Summary
该协议描述了在细胞分化和非洲爪蟾胚胎发育过程中调节丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）活性的光遗传策略。这种方法允许哺乳动物细胞培养物和多细胞活生物体如非洲爪蟾胚胎中具有高空间和时间分辨率的可逆激活MAPK信号通路。
Abstract
激酶活性对于多种细胞功能至关重要，包括细胞增殖，分化，迁移和细胞凋亡。在早期胚胎发育过程中，激酶活性在胚胎中是高度动态和广泛的。药理学和遗传学方法通常用于探索激酶活性。不幸的是，使用这些策略来实现优越的空间和时间分辨率是很困难的。此外，在活细胞和多细胞生物体中以可逆的方式控制激酶活性是不可行的。这种限制仍然是在开发和分化期间实现对激酶活性的定量了解的瓶颈。这项工作提出了利用含有可光活化蛋白拟南芥隐色素2（CRY2）和密码子相互作用的基质 - 螺旋 - 环 - 螺旋（CIBN）的N-末端结构域的双顺反子系统的光遗传策略。黑白棋有丝分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）信号通路的活化可以通过活细胞中的光介导的蛋白质易位实现。这种方法可以应用于哺乳动物细胞培养物和活的脊椎动物胚胎。这种双顺反子系统可以被推广以控制具有相似活化机制的其它激酶的活性并且可以应用于其它模型系统。
Introduction
生长因子参与广泛的细胞功能，包括增殖，分化，迁移和凋亡，并在许多生物学事件中发挥关键作用，包括胚胎发育，衰老和精神状态调节1,2,3,4 ， 5 。许多生长因子通过复杂的细胞内信号传导级联信号。这些信号事件通常以精确调节的方式可逆蛋白磷酸化操作6,7 。因此，对蛋白激酶的信号转导结果的理解，它们负责蛋白质磷酸化，这是非常重要的。
不同的生长因子通过相当普遍的细胞内信号网络起作用，即使它们刺激dist细胞反应8,9 。受体酪氨酸激酶的常见细胞内介质包括Ras，Raf，细胞外信号调节激酶（ERK），丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）/ ERK激酶（MEK），磷酸肌醇3-激酶（PI3K），Akt和磷脂酶Cγ （PLCγ） 10,11 。积累的证据表明信号多样性和特异性取决于信号传导活动的空间和时间调节12 。例如，在大鼠嗜铬细胞瘤细胞（PC12）中，导致细胞增殖的表皮生长因子（EGF）刺激瞬时激活ERK通路9 。另一方面，导致细胞分化的神经生长因子（NGF）的刺激以持续的方式激活ERK通路9,13。在培养的r在海马神经元中，脑源性神经营养因子（BDNF）的瞬时信号传导促进原发神经突生长，而持续的信号传导导致神经突分支增加14 。在早期胚胎发育过程中，磷酸化的ERK活性在时间上是动态的，并且在胚胎中是广泛的6 。早期非洲爪蟾胚胎发生期间最近的遗传筛选显示ERK和Akt信号级联，两种下游原生生长因子途径，显示阶段特异性激活谱7 。因此，对激酶信号转导结果的理解需要能够以足够的分辨率探测激酶活性的空间和时间特征的工具。
探索发育过程中信号转导的动态特性的常规实验方法缺乏理想的空间和时间分辨率。例如，药理学方法使用小化学或生物分子刺激或抑制细胞和组织中的信号转导。这些小分子的扩散性质使得将其作用限制在特定的感兴趣区域15是有挑战性的。遗传方法（ 如转基因，Cre-Lox系统或诱变）通常导致靶基因表达或蛋白活性的不可逆活化或抑制16,17,18。 Tet-On / Tet-Off系统19提供改进的基因转录的时间控制，但是缺乏严格的空间控制，因为它依赖于四环素的扩散。化学诱导的蛋白质二聚化20或光解蛋白21,22,23,24中的最新发展有很大的增强作用信号网络的时间控制。然而，由于笼式化学品的扩散性质，空间控制仍然是具有挑战性的。
利用光的功能来控制蛋白质 - 蛋白质相互作用的最近出现的光生代谢途径允许以高时空精度和可逆性调节信号通路。在控制神经元激发25,26,27之后不久，光遗传学被扩展到控制其他细胞过程，如基因转录，翻译，细胞迁移，分化和凋亡28,29,30,31,32,33 ， 34 。使用p的策略最近开发了可光活化蛋白对拟南芥隐色素2（CRY2）蛋白和密码子相互作用的碱性 - 螺旋 - 环 - 螺旋（CIBN）的N末端结构域，以控制哺乳动物细胞和非洲爪蟾胚胎中的Raf1激酶活性。 CRY2在蓝光刺激下与CIBN结合，CRY2 / CIBN蛋白复合物在黑暗中自发解离34 。蓝光激发CRY2辅因子，黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD），其导致CRY2的构象变化及其随后与CIBN的结合。可以通过FAD结合口袋中的突变产生CRY2的组成型活性（W374A）和黄素缺乏型（D387A）突变体：CRY2 W374A突变体独立于光而与CIBN结合，而CRY2 D387A突变体不结合蓝色的CIBN光刺激36,37 。光生系统描述了我该方案使用野生型CRY2和CIBN诱导活细胞中的蛋白质易位介导的Raf1活化。已知Raf1的膜募集增强其活性38 。在该系统中，串联CIBN模块锚定于质膜，CRY2-mCherry与Raf135的N末端融合。在没有蓝光的情况下，CRY2-mCherry-Raf1停留在细胞质中，Raf1不活跃。蓝光刺激诱导CRY2-CIBN结合，并将Raf1募集到质膜上，其中Raf1被激活。 Raf激活刺激Raf / MEK / ERK信号级联。 CRY2-和CIBN-融合蛋白均以双顺反子基因系统编码。该策略可以被推广以控制其他激酶，例如Akt，其激活状态也可以通过细胞中的蛋白质移位而被打开39 。这项工作提出了在哺乳动物细胞培养中实现这种光遗传策略的详细协议res和多细胞生物。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
动物研究是按照伊利诺斯机构动物保护和使用委员会（IACUC）和伊利诺伊州动物资源大学（DAR）制定的指导方针进行的。
蛋白定位在BHK21哺乳动物细胞培养中的光学诱导
注意：步骤1.1-1.3提供了一种组装细胞培养室，用于通常具有较短工作距离的高倍率物镜（ 例如， 63X或100X）进行成像的方法。这些目标需要薄玻璃盖玻片（ 例如， ＃1.5,170μm厚度）作为成像基底。或者，可以使用玻璃底细胞培养皿/载玻片。在这种情况下，可以跳过步骤1.1-1.3。
- 清洁玻璃盖玻片
- 将30个玻璃盖玻片放在盖玻片夹中。
- 在600 mL塑料烧杯中加入20 g洗涤剂和400 mL温水自来水。的Plac将烧杯放在磁力搅拌器上并搅拌直到所有洗涤剂溶解。用棉纸去除泡沫。
- 使用100 mm x 15 mm培养皿的底部作为搅拌棒的间隔物，并作为盖玻片支架的表面。为了在清洁过程中保持足够的流动，在培养皿中排放3-4个孔。
- 为了做出排水孔，加热烙铁，并在排气罩中燃烧塑料。
小心：请勿用双手触摸加热的烙铁。 - 将盖玻片夹放置在烧杯中的培养皿上。在室温下搅拌2小时至过夜。
- 在1000 mL烧杯中用500 mL去离子水洗涤三次。可以重新使用洗涤剂溶液。
- 用镊子拿起个别的盖玻片。将盖玻片浸入190（95％）乙醇中1分钟。
- 将盖玻片干燥在无菌罩内。将盖玻片存放在无菌塑料容器中直到使用。
- 制作聚-L-赖氨酸（PLL）涂层的盖玻片
- 通过将1.24g硼酸和1.9g四硼酸二钠溶于400mL水中来制备0.1M硼酸盐缓冲液。用10 M NaOH调节pH至8.5。
- 将硼酸盐缓冲液中的PLL溶解至1 mg / mL的最终浓度。将PLL溶液等分于50 mL无菌离心管中。
- 将50 mL PLL涂层溶液加入10 cm组织培养皿中。将盘放在37℃的培养箱中以加热PLL溶液。
- 在无菌罩中打开盖玻片容器（步骤1.1.8）。
- 将清洁的盖玻片一个接一个地浸入组织培养皿中预热的PLL溶液中。避免气泡形成，以便浸入所有表面。
- 将盖玻片放在37℃CO 2培养箱中过夜。取出每个盖玻片并将其放在无菌的盖玻片夹中。用高压灭菌超纯水冲洗三次（18.2MΩ＆＃183厘米电阻率）在无菌罩中的1000毫升烧杯中。
- 在无菌罩中的盖玻片支架上盖上盖玻片。将盖玻片存放在无菌塑料容器中直到使用。
- 组装聚二甲基硅氧烷（PDMS）细胞培养室
- 在塑料容器中，重量为40g的PDMS基料，并加入4g固化剂以达到10：1w / w的PDMS和固化剂的比例。通过用移液管吸头搅拌混合PDMS /固化剂2分钟。或者，使用离心式混合器。
- 使用4英寸直径的烧杯作为模板，制成一块铝箔的支架。将铝箔保持架放在15厘米的培养皿中。在这个铝箔保持架内放置4英寸的硅片。
- 将混合的PDMS溶液倒入固定器中。使用薄玻璃棒轻轻地接触晶片的边缘。清除晶片下面的任何气泡。
- 将15厘米培养皿插入真空口中r去除PDMS溶液。继续脱气约20分钟，直至不产生气泡。同时将对流烘箱预热至65°C。
- 小心地将15厘米培养皿放入烤箱。孵育2小时。
- 从烤箱中取出板。使用玻璃棒轻轻触摸PDMS的边缘，并确保完全交联。如果没有，培养更长时间，直到PDMS固体和不粘。
- 从板上取下铝箔并将其从硅晶片上剥离下来。从边缘开始，小心地从硅晶片上剥离固化的PDMS。
小心：避免施加太大的力，因为它会破坏晶片。 - 将PDMS修剪成20毫米×30毫米的矩形片，以使用剃刀刀片适合24毫米x 40毫米的盖玻片。
- 使用凿形刀片从每个PDMS片的中心切出10mm×20mm的矩形开口。
- 使用步骤1.1中描述的洗涤剂方案清洁PDMS室。
- 将PDMS室清洁干净。将干燥室放入用铝箔覆盖的高压灭菌容器中。
- 使用重力（121°C，15 psi）将容器高压灭菌30分钟，并将容器储存在室温下。
- BHK21细胞培养和转染
- 通过将445mL DMEM与50mL FBS和5mL 100×Penn-Strep-Glutamine（10,000U / mL青霉素，10mg / mL链霉素和29.2mg / mL L）混合，制备500mL用于BHK21细胞培养的培养基谷氨酰胺）。确保FBS的最终浓度为10％。
- 分装10 mL非HEPES CO 2 - 用于活细胞成像的独立培养基。
注意：CO 2 -独立培养基支持无CO 2培养箱的细胞生长，并且是在大气条件下成像细胞的理想选择。有关详细信息，请参阅材料清单。除了BHK21细胞系外，其他类型的哺乳动物细胞也应该给予类似的结果。 - 通过在无菌罩中将一个高压灭菌的无菌PDMS室（步骤1.3）放置在无菌PLL涂覆的盖玻片上（步骤1.2）来组装细胞培养装置。
- 将每个设备放在无菌的60 mm培养皿中。
- 使用0.5mL的0.25％胰蛋白酶从12孔组织培养板的一个孔中分离细胞。用血细胞计数器计数细胞密度。用200μL细胞培养基将20000个BHK21细胞置于室中（约10,000个细胞/ cm 2 ）。
- 用质粒制备试剂盒制备DNA质粒（参见材料清单）。
注：CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX的设计和功能如图1A - 1B所示 。 - 细胞培养24小时后，根据制造商的方案，用50-100ng的CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX质粒转染细胞。
- 转染后三（3）小时，更换m将其加入到200μL新鲜培养基（步骤1.4.1）中，并通过在37℃，5％CO 2培养箱中培养培养物使细胞恢复过夜。
- 荧光活细胞成像
- 打开电脑，光源，显微镜和相机。在协议的其余部分使用共聚焦荧光显微镜（配备100X油浸物镜）。
注意：也可以使用倒置的荧光显微镜。 - 用200μL的二氧化碳依赖培养基代替细胞培养基。
- 在将细胞放在显微镜上之前设置数据采集协议。使用488nm激发FITC通道进行光遗传刺激。使用561 nm激发TRITC通道定位转染的细胞并追踪mCherry标记蛋白的细胞定位。
- 将FITC和TRITC通道的增益分别设置为120和200。使用像素居住时间2.21; s和512×512像素的大小。
- 通过将功率计放在物镜窗口附近来测量488nm光的功率。总功率为2μW（聚焦时约10,000 W / cm 2 ）足以引起CIBN-CRY2PHR缔合。
- 设置5秒间隔的时间戳采集，总采集时间为2分钟。
- 在目标窗口上应用适当的折射率匹配材料（浸油）。使用相位对比模式来聚焦在盖玻片表面上的单元格上。
- 通过移动显微镜平台，在561nm光下定位转染的细胞。
注意：在此步骤中避免使用蓝光，因为它会激活光活化蛋白质之间的关联。 - 一旦转染细胞定位，启动数据采集。
注意：成功转染的细胞应在FITC（来自2CIBN-GFP-CaaX）和TRITC（来自CRY2-mCherry-Raf1）通道中显示荧光（ 图1C-D - 在FITC和TRITC通道中记录一系列时间戳的图像（ 图1D ）。
- 为了探索CRY2-CIBN蛋白复合物的自发解离，用Txred通道单独记录20分钟，间隔30秒的另一个时间戳。
- 保存时间戳的图像进行数据分析。
- 打开电脑，光源，显微镜和相机。在协议的其余部分使用共聚焦荧光显微镜（配备100X油浸物镜）。
- 图像分析
- 使用可以从图像40提取强度的图像分析软件打开图像。
- 选择两个代表性的快照：一个在蓝光曝光之前，另一个是蓝光曝光。
- 在跨越背景，质膜和细胞质的细胞上绘制线。沿着这条线投射强度。保存值并绘制出来，比较曝光前后的差异（ 图1D ）。
- 分析蛋白质结合的动力学，选择在质膜中的一个代表性感兴趣区域（ROI），细胞质中的一个ROI和背景中的一个ROI。
- 获取图像堆叠的质膜（I PM ），细胞质（I CYT ）和背景（I BKD ）的平均强度。
- 使用以下公式计算每个图像的膜/胞质强度比：
- 绘制比例对时间，并确定CRY2-CIBN的结合或解离动力学（ 图1E -F ）。
2.在二氧化碳培养箱中长期光刺激的LED阵列的构造
注意：实验设置的总体原理图如图2A所示 。
- 通过将12个蓝色LED插入两个面包板来制作LED阵列ds和连接限流电阻。
注意：使用30 V电源时，可以串联连接四个LED，其亮度可由限流电阻控制。 - 将面包板放入铝盒中。
注意：铝箱的高度应为2英寸，这个高度对于照亮12孔组织培养板是最佳的，因为发散光斑的大小与单个孔的大小相同。 - 使用两根金属线连接电源。当灯箱放置在CO 2培养箱内时，确保电线的长度足够。
- 使用透明光扩散器作为灯箱的盖子（ 图2C ）。
- 在一定范围的电压输入端校准每个LED的功率输出。对于24小时PC12细胞分化测定，使用0.2 mW / cm 2的功率。使用5 mW / cm 2的活力来生活非洲爪蟾的胚胎或外植体试验。
3. PC12细胞分化的光学诱导
- 细胞培养和转染
- 通过将407.5mL F12K与75mL马血清+ 12.5mL FBS + 5mL 100×Penn-Strep-Glutamine（马血清和FBS的终浓度）混合，制备500mL用于大鼠嗜铬细胞瘤（PC12）细胞培养物的培养基：分别为15％和2.5％）。通过在99体积的F12K培养基中混合1体积的全培养基来制备低血清培养基。
- 平板PC12细胞在密度为30万个细胞/孔或75,000个细胞/ cm 2的12孔板中。
- 细胞培养24小时后用CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX转染细胞（类似于步骤1.4.7）。每个孔使用1.2μgDNA。允许细胞在培养基中在补充有5％CO 2的37℃培养箱中回收过夜。转染后16 h检查转染效率。
注意：30-50％的转染效率应该实现高血压以确保足够的细胞计数。 - 转染后24 h将培养基更换为低血清培养基。每孔使用1 mL培养基的12孔板。
- 光诱导的PC12细胞分化
- 将LED阵列放在CO 2培养箱中。使用一对电线将其连接到电源。将LED的功率设置为0.2 mW / cm 2 。将含有转染的PC12细胞的12孔板（步骤3.1.3）置于LED阵列的窗口上。在补充有5％CO 2的37℃培养箱中连续照明24小时。
- 荧光活细胞成像
- 按照步骤1.5.1-1.5.4进行显微镜和样品制备。
- 设置单快照数据采集。对GFP和Txred通道使用200 ms。
- 在GFP和Txred通道中捕获转染细胞的图像。记录大约200个ls为每个条件。保存文件进行数据分析。
- 图像分析
- 计算分化细胞在转染细胞总数中的百分比。
- 在图像分析软件中使用任何细胞计数模块对细胞进行计数。
- 手动计数分化细胞。
注意：分化细胞定义为其中至少一个神经突可明显长于细胞体的细胞（ 图3A- 3B ）。 - 用未分化细胞重复步骤3.4.3。
- 使用以下公式计算分化比：
4. 非洲爪蟾胚胎中激酶活性的光密控制
- 缓冲液的制备
- 准备1 L 1x Marc's Modified Ringer（MMR）：100 mMNaCl，2mM KCl，1mM MgCl 2，2mM CaCl 2和5mM HEPES; pH 7.5。
- mRNA的制备
- 在37℃下将1μLApaI（50单位）的CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX质粒DNA（2μg）消化2小时。
- 在60μL100％乙醇中沉淀线性化DNA。在室温下以12,000×g旋转5分钟以沉淀DNA。仔细取出上清液，再次用60μL70％乙醇洗涤沉淀。在室温下旋转12,000×g另外5分钟。仔细取出上清液，将DNA沉淀重悬于6μL无RNase的H 2 O.
- 通过用2μL提供的SP6 RNA聚合酶，核糖核苷酸混合物（10mM ATP，CTP和UTP; 2mM GTP;和8mM cap类似物）孵育1μg线性化DNA和20μL核酸酶 -在室温下放置1小时。
- 删除DNA模板通过DNA酶I在37℃下消化至少15分钟，并使用二氧化硅 - 膜旋转柱纯化合成的RNA。
- 停止反应并通过加入30μL无核酸酶水和30μLLiCl沉淀溶液沉淀RNA。充分混合，-20°C冷却30分钟。
- 以12,000×g离心4分钟15分钟以沉淀RNA。
- 仔细清除上清液。用1 mL 70％乙醇清洗RNA一次，并重悬于40μL无核酸酶的水中。
- 在旋转柱中加载40μLRNA。以12,000×g离心4分钟1分钟，以去除未掺入的核苷酸和帽。
- 收获非洲爪蟾胚胎
- 按照Sive et al。 41获得非洲爪蟾胚胎。
- mRNA显微注射
- 制造用毛细管拉拔玻璃毛细管用于显微注射的针头。将拉伸程序设置为：heat = 355，拉力= 80，速度= 50，时间= 100。
- 通过用3％半胱氨酸（以0.2倍MMR稀释）处理它们从胚胎中除去果冻外壳。
- 将胚胎转移到3％聚蔗糖和0.5x MMR溶液用于显微注射。向每个胚胎中注入500 pg至1ng的CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX RNA。
注意：注射高于1ng的剂量会导致MAPK信号的蓝光独立激活。
- 激酶活性的光致刺激
- 在室温下将3％聚蔗糖，0.5x MMR溶液中的显微注射胚胎培养直至达到中期胃肠期（12期）。然后，在0.2x MMR溶液中培养胚胎。
- 将胚胎或外植体转移到12孔板上。将12孔板放在家用LED阵列上（步骤2.5），用于蓝色t（475nm）处理。
- 在12孔板的顶部放置一个镜子，以确保胚胎或外植体的全蓝光照射。
- 调节蓝光的功率为5 mW / cm 2 。
注意：蓝光处理可以在任何所需时间进行，在3％聚蔗糖，0.5x MMR溶液或0.2x MMR溶液中。 - 在任何所需时间收获胚胎。用于组织学，Western印迹或基因表达分析。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
可光活化蛋白质对的比例表达： 图1A显示了基于猪teschovirum的双顺反子基因构建体CRY2-mCherry-Raf1-P2A-CIBN-CIBN-GFP-CaaX（称为CRY2-2A-2CIBN）的设计， 112A（P2A）肽，其在哺乳动物细胞系42中显示出最高的核糖体跳跃效率。在以前的工作中，已经确定CIBN-GFP-CaaX：CRY2-mCherry-Raf1的最佳比例为2:135。该配置允许CRY2-mCherry-Raf1的足够的膜募集和活化（ 图1B ）。用CRY2-2A-2CIBN单独转染的细胞在外显子照射（ 图1C ）或共聚焦显微镜（ 图1D ）下都显示GFP和Txred荧光通道中的清晰荧光。蓝光介导的membra在共焦显微镜下可以清楚地检测到CRY2-mCherry-Raf1的募集（ 图1D ）。在蓝光暴露后几秒内发生结合（ 图1E ），CRY2-CIBN蛋白复合物以约5.5分钟的半衰期解离（ 图1F ）。
在不存在神经生长因子的情况下，光控PC12细胞分化：生长因子信号传导中的一个有趣的观察是，常见的下游信号通路（ 例如， ERK，PI3K-Akt和PLCγ）在信号传导反应中引起多样性和特异性。通过启用允许单个级联的精确时空调节的技术，可以更好地了解生长因子介导的信号传导。该协议中引入的光生方法表明了一种允许特定活动的技术n的Raf / MEK / ERK信号通路具有高时间分辨率。因为这种方法绕过NGF与其膜受体结合的过程，信号传导动力学不再依赖于内源受体。相反，可以通过调制刺激光的时间分布来实现精确的动力学控制（ 图2A ）。因此，这种方法开辟了研究激酶活性的信号动力学的新可能性。此外，该实验设置提供了一种非常简单和经济的方式将光生生物学方法整合到细胞内信号转导研究中（ 图2B -2D ）。对于PC12细胞分化测定，0.2mW / cm 2的24小时连续光刺激足以引起显着的神经突生长（ 图3A ）。阴性对照，包括没有光的转染细胞（ 图3B）和带有或不带光的非转染细胞（ 图3C- 3D ），不显示显着的神经突生长。在此功能下，用组成型活性Raf1（CA-Raf1）转染的细胞经历正常分化（ 图3E ）。值得注意的是，用双顺反子视觉遗传构建体转染的细胞比两种构建体共转染的细胞产生明显更高的分化比，达到CA-Raf1诱导的值（ 图3F ）。通过将分化细胞数除以由GFP荧光引导的转染细胞数来计算分化比。分化细胞被定义为具有比细胞体35的尺寸长的至少一个神经突的细胞。分化比例的这种增强产生于：1）更好地用双顺反子系统递送可光活化蛋白质，2）操作CIBN与CRY2之间的时间表达比例35 。
活的非洲爪蟾胚胎中的Raf / MEK / ERK信号通路的可逆光诱导刺激：雪松是一种成熟的用于研究基因转录，信号转导和胚胎发育的模型生物。以前的工作发现，Raf / MEK / ERK途径的激活导致细胞命运的变化，导致在尾巴阶段43形成异位尾状结构。作为有效的中胚层诱导剂，过表达的Raf1可以在胚泡层规范期间诱导异位中胚层，其在囊胚和早期胃肠期期间发生，并且稍后导致形成异位尾状结构。或者，过表达的Raf1可以在胚层指定完成后引发上皮 - 间质转化（EMT）样事件，并可直接将外胚层转化为神经和中胚层谱系。其次是这些结构的扩散和扩展43 。在这些实验中，将编码MET受体，Ras和Raf1的RNA在两细胞阶段注射到胚胎中。将RNA注入胚胎后不久，过表达的MET / Ras / Raf1开始组成型激活下游信号级联。因此，技术上具有挑战性的是绕过早期发育阶段，特异性地在胚层指定后激活Raf1。不可能使用这样的策略来确定在胚层指定后Raf / MEK / ERK信号的激活是否会诱导细胞命运变化，导致形成异位尾状结构。
光致遗传学提供了一种控制Raf1活动时间的机制。当CRY2-2A-2CIBN的RNA在早期发育阶段注入胚胎时s，Raf1保持不活动，直到提供蓝光。动物帽测定方便地用于表征信号转导结果，因为动物帽中的基础ERK活性低。 Raf / MEK / ERK信号级联的光介导的激活诱导了通过RT-PCR（ 图4A ）或全部原位杂交（ 图4B ）测定的xbra，中胚层标记物的显着上调。通过Western印迹分析也检测到响应于蓝光的ERK磷酸化的动态变化（ 图4C ）。在全胚胎中，将8Y细胞阶段将CRY2-2A-2CIBN和n-β-gal RNA的混合物注射到背部动物卵裂球中，然后产生背部前组织。与未处理的胚胎相比（ 图4D- 4E ），用CRY2-2A-2CIBN注射并用蓝光处理药物异位尾状结构（ 图4F -4G ）。在黑暗中注射的胚胎（ 图4H ）或在蓝光照射下未注射（ 图4I ）不形成尾状结构。胚芽层规格后的蓝光照射引起明显的尾状结构（ 图4J ）。
图1：光诱导的蛋白质定位和激酶信号通路的激活机制。 （ A ）具有优化的CIBN-CRY2比率（2 CIBN：1 CRY2）的双顺反子构建体的设计，其允许光诱导的Raf / MEK / ERK激酶信号通路的激活。在核糖体跳过时，一个mRNA转录物产生两种蛋白质：CRY2-mCherry-Raf1-N2A（结束氨基酸NPG）和脯氨酸2CIBN-GFP-CaaX。 （ B ）CIBN和CRY2之间的光诱导结合导致CRY2-mCherry-Raf1的膜募集，其激活Raf / MEK / ERK信号通路。 （ C ）在外照射下用CRY2-2A-2CIBN转染的BHK21细胞的荧光图像。刻度棒：20μm。 （ D ）用CRY2-2A-2CIBN转染的细胞的共焦荧光成像。左侧图显示定位于质膜上的切割的2CIBN-GFP-CaaX;在蓝光刺激之前，中间面板显示了CRY2-mCherry-Raf1的快照;右侧面板显示了10次蓝光刺激后CRY2-mCherry-Raf1的快照。底部面板显示沿着细胞周围的黄色虚线，在光刺激之前和之后的归一化强度分布。刻度棒=20μm。 （ E - F ）光诱导CRY2-CIBN缔合（ E ）和自发解离动力学在黑暗中CRY2-CIBN蛋白复合物的n（ F ）。 图1A -B从参考文献35改编，经生物学家公司许可转载。 图1E -F根据知识共享署名（CC BY）许可证的参考文献44进行了修改。 请点击此处查看此图的较大版本。
图2：家庭LED阵列的设计和校准。 （ A ）活细胞中光控激酶活性的实验装置示意图。 （ B ）家用LED阵列的电路板。 （ C ）ht盒，可用于CO 2培养箱中的长期光刺激。铝盒的高度为2英寸（ D ）典型的LED输出功率对电压。在限流电阻和四个LED串联连接的电路中，每个LED的光功率值。 图2A由参考文献35进行了修改，经生物学家公司许可复制。 请点击此处查看此图的较大版本。
图3：PC12细胞分化的光合诱导。 （ A ）在蓝光刺激（0.2mW / cm 2 ）24小时后用CRY2-2A-2CIBN转染的PC12细胞的多通道快照。 A circle标志着分化细胞。一个正方形标记未分化细胞。 （ B ）与（ A ）相同，不使用蓝光刺激。 （ C - D ）在24小时的蓝光刺激（0.2mW / cm 2 ）（ C ）或暗孵育（ D ）下未转染的PC12细胞。 （ E ）用Raf1-GFP-CaaX（CA-Raf1）转染的细胞的代表性图像。圆和矩形标记分别和未分化细胞。 （ F ）用CRY2-mCherry-Raf1和CIBN-GFP-CaaX共转染的CA-Raf1转染的PC12细胞的分化比率，并用CRY2-2A-2CIBN单独转染。转染后24小时，将细胞暴露于光照或在黑暗中孵育另外24小时。这些值表示来自四个独立数据集的平均值±SD。只有暴露于蓝光的细胞显示出显着的分化。 图3F改编自参考文献35 ，经生物学家公司许可转载。 请点击此处查看此图的较大版本。
图4：活非洲爪蟾胚胎中激酶活性的光学诱导。 （ A ）RT-PCR结果显示，在早期胃肠期，暴露于蓝光诱导CRY2-2A-2CIBN注射的动物盖中的xbra，泛中胚层标记物的表达。 （ B ）胚胎中xbra的全原位杂交。光诱导的MAPK活性激活调节xbra的空间分布（右下图中的红色箭头）。黑箭标记核β-ga乳糖苷酶作为谱系示踪剂。 AP：动物杆。 VP：植物杆。 （ C ）蛋白质印迹分析显示，在动物帽测定中，CRY2-2A-2CIBN诱导ERK的蓝光依赖性，可逆磷酸化。 （ D ）显示正常胚胎形态的图像，无mRNA注射和无光照治疗。 （ E ）单个胚胎的放大图像。 （ F - G ）注射CRY2-2A-2CIBN mRNA并进行蓝光刺激的胚胎的放大和全场图像。通过用蓝光处理CRY2-2A-2CIBN注射的胚胎来激活Raf1在头部区域诱导异位尾状结构。 （ H - I ）阴性对照，包括注射CRY2-2A-2CIBN的胚胎，但在深色孵育（ H ）和未注射的胚胎在光刺激下（ I ）。所有光刺激实验以5mW / cm 2的功率进行sup> 2。 （ J ）在每种条件下显示异位尾状结构的胚胎百分比的统计分析。刻度尺=（ D ）和（ G ）：1mm; （ E - F ）和（ H - I ）0.5mm。 图4A ， C ， E - F和H - J改编自参考文献35 ，经生物学家公司许可复制。 请点击此处查看此图的较大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
建造灯箱时，应测量各个LED的功率。根据以前的经验，由于制造差异，功率输出可能因个别LED而异。选择一组功率输出在10％以内的LED。可以针对不同类型的细胞培养容器（ 例如 6孔或24孔板）修改LED的数量，限流电阻和功率输入。功率为0.2mW / cm 2的 24小时的光照不会引起可检测的光毒性44 。如果使用更高的功率，请考虑使用间歇光来减少发热和光毒性。在本方案中引入的光生系统在间歇光刺激下诱导PC12细胞中的神经突生长，与连续光刺激相当，因为两个相邻光脉冲之间的暗区间小于45分钟44 。应有对于蛋白质缔合和解离的动力学的固有差异，必须针对每个独特的蛋白质对调整光脉冲之间的持续时间。细胞溶质Raf1的过度表达不引起PC12细胞分化而没有蓝光照射。通过控制注射到每个胚胎中的mRNA的量，在黑暗中没有观察到显着的胚胎表型。
虽然低功率蓝光足以刺激CRY2-和CIBN-融合蛋白的结合，但是蓝光的不良穿透深度限制了其在深层组织刺激中的应用。尽管通过经由其他设备（ 例如，光纤）传递光线已经实现了这种刺激，但是这些方法是侵入性的。可以通过两种方式来解决这个问题：通过使用响应较长波长的蛋白质对（ 例如，植物色素-PIF6蛋白对）或通过使用双光子激发。这两种方法都可以提供深入的但是他们可能遭受其他限制。例如，PhyB-PIF6对需要合成辅因子起作用，双光子显微镜需要昂贵的仪器。 CRY2-CIBN相互作用中缺乏可调性是另一个限制。野生型CRY2自发地从CIBN中解离，在黑暗中半衰期为5.5分钟。取决于目标信号通路的动力学，缩短或延长的解离半衰期可能是优选的。已经进行了CRY2的突变，其可以将解离半衰期缩短至2.5分钟（W349R）或将其延长至24分钟（L348F） 46 。或者，基于真菌受体Vivid（VVD）和p / nMagFast1和2的工程化可光活化蛋白质对分别显示4.2分钟和25秒的解离半衰期。在该方案中，野生型CRY2-CIBN蛋白质对在光照条件的5分钟内开启MAPK通路在哺乳动物细胞中，活动在30分钟内在非洲爪蟾胚胎35中在44和1-2小时内恢复到基础水平。对于空间控制，共焦显微镜可以将蓝色激光器聚焦到图像平面中约200nm的衍射极限点的尺寸。通过调整配备有非相干光源的表面照相显微镜中的场图的大小，可以将照明尺寸限制为直径约10μm。这两种方法都应该能够实现细胞培养物中的光遗传刺激的亚细胞控制。
光遗传学能够以高空间和时间分辨率可逆地询问信号转导的能力为研究活细胞内动态细胞内信号传导提供了一个全新的机会。该方案的结果显示，Raf1激活主要是PC诱导神经元分化的主要原因12细胞44 。同样的途径也导致在开发非洲爪蟾胚胎时形成二次尾状结构。通过控制Raf1激活的时间，可以在胚层形成阶段后诱导尾状结构35 。最近描述的LOVTRAP方法利用两种工程改造的蛋白质Zdark和LOV2，其仅在黑暗中选择性地结合以调节光诱导的感兴趣蛋白质（POI） 48的解离。不同于在这种方法中使用的光介导的蛋白质 - 蛋白质关联，LOVTRAP使用光诱导蛋白质解离。这种新的方式在调节活细胞中的蛋白质定位和活性方面更加灵活。通过仔细选择信号级联中的激活模式，可以以非常规方式解剖信号转导。例如，可以激活没有l的受体酪氨酸激酶配体受体结合49或诱导配体诱导信号级联的子集44 。这里报道的策略可以推广到控制其他激酶，如Akt 39和GTP酶（ 如 Rho GTPase），其激活状态也可以通过蛋白质易位开启。光合遗传学将继续应用于活细胞生物体，最近的着作主要是在果蝇 50 ，斑马鱼51,52,53,54和非洲爪蟾胚胎35中对蛋白质定位和信号进行光遗传控制。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者宣称他们没有竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作得到伊利诺伊大学厄瓜多尔香槟分校（UIUC）和美国国立卫生研究院（NIGMS R01GM111816）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass coverslip | VWR | 48393 230 | Substrate for live cell imaging |
| Coverslip holder | Newcomer Supply | 6817B | Holder for coverslips |
| Detergent | ThermoFisher | 16 000 104 | For cleaning coverslips |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768-500G | For making PLL buffer |
| Disodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 71996-250G | For making PLL buffer |
| Plastic beaker | Nalgene | 1201-1000 | For cleaning coverslips |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465-2.5KG | For adjust pH |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1274-500MG | For coating coverslip |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC)-Treated Water | ThermoFisher Scientific | 750024 | For DNA preparation |
| Cover Glass Forceps | Ted Pella | 5645 | Cover glass handling |
| Tissue cutlure dish | Thermofisher | 12565321 | Cell culture dish |
| Sterile centrifuge tubes | ThermoFisher | 12-565-271 | Buffer storage |
| Transfection Reagent | ThermoFisher | R0534 | Transfection |
| CO2-independent medium | ThermoFisher | 18045088 | For live cell imaging |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Form make cell chamber |
| Plasmid Maxiprep kit | Qiagen | 12965 | Plasmid preparation |
| DMEM medium | ThermoFisher | 11965-084 | Cell culturing medium component |
| F12K medium | ThermoFisher | 21127022 | Cell culturing medium component |
| Horse serum | ThermoFisher | 16050122 | Cell culturing medium component |
| Fetal Bovine Serum | Signa-Aldrich | 12303C-500 mL | Cell culturing medium component |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | ThermoFisher | 10378016 | Cell culturing medium component |
| Trypsin (0.25%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 15050065 | For mammalian cell dissociation |
| Agarose | Fisher Scientific | BP1356-100 | For DNA preparation |
| Ficoll PM400 | GE Heathcare Life Sciences | 17-5442-02 | For embryo buffer |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | 1.02839.0025 | Oocyte preparation |
| ApaI | ThermoFisher | FD1414 | For linearization of plasmids |
| Dnase I | ThermoFisher | AM2222 | For removing DNA template in the in vitro transcription assay |
| Index-match materials (immersion oil) | Thorlabs | MOIL-20LN | For matching the index between sample substrate and objective |
| Blue LED | Adafruit | 301 | Light source for optogenetic stimulation |
| Resistor kit | Amazon | EPC-103 | current-limiting resistor |
| Aluminum boxes | BUD Industries | AC-401 | light box |
| BreadBoard | Jekewin | 837654333686 | For making LED array |
| Hook up Wire | Electronix Express | 27WK22SLD25 | For making LED array |
| Relay Module | Jbtek | SRD-05VDC-SL-C | For intermittent light control |
| DC Power Supply | TMS | DCPowerSupply-LW-(PS-305D) | Power supply for LED |
| Silicon Power Head | Thorlabs | S121C | For light intensity measurement |
| Power meter | Thorlabs | PM100D | For light intensity measurement |
| Microscope | Leica Biosystems | DMI8 | For live cell imaging |
| BioSafety Cabinet | ThermoFisher | 1300 Series A2 | For mammalian cell handling |
| CO2 incubator | ThermoFisher | Isotemp | For mammalian cell culturing |
| Stereo microscope | Leica | M60 | For embryo micro-manipulation |
| Microinjector | Narishige | IM300 | For embryo microinjection |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P87 | Needle puller |
| in vitro transcription kit | ThermoFisher | AM1340 | For in vitro transcription. The kit includes nuclease-free water, SP6 RNA Polymerase, ribonucleotide mixture, cap analog, lithium choride precipitation solution, and spin column |
| RNA purfication kit | Qiagen | 74104 | Silica-membrane spin column for purification of synthesized RNA |
| Convection oven | MTI corporation | EQ-DHG-9015 | PDMS curing |
| Centrifugal mixer and teflon container | THINKY | AR310 | For mixing PDMS |
| Silicon wafer | UniversityWafer | 452 | Base for making PDMS devices |
| Blade | Techni Edge | 01-801 | For cutting PDMS |
| Capillary glass | Sutter Instruments | BF100-58-10 | For fabrication of injecting needles. |
References
- Schlessinger, J., Ullrich, A. Growth factor signaling by receptor tyrosine kinases. Neuron. 9 (3), 383-391 (1992).
- Thisse, B., Thisse, C. Functions and regulations of fibroblast growth factor signaling during embryonic development. Dev Biol. 287 (2), 390-402 (2005).
- Perrimon, N., Pitsouli, C., Shilo, B. Z. Signaling mechanisms controlling cell fate and embryonic patterning. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (8), a005975 (2012).
- Salles, F. H., et al. Mental disorders, functional impairment, and nerve growth factor. Psychol Res Behav Manag. 10, 9-15 (2017).
- Basson, M. A. Signaling in cell differentiation and morphogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (6), (2012).
- Schohl, A., Fagotto, F. beta-catenin, MAPK and Smad signaling during early Xenopus development. Development. 129 (1), 37-52 (2002).
- Zhang, S. W., Li, J. J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signalling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis. PloS one. 8 (11), e79469 (2013).
- Sweeney, C., et al. Growth factor-specific signaling pathway stimulation and gene expression mediated by ErbB receptors. J Biol Chem. 276 (25), 22685-22698 (2001).
- Marshall, C. J. Specificity of receptor tyrosine kinase signaling: transient versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation. Cell. 80 (2), 179-185 (1995).
- Vandergeer, P., Hunter, T., Lindberg, R. A. Receptor Protein-Tyrosine Kinases and Their Signal-Transduction Pathways. Annu Rev Cell Biol. 10, 251-337 (1994).
- Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
- Hunter, T. Signaling--2000 and beyond. Cell. 100 (1), 113-127 (2000).
- Qiu, M. S., Green, S. H. PC12 cell neuronal differentiation is associated with prolonged p21ras activity and consequent prolonged ERK activity. Neuron. 9 (4), 705-717 (1992).
- Ji, Y., et al. Acute and gradual increases in BDNF concentration elicit distinct signaling and functions in neurons. Nat Neurosci. 13 (3), 302-309 (2010).
- Luby-Phelps, K. Cytoarchitecture and physical properties of cytoplasm: volume, viscosity, diffusion, intracellular surface area. Int Rev Cytol. 192, 189-221 (2000).
- Sauer, B. Inducible gene targeting in mice using the Cre/lox system. Methods-a Companion to Methods in Enzymology. 14 (4), 381-392 (1998).
- Ling, M. M., Robinson, B. H. Approaches to DNA mutagenesis: an overview. Anal Biochem. 254 (2), 157-178 (1997).
- Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. Animal transgenesis: an overview. Brain Struct Funct. 214 (2-3), 91-109 (2010).
- Wanka, F., et al. Tet-on, or Tet-off, that is the question: Advanced conditional gene expression in Aspergillus. Fungal Genet Biol. 89, 72-83 (2016).
- Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nat Biotechnol. 28 (7), 743-747 (2010).
- Liu, Q. Y., Deiters, A. Optochemical Control of Deoxyoligonucleotide Function via a Nucleobase-Caging Approach. Accounts of Chemical Research. 47 (1), 45-55 (2014).
- Arbely, E., Torres-Kolbus, J., Deiters, A., Chin, J. W. Photocontrol of tyrosine phosphorylation in mammalian cells via genetic encoding of photocaged tyrosine. J Am Chem Soc. 134 (29), 11912-11915 (2012).
- Gautier, A., Deiters, A., Chin, J. W. Light-activated kinases enable temporal dissection of signaling networks in living cells. J Am Chem Soc. 133 (7), 2124-2127 (2011).
- Nguyen, D. P., et al. Genetic Encoding of Photocaged Cysteine Allows Photoactivation of TEV Protease in Live Mammalian Cells. J Am Chem Soc. 136 (6), 2240-2243 (2014).
- Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Banghart, M., Borges, K., Isacoff, E., Trauner, D., Kramer, R. H. Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing. Nat Neurosci. 7 (12), 1381-1386 (2004).
- Zhang, K., Cui, B. Optogenetic control of intracellular signaling pathways. Trends in Biotechnology. 33 (2), 92-100 (2015).
- Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (8), 551-558 (2014).
- Kim, B., Lin, M. Z. Optobiology: optical control of biological processes via protein engineering. Biochemical Society Transactions. 41 (5), 1183-1188 (2013).
- Tucker, C. L. Manipulating cellular processes using optical control of protein-protein interactions. Prog Brain Res. 196, 95-117 (2012).
- Toettcher, J. E., Gong, D. Q., Lim, W. A., Weiner, O. D. Light Control of Plasma Membrane Recruitment Using the Phy-Pif System. Method Enzymol. 497, 409-423 (2011).
- Zoltowski, B. D., Gardner, K. H. Tripping the light fantastic: blue-light photoreceptors as examples of environmentally modulated protein-protein interactions. Biochemistry. 50 (1), 4-16 (2011).
- Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nat Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
- Krishnamurthy, V. V., et al. Reversible optogenetic control of kinase activity during differentiation and embryonic development. Development. 143 (21), 4085-4094 (2016).
- Liu, H., et al. Photoexcited CRY2 Interacts with CIB1 to Regulate Transcription and Floral Initiation in Arabidopsis. Science. 322 (5907), 1535-1539 (2008).
- Li, X., et al. Arabidopsis cryptochrome 2 (CRY2) functions by the photoactivation mechanism distinct from the tryptophan (trp) triad-dependent photoreduction. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20844-20849 (2011).
- Leevers, S. J., Paterson, H. F., Marshall, C. J. Requirement for Ras in Raf Activation Is Overcome by Targeting Raf to the Plasma-Membrane. Nature. 369 (6479), 411-414 (1994).
- Kohn, A. D., Takeuchi, F., Roth, R. A. Akt, a pleckstrin homology domain containing kinase, is activated primarily by phosphorylation. J Biol Chem. 271 (36), 21920-21926 (1996).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6 (4), e18556 (2011).
- Ishimura, A., et al. Oncogenic Met receptor induces ectopic structures in Xenopus embryos. Oncogene. 25 (31), 4286-4299 (2006).
- Zhang, K., et al. Light-Mediated Kinetic Control Reveals the Temporal Effect of the Raf/MEK/ERK Pathway in PC12 Cell Neurite Outgrowth. PloS one. 9 (3), e92917 (2014).
- Mohanty, S. K., Lakshminarayananan, V. Optical Techniques in Optogenetics. J Mod Opt. 62 (12), 949-970 (2015).
- Taslimi, A., et al. Optimized second-generation CRY2-CIB dimerizers and photoactivatable Cre recombinase. Nature chemical biology. 12 (6), 425-430 (2016).
- Kawano, F., Suzuki, H., Furuya, A., Sato, M. Engineered pairs of distinct photoswitches for optogenetic control of cellular proteins. Nat Commun. 6, 6256 (2015).
- Wang, H., et al. LOVTRAP: an optogenetic system for photoinduced protein dissociation. Nat Methods. 13 (9), 755-758 (2016).
- Chang, K. Y., et al. Light-inducible receptor tyrosine kinases that regulate neurotrophin signalling. Nat Commun. 5, 4057 (2014).
- Boulina, M., Samarajeewa, H., Baker, J. D., Kim, M. D., Chiba, A. Live imaging of multicolor-labeled cells in Drosophila. Development. 140 (7), 1605-1613 (2013).
- Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, C. Optogenetic control of transcription in zebrafish. PLoS One. 7 (11), e50738 (2012).
- Buckley, C. E., et al. Reversible Optogenetic Control of Subcellular Protein Localization in a Live Vertebrate Embryo. Dev Cell. 36 (1), 117-126 (2016).
- Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature chemical biology. 10 (3), 196-202 (2014).
- Beyer, H. M., et al. Red Light-Regulated Reversible Nuclear Localization of Proteins in Mammalian Cells and Zebrafish. ACS Synth Biol. 4 (9), 951-958 (2015).
