尾様構造の形成をもたらすことを発見した。強力な中胚葉誘導物質として、過剰発現したRaf1は、胞胚および初期胚盤葉期に起こる胚葉層の指定中に異所性中胚葉を誘導し得、後に異所尾様構造の形成をもたらす。あるいは、過剰発現したRaf1は、胚芽層の指定が完了した後に上皮間葉移行（EMT）様事象を引き起こし、外胚葉を神経系および中胚葉系統に変換する。これに続いて、これらの構造43の増殖および伸長が続く。これらの実験では、MET受容体、RasおよびRaf1をコードするRNAを2細胞段階で胚に注入した。 RNAが胚に注入された直後に、過剰発現したMET / Ras / Raf1は下流のシグナル伝達カスケードを構成的に活性化し始めた。したがって、発育段階の初期段階を迂回し、胚芽層の指定後にRaf1を特異的に活性化することは技術的に困難でした。このような戦略を使用して、胚芽層の指定後のRaf / MEK / ERKシグナル伝達の活性化が細胞の運命の変化を誘発し、異所性尾様構造の形成をもたらすかどうかを決定することは不可能であった。
オプトジェネティックスは、Raf1活性のタイミングを制御する機構を提供する。初期発達段階でCRY2-2A-2CIBNのRNAを胚に注入するとRaf1は青色光が供給されるまで不活性のままであった。動物キャップ検定は、基本的なERK活性が動物の帽子では低いので、シグナル伝達結果を特徴付けるために都合よく使用された。 Raf / MEK / ERKシグナル伝達カスケードの光媒介活性化は、RT-PCR（ 図4A ）または全マウントin situハイブリダイゼーション（ 図4B ）によって決定されるように、中胚葉マーカーであるxbraの有意なアップレギュレーションを誘導した。青色光に応答するERKのリン酸化における動的変化も、ウェスタンブロット分析によって検出された（ 図4C ）。全胚において、CRY2-2A-2CIBNおよびn-β-gal RNAの混合物を8細胞段階で後部動物割球の1つに注入し、後で背側前組織を生じさせた。未処理の胚（ 図 4D〜4E）と比較して、CRY2-2A-2CIBNを注入し、青色光で処理したもの（ 図 4F〜4G）。暗い（ 図4H ）または青色光の照射下（ 図4I ）に注入されなかった胚は、尾のような構造を形成しなかった。胚芽層の指定後の青色光照射は、有意な尾様構造を誘導した（ 図4J ）。
図1：光誘導タンパク質の局在およびキナーゼシグナル伝達経路の活性化のメカニズム。 （ A ）Raf / MEK / ERKキナーゼシグナル伝達経路の光誘発活性化を可能にする、最適化されたCIBN対CRY2比（2CIBN：1CRY2）を有するバイシストロン性構築物の設計。リボソームスキッピングすると、1つのmRNA転写物が2つのタンパク質、すなわちCRY2-mCherry-Raf1-N2A（終結アミノ酸NPGを含む）およびプロリン-2CIBN-GFP-CaaX。 （ B ）CIBNとCRY2との間の光誘起結合は、Raf / MEK / ERKシグナル伝達経路を活性化するCRY2-mCherry-Raf1の膜動員をもたらす。 （ C ）エピ照射下でCRY2-2A-2CIBNでトランスフェクションしたBHK21細胞の蛍光画像。スケールバー：20μm。 （ D ）CRY2-2A-2CIBNでトランスフェクトした細胞の共焦点蛍光イメージング。左側のパネルは、切断された2CIBN-GFP-CaaXが原形質膜上に局在していることを示す。ミドルパネルは、青色光刺激の前にCRY2-mCherry-Raf1のスナップショットを示す。右側のパネルは青色光刺激の10パルス後のCRY2-mCherry-Raf1のスナップショットを示す。下のパネルは、光刺激の前後で、細胞を横切る黄色の点線に沿った正規化強度プロファイルを示す。スケールバー=20μm。光誘起CRY2-CIBN会合（ E ）および自発的解離（ E - F ）カイネティックスCRY2-CIBNタンパク質複合体のn（ F ）濃度を暗所で測定した。 図1A -Bは、生物学者の許可を得て再現された参考文献35から適応されたものである。 図1E -Fは、クリエイティブ・コモンズ帰属（CC BY）ライセンスの下、リファレンス44から適合させたものです。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2：自家製LEDアレイの設計と較正 （ A ）生細胞における光制御キナーゼ活性のための実験装置の略図。 （ B ）家庭用LEDアレイのための回路基板。 （ C ）リガンドCO 2インキュベーター内の長期光刺激に使用できるhtボックス。アルミボックスの高さは2インチです（ D ）LED出力の代表値です。電流制限抵抗と4個のLEDが直列に接続された回路では、LEDごとに光出力が値を示します。 図2Aは、生物学者の会社の許可を得て再現された参考文献35から適応されたものである。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3：PC12細胞の分化の光発生誘導。 （ A ）青色光刺激（0.2mW / cm 2 ）の24時間後にCRY2-2A-2CIBNでトランスフェクトしたPC12細胞のマルチチャネルスナップショット。 A c丸印は分化した細胞を示す。正方形は未分化細胞を示す。 （ B ）青色光刺激を用いなかったことを除いて、（ A ）と同じ。 （ C - D ）青色光刺激（0.2mW / cm 2 ）（ C ）または暗色インキュベーション（ D ）の24時間で非トランスフェクトPC12細胞。 （ E ）Raf1-GFP-CaaX（CA-Raf1）でトランスフェクトした細胞の代表的な画像。円形と長方形はそれぞれ分化した細胞と未分化の細胞を示す。 （ F ）CRY2-mCherry-Raf1およびCIBN-GFP-CaaXを同時トランスフェクションし、CRY2-2A-2CIBNを単独でトランスフェクトしたCA-Raf1でトランスフェクトしたPC12細胞の分化比。トランスフェクションの24時間後、細胞を光に曝露するか、または暗所でさらに24時間インキュベートした。値は、4つの独立したデータセットからの平均±SDを表す。青色光に曝露された細胞のみが有意な分化を示した。 図3F参照文献35から適応され、生物学者の会社の許可を得て再現された。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図4：生きたアフリカツメガエル胚のキナーゼ活性の光発生誘発。 （ A ）CRY2-2A-2CIBNを注射した動物帽において、初期の胃原段階において、青色光への暴露が汎中胚葉マーカーであるxbraの発現を誘導することを示すRT-PCR結果。 （ B ）胚におけるxbraの全身 インサイツハイブリダイゼーション。光誘導MAPK活性の活性化は、xbraの空間的分布を調節する （右下のパネルの赤い矢印）。黒い矢印は核βガを示す系統トレーサーとしてのラクトシダーゼ。 AP：動物の極。 VP：植物の極。 （ C ）ウエスタンブロット分析は、動物キャップアッセイにおいて、CRY2-2A-2CIBNが青色光依存性のERKの可逆的リン酸化を誘導することを示した。 （ D ）正常な胚の形態を示す画像、mRNA注入なし、および光処理なしの画像。 （ E ）単一の胚の拡大画像。 （ F - G ）CRY2-2A - 2CIBN mRNAを注入し、青色光刺激を受けた胚の拡大および全視野画像。 CRY2-2A-2CIBNを注入した胚を青色光で処理することによるRaf1の活性化は、頭部領域に異所尾様構造を誘導する。 （ H - I ）CRY2-2A - 2CIBNを注入した胚を含む陰性対照であるが、暗刺激（ H ）および光刺激下の非胚（ I ）下での胚。すべての光刺激実験は、5mW /2。 （ J ）各条件の下で異所性尾様構造を示す胚の割合の統計分析。スケールバー=（ D ）および（ G ）：1mm; （ E - F ）および（ H - I ）0.5mmである。 図4A 、 C 、 E - F 、およびH - Jは、参照文献35から適応され、生物学者の会社の許可を得て再現された。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ライトボックスを構築するときは、個々のLEDのパワーを測定する必要があります。以前の経験に基づいて、出力のばらつきは、製造ばらつきのために個々のLEDによって異なることがあります。お互いの電力出力が10％以内のLEDセットを選択します。 LEDの数、電流制限抵抗、および電源入力は、異なるタイプの細胞培養容器（ 例えば、 6ウェルまたは24ウェルプレート）に対して変更することができる。 0.2mW / cm 2の出力での24時間の光照射は、検出可能な光毒性44を誘発しない。より高い電力が使用される場合は、間欠的な光を使用して発熱と光毒性を低減することを検討してください。このプロトコールで導入された光発生系は、2つの隣接する光パルスの間の暗い間隔が45分未満である場合、連続的な光刺激に匹敵する断続的光刺激下でのPC12細胞における神経突起伸長を誘導する44 。支払期日タンパク質の会合および解離の動力学における本質的な相違に対して、光パルス間の持続時間は、各固有のタンパク質対について調整されなければならない。サイトゾルRaf1の過剰発現は、青色光照射なしにPC12細胞分化を引き起こさない。各胚に注入されたmRNAの量を制御することにより、暗所で有意な胚表現型は観察されなかった。
CRY2とCIBN融合タンパク質の会合を刺激するには、低出力の青色光で十分であるが、青色光の侵入深度が不十分であるため、深部組織刺激においてその使用が制限される。このような刺激は、他の装置（ 例えば、光ファイバー）を介して光を送達することによって達成されているが、このアプローチは侵襲的である（ 45） 。この問題は、2つの方法、すなわち、より長い波長（ 例えば、フィトクロム-PIF6タンパク質対）に応答するタンパク質対を用いるか、または2光子励起を用いることによって対処することができる。どちらの方法も深く提供できる彼らは他の制限を受ける可能性があります。例えば、PhyB-PIF6対は、合成コファクターが機能することを必要とし、2光子顕微鏡法は高価な機器を必要とする。 CRY2-CIBN相互作用における調整可能性の欠如は考慮すべきもう一つの限界である。野生型CRY2はCIBNから自発的に解離し、暗所で5.5分の半減期を有する34 。標的シグナル伝達経路の動力学に依存して、短縮または延長された解離半減期が好ましい場合がある。解離半減期を2.5分（W349R）に短縮するか、それを24分（L348F）まで延長することができるCRY2の突然変異が作製されている46 。あるいは、真菌受容体Vivid（VVD）およびp / nMagFast1および2に基づく操作された光活性化可能なタンパク質対は、それぞれ4.2分および25秒の解離半減期を示す47 。このプロトコールでは、野生型CRY2-CIBNタンパク質対は、軽度stiの5分以内にMAPK経路をオンにするアフリカツメガエルの胚35において、哺乳動物細胞では44および1〜2時間で30分以内に活性が基底レベルまで低下する。空間制御のために、共焦点顕微鏡法は、青色レーザを画像平面内で約200nmの回折限界スポットのサイズに集束させることができる。非コヒーレント光源を備えた落射照明顕微鏡の視野図のサイズを調整することにより、照明サイズを直径約10μmに制限することが可能である。どちらの方法も、細胞培養における光発生刺激の細胞下制御を達成することができなければならない。
高空間および時間分解能でシグナル伝達を可逆的に調べるためのオプトジェネティックスの能力は、生存細胞における動的細胞内シグナル伝達を研究するまったく新しい機会を提供する。このプロトコルの結果は、Raf1活性化が主にPCにおける神経分化の誘導に関与することを明らかにした12セル44 。同じ経路はまた、 アフリカツメガエル胚の発生において二次尾様構造の形成を引き起こす。 Raf1活性化のタイミングを制御することにより、胚様体形成段階35の後に尾様構造を誘導することができる。最近記載されたLOVTRAP法は、2つの操作されたタンパク質、ZdarkおよびLOV2を利用し、暗所においてのみ選択的に互いに結合して、目的のタンパク質（POI） 48の光誘起解離を調節する。このアプローチで使用される光媒介タンパク質 - タンパク質会合とは異なり、LOVTRAPは光を用いてタンパク質の解離を誘導する。この新しいモダリティは、生存細胞におけるタンパク質の局在および活性を調節する上でより柔軟である。シグナリングカスケード内の活性化のモードを慎重に選択することにより、シグナル伝達を従来とは違う方法で解剖することが可能である。例えば、lを有さない受容体型チロシンキナーゼを活性化することが可能であるリガンド誘発性シグナル伝達カスケードのサブセットを誘導することができる（ 44） 。ここに報告された戦略は、Akt39およびGTPase（ 例えば、 Rho GTPase）などの他のキナーゼを制御するために一般化することができ、その活性化状態はタンパク質転座によってもオンにすることができる。ショウジョウバエ50 、ゼブラフィッシュ51,52,53,54およびアフリカツメガエル胚35におけるタンパク質局在化およびシグナリングの光学原制御を特徴とする最近の研究によって示されるように、オプテジェネティックスは、多細胞生物の生存に適用され続けるであろう。
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Disclosures
著者らは、競合する金銭的利益がないと宣言している。
Acknowledgments
この研究は、イリノイ大学アーバナ・シャンペーン校（UIUC）および国立衛生研究所（NIGMS R01GM111816）の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass coverslip | VWR | 48393 230 | Substrate for live cell imaging |
| Coverslip holder | Newcomer Supply | 6817B | Holder for coverslips |
| Detergent | ThermoFisher | 16 000 104 | For cleaning coverslips |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768-500G | For making PLL buffer |
| Disodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 71996-250G | For making PLL buffer |
| Plastic beaker | Nalgene | 1201-1000 | For cleaning coverslips |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465-2.5KG | For adjust pH |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1274-500MG | For coating coverslip |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC)-Treated Water | ThermoFisher Scientific | 750024 | For DNA preparation |
| Cover Glass Forceps | Ted Pella | 5645 | Cover glass handling |
| Tissue cutlure dish | Thermofisher | 12565321 | Cell culture dish |
| Sterile centrifuge tubes | ThermoFisher | 12-565-271 | Buffer storage |
| Transfection Reagent | ThermoFisher | R0534 | Transfection |
| CO2-independent medium | ThermoFisher | 18045088 | For live cell imaging |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Form make cell chamber |
| Plasmid Maxiprep kit | Qiagen | 12965 | Plasmid preparation |
| DMEM medium | ThermoFisher | 11965-084 | Cell culturing medium component |
| F12K medium | ThermoFisher | 21127022 | Cell culturing medium component |
| Horse serum | ThermoFisher | 16050122 | Cell culturing medium component |
| Fetal Bovine Serum | Signa-Aldrich | 12303C-500 mL | Cell culturing medium component |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | ThermoFisher | 10378016 | Cell culturing medium component |
| Trypsin (0.25%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 15050065 | For mammalian cell dissociation |
| Agarose | Fisher Scientific | BP1356-100 | For DNA preparation |
| Ficoll PM400 | GE Heathcare Life Sciences | 17-5442-02 | For embryo buffer |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | 1.02839.0025 | Oocyte preparation |
| ApaI | ThermoFisher | FD1414 | For linearization of plasmids |
| Dnase I | ThermoFisher | AM2222 | For removing DNA template in the in vitro transcription assay |
| Index-match materials (immersion oil) | Thorlabs | MOIL-20LN | For matching the index between sample substrate and objective |
| Blue LED | Adafruit | 301 | Light source for optogenetic stimulation |
| Resistor kit | Amazon | EPC-103 | current-limiting resistor |
| Aluminum boxes | BUD Industries | AC-401 | light box |
| BreadBoard | Jekewin | 837654333686 | For making LED array |
| Hook up Wire | Electronix Express | 27WK22SLD25 | For making LED array |
| Relay Module | Jbtek | SRD-05VDC-SL-C | For intermittent light control |
| DC Power Supply | TMS | DCPowerSupply-LW-(PS-305D) | Power supply for LED |
| Silicon Power Head | Thorlabs | S121C | For light intensity measurement |
| Power meter | Thorlabs | PM100D | For light intensity measurement |
| Microscope | Leica Biosystems | DMI8 | For live cell imaging |
| BioSafety Cabinet | ThermoFisher | 1300 Series A2 | For mammalian cell handling |
| CO2 incubator | ThermoFisher | Isotemp | For mammalian cell culturing |
| Stereo microscope | Leica | M60 | For embryo micro-manipulation |
| Microinjector | Narishige | IM300 | For embryo microinjection |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P87 | Needle puller |
| in vitro transcription kit | ThermoFisher | AM1340 | For in vitro transcription. The kit includes nuclease-free water, SP6 RNA Polymerase, ribonucleotide mixture, cap analog, lithium choride precipitation solution, and spin column |
| RNA purfication kit | Qiagen | 74104 | Silica-membrane spin column for purification of synthesized RNA |
| Convection oven | MTI corporation | EQ-DHG-9015 | PDMS curing |
| Centrifugal mixer and teflon container | THINKY | AR310 | For mixing PDMS |
| Silicon wafer | UniversityWafer | 452 | Base for making PDMS devices |
| Blade | Techni Edge | 01-801 | For cutting PDMS |
| Capillary glass | Sutter Instruments | BF100-58-10 | For fabrication of injecting needles. |
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