Summary
Hier war die Macht der ein Transposon-vermittelten zufällige einführen eines nicht-kodierende DNA-Elements verwendet, um seine optimale chromosomalen Position zu lösen.
Abstract
Die optimale chromosomalen Position(en) eines bestimmten DNA-Elements war/waren bestimmt durch Transposon-vermittelten zufällige Einblendung gefolgt von Fitness-Auswahl. In Bakterien kann die Auswirkungen der genetischen Kontext auf die Funktion eines genetischen Elements schwer abzuschätzen sein. Mehrere Mechanismen, einschließlich topologische Effekte, transkriptionelle Interferenz von benachbarten Gene und/oder Replikation-assoziierten Gen Dosierung, können die Funktion eines bestimmten genetischen Elements beeinflussen. Hier beschreiben wir eine Methode, die erlaubt die zufällige Integration eines DNA-Elements in das Chromosom von Escherichia coli und wählen Sie die günstigsten Standorten mit einem einfachen Wachstum Wettbewerb zu experimentieren. Die Methode nutzt eine gut beschriebene Transposon-basiertes System der zufällige Insertion, gepaart mit einer Auswahl an der stärkeren Clone(s) von Wachstum nutzen, ein Verfahren, das auf experimentelle Bedürfnisse leicht einstellbar ist. Die Art der fitteste Clone(s) kann durch ganze Genomsequenzierung auf eine komplexe Multi-klonale Population oder einfach zu Fuß für die schnelle Identifizierung von ausgewählten Klonen gen bestimmt werden. Hier war die nicht-kodierenden DNA-Region DARS2, die die Initiation der Replikation der Chromosomen in E. Colikontrolliert, als Beispiel verwendet. Die Funktion des DARS2 ist bekannt durch Replikation-assoziierten Gen Dosierung beeinträchtigt werden; der engere DARS2 ruft nach der Herkunft der DNA-Replikation, desto aktiver wird es. DARS2 wurde nach dem Zufallsprinzip in das Chromosom ein DARS2eingefügt-Belastung gelöscht. Die daraus resultierende Klone mit einzelnen Einfügungen wurden gebündelt und für Hunderte von Generationen gegeneinander konkurrierten. Schließlich wurden die fittesten Klone gekennzeichnet und festgestellt, dass DARS2 eingefügt in unmittelbarer Nähe zu den Originalschauplätzen der DARS2 enthalten.
Introduction
Durch seine Lage im Genom kann die Funktion eines genetischen Elements beeinträchtigt werden. In Bakterien ergibt sich somit vor allem vor Störungen durch die Transkription des benachbarten Gene, lokalen DNA Topologie und/oder Replikation-assoziierten Gen Dosierung. Insbesondere die Prozesse der DNA-Replikation und Segregation gesteuert werden, mindestens im Teil, durch nicht-kodierenden chromosomalen Regionen1und die ordnungsgemäße Funktion dieser Regionen hängt genomische Position/Kontext. In e. coli, Beispiele sind die Dif -Standort, erforderlich für Schwester Chromosom Auflösung2; KOPS-Sequenzen, erforderlich für Chromosom Abtrennung3; Daten, DARS1und DARS2 Regionen, für die ordnungsgemäße chromosomale Replikation Steuerung (unten; ( 4). präsentieren wir Ihnen eine Methode, für die zufällige Umzug, Auswahl und Bestimmung der optimalen genetischen Kontext eines bestimmten genetischen Elements, hier veranschaulicht durch das Studium der DARS2 nicht-kodierende Region.
In E. Coli, DnaA ist der Initiator Protein verantwortlich für DNA-Strang Eröffnung um einzelne Replikation HerkunftoriC, und für die Einstellung von der Helikase DnaB5,6,7. DnaA gehört zu den AAA+ (d. h. ATPasen verbunden mit vielfältigen Aktivitäten) Proteine und ATP und ADP zu binden mit ähnlich hohen Affinitäten5. Das Niveau der DnaAATP peaks bei Einleitung8, wo DnaAATP bildet ein Multimer auf oriC auslöst, die DNA duplex Öffnung9. Nach der Einleitung oriC erfolgt durch einen Mechanismus mit der Bindung des Proteins SeqA Hemimethylated vorübergehend nicht verfügbar für Wiederaufnahme wegen Sequestrierung oriC10,11. Während der Sequestrierung, sinkt das Niveau der DnaAATP durch mindestens zwei Mechanismen: die regulatorischen Inaktivierung der DnaA (RIDA)12,13 und Daten-abhängige DnaAATP Hydrolyse (Gefässwiderstand)14 ,15. RIDA und Gefässwiderstand fördern die Umwandlung von DnaAATP zuADPDnaA. Vor einer neuen Runde der Initiation, DnaAADP wird wieder aktiviert, DnaAATP bei bestimmten DnaA-Reaktivierung Sequenzen (DARS): DARS1 und DARS216,17. Die chromosomalen Daten, DARS1und DARS2 Regionen sind nicht-kodierende und Handeln in einem Chaperon-Manier zu modulieren, DnaAATP/DnaAADP fußenden. Diese Regionen außerhalb der Ursprung der Replikation, ermöglichen der Montage von einem komplexen DnaA für entweder die Inaktivierung (Daten, 14) oder Aktivierung (DARS1 und DARS2; 17) der DnaA. DARS2 in einer Zelle löschen, ändert nicht Masse Verdoppelung Zeit aber Ergebnisse asynchroner Replikation Einleitung15,16,18. Jedoch DARS2-mangelhafte Zellen haben eine Fitness Kosten im Vergleich zu einer ansonsten isogenen Wildtyp, während beide kontinuierliches Wachstum Wettbewerb im Reich Medium oder die Einrichtung der Besiedlung im Darm Maus18. Dies bedeutet, dass bereits geringe Veränderungen Asynchronie/Herkunft Konzentration wirkt sich negativ auf die bakterielle Fitness haben. In E. Coligibt es einen Selektionsdruck auf Chromosom Symmetrie (d. h. zwei fast gleich lang Replikation Arme)19pflegen. Daten, DARS1und DARS2 Regionen haben den gleichen relativen Abstand zu oriC in alle E. Coli Stämme18, trotz großen Schwankungen in der Größe von Chromosom sequenziert.
Hier verwenden wir die DARS2 Region von E. Coli als Beispiel für die Identifizierung von der chromosomalen Position(en) optimal für seine Funktion. DARS2 wurde in das Transposon NKBOR und die daraus resultierende NKBOR eingefügt::DARS2 Transposon anschließend nach dem Zufallsprinzip eingefügt in das Genom der MG1655 ΔDARS2. Wir erzeugt somit eine Ansammlung von Zellen, jede besitzen DARS2 platziert an einem anderen Ort auf dem Chromosom. Ein in-vitro- Wettbewerb Experiment, wo alle Zellen in der Auflistung wurden gebündelt und während des kontinuierlichen Wachstums in LB für eine geschätzte 700 Generationen gegeneinander angetreten, wurde durchgeführt. Das Ergebnis des Experiments Wettbewerb wurde überwacht/ermittelt mithilfe von südlicher Fleck, leicht gen zu Fuß und Sequenzierung des gesamten Genoms (WGS; ( Abbildung 1). Endpunkt-Klone zu Fuss leicht gen gelöst waren gekennzeichnet durch Durchflusszytometrie, Zellzyklus Parameter zu bewerten. In einer durchflusszytometrischen Analyse können die Zellengröße, DNA-Gehalt und Einleitung Synchronität für eine große Anzahl von Zellen gemessen werden. Während der Durchflusszytometrie, ein Strom von Einzelzellen übergibt einen Lichtstrahl der entsprechenden Wellenlänge die gefärbte DNA begeistern die dann gleichzeitig durch Photomultiplier, die sammeln die emittierte Fluoreszenz, ein gewisses Maß an DNA-Gehalt, registriert ist sofern die Zellen sind für DNA gefärbt. Das vorwärts-verstreut Licht ist ein Maß für die Zelle Masse20.
Die in-vitro- Wettbewerb Experiment, das wir hier vorstellen wird verwendet, um Fragen in Bezug auf die Bedeutung der chromosomalen Position und genomische Kontext des genetischen Elements. Die Methode ist neutral und einfach zu bedienen.
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Protocol
1. Sammlung der Bibliothek Transposon
Hinweis: die chromosomale Locus DARS2 wurde in die Mini Tn 10 geklont-basierte Transposon, NKBOR (auf pNKBOR) 21, was zu NKBOR:: DARS2 (pJFM1). pNKBOR erhalten Sie Online- 22. pNKBOR ist ein R6K-basierte Selbstmord-Vektor, der Initiator Protein π für Replikation 23 erfordert. Plasmid pJFM1 ist daher in der Lage, in einer E. Coli-Stamm (z. B. Dh5α λ Pir) mit einer chromosomalen Kopie des Gens Pir zu replizieren. Jedoch wenn der Pir-defizienten Wildtyp MG1655 pJFM1 verwandelt, pJFM1 kann nicht replizieren, zur Auswahl von Kanamycin-resistente Klone erzeugt durch die zufällige Einfügungen von NKBOR:: DARS2 in das bakterielle Chromosom. Der Einfachheit halber werden diese als DARS2 Einfügungen bezeichnet. Siehe Abbildung 1 für eine schematische Darstellung der Methodik.
- Bereiten Electrocompetent MG1655 Δ DARS2 von der aktiv wachsenden Zellen in Lysogeny Brühe (LB) bei 37 ° C 24 gewachsen.
- Electroporate pJFM1 in Electrocompetent MG1655 Δ DARS2, laut Gonzales Et Al. 24
- add 1 µg der pJFM1 (in 1 µL Wasser) bis 40 µL Electrocompetent E. Coli MG1655 Δ DARS2 und übertragen Sie diese Mischung auf eine Küvette vorgekühlt, sterilen 0,2 cm Lücke. Legen Sie die Küvette in die Elektroporation Kammer. Electroporate mit 18 kV, 500 Ω und 25 µF; die Zeitkonstante sollte ~5.0 ms, und keine Lichtbögen auftreten sollten.
- Schnell die Bakteriensuspension wiederherstellen, indem Sie es in 1 mL vorgewärmten LB Brühe und Transfer zum 15 mL Reagenzglas resuspending.
- Lassen die Zellen durch Inkubation unter belüftete Wachstumsbedingungen bei 37 ° C für 30 min, ohne Antibiotika Auswahl wiederherstellen. Die Bakterien auf LB-Agar-Platten ergänzt mit 50µg/mL Kanamycin-Platte und über Nacht bei 37 ° C inkubieren.
- Zählen die Kolonien aus der Elektroporation: eine Kolonie gilt gleich einem chromosomalen Transposon einfügen.
Hinweis: Kolonien nach Augenmaß oder mit einer Kolonie Zähler gezählt werden können. Die Anzahl der Kolonien ist umgekehrt proportional zu den durchschnittlichen Abstand zwischen der Transposons befindet sich im Chromosom von jeder Klon. - Add 1 mL LB Brühe zu jeder Platte und alle Kolonien abwaschen; 1 mL LB Brühe sollte ausreichen, um ~ 100.000 Kolonien abwaschen. Die Wiederverwendung der gleichen 1 mL LB Brühe, die bakterielle Konzentration zu erhöhen. Bündeln Sie alle Kolonien in der gleichen 50 mL Tube.
- Wirbel der Röhre und frieren die Start-Material (t = 0). Um es zu fixieren, verrühren Sie 1 mL Zellsuspension mit 1 mL 50 % Glycerin auf Eis. Übertragen Sie die Rohre um Trockeneis für 10 min. Einmal die Kulturen gefroren sind, übertragen Sie sie auf einem-80 ° C Gefrierschrank.
Hinweis: Eine Zellkonzentration von mindestens 50.000 KBE/mL wird bei diesem Schritt erwartet.
2. Wettbewerb-Experiment in LB
- Tauwetter Transposon-Bibliothek von-80 ° C auf dem Eis. Mix von pipettieren.
- Transfer 100 µL der Transposon-Bibliothek zu 10 mL LB im Reagenzglas 15 mL.
- Wachsen die Zellen, belüftet durch kontinuierliche schütteln (250 u/min), für 8 h bei 37 ° C, stationäre Phase (d. h. OD 600 = ~ 4.0). Diese Parameter zu verschiedenen Wachstumsbedingungen wie gewünscht anpassen.
- Propagieren der Bakterienpopulation durch kontinuierlichen Transfers in frisch vorgewärmte Medium jeder ~ 10 Generationen. Zu diesem Zweck auf 10 mL frisches LB 10 µL der vorherigen stationären Phase Kultur übertragen und wachsen für eine weitere 8 h an der stationären Phase (d. h. OD 600 = ~ 4.0).
Hinweis: Da die Start- und Endzeiten optische Dichte sind die gleichen, 1,000-fold Verdünnung entspricht ~ 10 Generationen von Wachstum (2 10 = 1.024). Der Bakterienpopulation kann entweder direkt in frisch vorgewärmte Medium weitergegeben oder gespeichert bei 0-4 ° C (auf Eis) und am Folgetag propagiert. LB wurde hier verwendet, um möglichst viele zelluläre Verdoppelungen in kurzer Zeit wie möglich (Verdopplungszeit in der Nähe von 22 min.) zu gewährleisten. - Nach jeweils 100 Generationen des Wettbewerbs sparen fünf 1-mL-Proben bei-80 ° C (wie in Schritt 3.3 beschrieben).
- Wenn die Fitness-Unterschiede zwischen den Zellen mit einzelnen Transposon Einfügungen klein sein sollen, halten Sie die Dauer des Wettbewerbs lange; hier 700 Generationen (t = 700) dienten.
3. Southern-Blot Analyse, Experiment über Wettkampfzeit zu überwachen
- bereiten die Sonde für die südlichen Fleck (1-kb-Abschnitt von der NKBOR) durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Amplifikation mit spezifischen Primer durchführen: NKBOR_Probe_FW : Gatgttggacgagtcggaat und NKBOR_Probe_RV: Cgttacatccctggcttgtt.
- Inkubation bei 98 ° C für 30 s für erste Denaturierung. Führen Sie dann 35 Zyklen bei 98 ° C für 10 s, 60 ° C für 30 s und 72 ° C für 45 s. Verwenden Sie für die letzte Erweiterung, 72 ° C für 10 min.
Hinweis: Die Vorlage für die PCR-Reaktion war ein gereinigtes pNKBOR Plasmid 21. - Kennzeichnen die resultierende PCR-Fragment mit [α - 32P] dATP mit der zufälligen Primer-System nach Smith 25.
- Inkubation bei 98 ° C für 30 s für erste Denaturierung. Führen Sie dann 35 Zyklen bei 98 ° C für 10 s, 60 ° C für 30 s und 72 ° C für 45 s. Verwenden Sie für die letzte Erweiterung, 72 ° C für 10 min.
- Vorbereitung der gesamten zelluläre DNA nach Løbner-Olesen und von Freiesleben 26 für t = 0 und ausgewählten Zeitpunkten bis t = 700 Generationen des Wettbewerbs geschätzt.
- Verdauen die totale zelluläre DNA mit Pvu I, der schneidet die NKBOR mit der Region von Interesse einmal nur in einer Region nicht durch die Sonde abgedeckt; 1 Einheit der Pvu ich kann verwendet werden, um vollständig verdauen 1 µg Substrat DNA.
Hinweis: Die Sonde erkennt Fragmente mit einem Teil das Transposon, zusammen mit chromosomaler DNA verschiedener Längen, je nach der Insertionsstelle. - Führen einen südlichen Fleck mit einer 0,7 % Agarosegel nach Løbner-Olesen und von Freiesleben 26.
4. Identifikation der fitteste Klone
- Gebrauch leicht gen gehen, wie von Harrison Et Al. beschrieben 27, DARS2 Einfügung Websites aus einzelnen Klone (isoliert auf LB-Platten) nach 700 geschätzte Generationen des Wettbewerbs zu identifizieren; Weitere Bands auf der Southern-Blot, die weitere Isolate sind erforderlich, um alle Transposon Einfügungen decken.
- Isolierung genomischer DNA für PCR-Vorlage. Bakterien auf eine LB-Agar-Platte mit 50 µg/mL Kanamycin verteilen und über Nacht bei 37 ° C inkubieren. Wachsen einzelne Kolonien über Nacht in LB Brühe bei 37 ° C und anschließend übertragen 20 µL in 200 µL autoklaviert destilliertes Wasser (oder verwendet DNA Reinigung, wie in Schritt 3.2).
- Vortex mischen. Erhitzen Sie die Mischung bei 100 ° C für 10 min und Zentrifuge mit max. Geschwindigkeit für 5 min. die Zelle lysate bei-20 ° C für eine spätere Verwendung speichern.
- Design drei verschachtelte Primer zu Tempern in das Transposon Wahl (siehe Abbildung 2 für eine grafische Darstellung der PCR-Strategie).
Hinweis: Nested Primer entwerfen sollten sicherstellen, dass verschachtelte Primer 3 am nächsten an die bekannten 5 liegt ' Ende das Transposon DNA, gefolgt von Nested Primer 2 und 1. Der Abstand zwischen den Nested Primer 3 und die 5 ' Ende des bekannten tRansposon DNA sollte ausreichend für eine Sequenz durchlesen von der bekannten DNA an die unbekannten DNA (um die spezifische chromosomale Transposon Einstichstelle zu finden). Für NKBOR wurden die folgenden verschachtelten Primer verwendet: pNKBOR_Nested3_RV: Gcagggctttattgattcca, pNKBOR_Nested2_RV: Tcagcaacaccttcttcacg, und pNKBOR_Nested1_RV: Actttctggctggatgatgg. Zufällige Zündkapseln, die mit der Anerkennung-Standorten der bekannten Restriktionsenzyme werden auch benutzt. Um ein Ergebnis zu erzielen, sollte man mindestens zwei verschiedene zufällige Primer verwenden. Die Restriktionsschnittstellen für die Restriktionsenzyme (e.g.,Sau 3AI und Hin dIII) sollte am 3 gefunden werden ' beenden und vorangegangen durch zehn zufällige Basen 5 ' - NNNNNNNNNNGATC - 3 ' und 5 ' - NNNNNNNNNNAAGCTT - 3 ' sind die Primer mit einer Sau 3AI Website (GATC) und einer Hin-dIII-Website (AAGCTT), bzw., wo N = A, T, G oder c - Einsatz 200 ng genomic DNA in einem 20-µL-PCR-Reaktion. Inkubation bei 98 ° C für 30 s für die ursprünglichen Denaturierung. Führen Sie 25 Zyklen bei 98 ° C für 30 s, 50 ° C für 15 s und 72 ° C für 4 Minuten. Verwenden Sie für die letzte Erweiterung 72 ° C für 10 min. Einsatz Primer Paare bestehend aus Nested Primer 1 und eines zufälligen Primern.
- Grundierung Paare bestehend aus Nested Primer 2 und die gleichen zufällige Grundierung aus die zweite Verstärkung, mit 1 µL seine frühere Reaktion als Vorlage verwenden.
- Wiederholen Sie Schritt 4.1.4 mit Primer-Paaren bestehend verschachtelt Primer 3 und der gleichen zufällige Primer.
- Führen die Produkte von der endgültigen PCR-Reaktion auf eine 1,5 % Agarosegel und Fleck mit Interkalation Bromid. Schneiden Sie eine Band im Bereich von 100-800 bp und isolieren die DNA mit Hilfe kommerzieller DNA-Gel extrahieren Kit nach Angaben des Herstellers ' s-Richtung. Die DNA in 15 µL Wasser Aufschwemmen.
Hinweis: Vorsicht. Interkalation Bromid ist giftig und muss mit Vorsicht behandelt werden. - Sequenz die Band isoliert im vorherigen Schritt (Schritt 4.1.6) mit Nested Primer 3 als Sequenzierung Primer, mit Sanger-Sequenzierung bei einem kommerziellen Anbieter.
- Isolierung genomischer DNA für PCR-Vorlage. Bakterien auf eine LB-Agar-Platte mit 50 µg/mL Kanamycin verteilen und über Nacht bei 37 ° C inkubieren. Wachsen einzelne Kolonien über Nacht in LB Brühe bei 37 ° C und anschließend übertragen 20 µL in 200 µL autoklaviert destilliertes Wasser (oder verwendet DNA Reinigung, wie in Schritt 3.2).
- Durchführen WGS.
- Durchführen WGS auf die gesamte DNA extrahiert aus ausgewählt Proben während des Wettbewerbs-Experiment, wie beschrieben durch Frimodt-Møller Et Al 4.
- Sequenzierung Analyse.
- Align gepaart-Ende liest bis 150 Ns, NKBOR, AF310136.1 1.904 zusammenhängenden … 2.204 mit Bowtie2 28 mit einem Intervall zwischen Saatgut Teilzeichenfolgen (S, 1, 1,15) und eine maximale Anzahl von mehrdeutige Zeichen (L, 0, 0,9).
- Wählen Sie die ausgerichteten liest und dann neu ausrichten, um beide MG1655 Ref | NC_000913.3 und NKBOR gb | AF310136 mit BlastN 29
- weisen Umsetzung einsetzen Positionen an Knotenpunkten MG1655-NKBOR.
5. Flow Cytometry
- Proben für Durchflusszytometrie.
- Balance jeder Kultur indem Sie in der exponentiellen Wachstumsphase seit mindestens zehn Generationen beibehalten. Die OD 600 zu überprüfen und sicherzustellen, dass es nie mehr 0,3 als.
- Erfassen zwei Arten von Flow Proben.
- Für RIF-Rundlauf, 1 mL der Kultur auf eine 15 mL-Tube mit 30 µL der RIF-CEF (300 µg/mL Rifampicin und 36 µg/mL Cephalexin in 12,5 mM NaOH gelöst) übertragen. Lassen Sie es bei 37 ° C für mindestens 4 h schütteln.
Hinweis: Rifampicin blockiert indirekt die Einleitung der Chromosom-Replikation beim laufenden Runden der Replikation weiterhin zur Kündigung zulassen. Cephalexin verhindert die Zellteilung, die Replikation Rundlauf (RIF-Rundlauf) und die Ansammlung von Zellen mit vollständig replizierten Chromosomen führt. Die Anzahl der vollständig replizierten Chromosomen ist gleich der Anzahl der Ursprung zum Zeitpunkt der Behandlung mit Rifampicin und Cephalexin 20. - Für die EXP-Probe, Transfer 1 mL der exponentiell wachsenden Kultur zu einer 1,5-mL-Tube auf Eis.
- Für RIF-Rundlauf, 1 mL der Kultur auf eine 15 mL-Tube mit 30 µL der RIF-CEF (300 µg/mL Rifampicin und 36 µg/mL Cephalexin in 12,5 mM NaOH gelöst) übertragen. Lassen Sie es bei 37 ° C für mindestens 4 h schütteln.
- Die Zellen wie folgt zu beheben. Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 15.000 x g für 5 min bei 4 ° c Aufschwemmen das Pellet in 100 µL eiskalte 10 mM Tris pH 7,5 und fügen Sie 1 mL eiskaltes 77 % Ethanol. Die Proben bei 4 ° C bis zu seiner Verwendung zu speichern.
- Färben die Zellen wie folgt. Ernte 100-300 µL der fixen Zellen durch Zentrifugation bei 15.000 x g für 15 min. entfernen den Überstand und das Pellet in 130 µL Aufschwemmen " DNA-Färbelösung " (90 µg/mL Mithramycin, 20 µg/mL Interkalation Bromid, 10 mM MgCl 2 und 10 mM Tris, pH 7,5). Setzen Sie die Proben auf Eis und im Dunkeln; die Proben sind bereit für Flow-Zytometrie-Analyse nach 10 min
Hinweis: Andere DNA Flecken als Interkalation Bromid und Mithramycin kann auch gebrauchte 30 , 31. - Bestimmen den Ursprung pro Zelle, die relative Zelle Masse und relative DNA-Gehalt von Flow-Zytometrie Analyse.
- Perform Durchflusszytometrie, wie zuvor beschrieben 32. RIF-Rundlauf und EXP-Proben mit dem Flow Cytometer Hersteller laufen ' Anweisungen des . Verwenden Sie für Mithramycin und Interkalation Bromid-gefärbten Zellen, Erregung Wellenlängen 395 und 440 nm und sammeln die Fluoreszenz über 565 nm.
- Die relative Zelle Masse und relative DNA-Gehalt bestimmen die EXP-Proben, Single-Parameter nach vorne-Licht Streuung im Vergleich zu Zelle Nummer Histogramme und Fluoreszenzintensität im Vergleich zu Zelle Nummer Histogramme für mindestens 30.000 Veranstaltungen zu erhalten ausführen entspricht das Mobilfunksignal.
- Einsatz vorwärts verstreut einzelne Parameter Lichtverteilung messen die durchschnittliche Relative Zell-Messe
Hinweis: Nach vorne verteilt Licht ist ein Maß für die durchschnittliche Zelle Masse 20. - Verwendung Fluoreszenz Intensitätsverteilungen Single-Parameter zur Messung der durchschnittlichen DNS Inhalt 20.
- Erhalten die DNA-Konzentration als das Verhältnis der durchschnittlichen DNA-Gehalt auf die durchschnittliche Zelle Masse 20.
- Bestimmen Sie die Anzahl der Ursprünge pro Zelle.
- Run RIF-Rundlauf Proben zu Single-Parameter Fluoreszenzintensität versus Zelle Nummer Histogramme für mindestens 30.000 Veranstaltungen entspricht das Mobilfunksignal.
- Verwendung Fluoreszenz Intensitätsverteilungen Single-Parameter zu bestimmen, die Zahl der Chromosomen in jeder Zelle 20.
- Perform Durchflusszytometrie, wie zuvor beschrieben 32. RIF-Rundlauf und EXP-Proben mit dem Flow Cytometer Hersteller laufen ' Anweisungen des . Verwenden Sie für Mithramycin und Interkalation Bromid-gefärbten Zellen, Erregung Wellenlängen 395 und 440 nm und sammeln die Fluoreszenz über 565 nm.
- Asynchronie-Index (Ai) zu berechnen.
- Berechnen die Ai, wie durch Løbner-Olesen Et Al. beschrieben 32, mit Hilfe der Fluoreszenz einzelner Parameter Intensitätsverteilungen der RIF-Rundlauf Proben und die Formel Ki = (f3 + f5 + f6 + f7) / (f2 + f4 + f8), wo fx ist der Bruchteil Zellen mit x Anzahl der vollständig replizierten Chromosomen. Einweihungen als asynchrone betrachten A > 0.1.
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Representative Results
Ein südlicher Fleck wurde getan, um sicherzustellen, dass DARS2 das Chromosom in der Transposon-Bibliothek nach dem Zufallsprinzip verteilt wurde (t = 0) und, die die stärksten Klonen würde im Laufe der Zeit beibehalten. Der Southern Blot erfolgte auf DNA extrahiert aus dem anfänglichen Transposon-Pool (bei t = 0) und alle geschätzten 100 aus 700 Generationen des Wettbewerbs (Abbildung 3). Hier war die totale zelluläre DNA aus jeden Zeitpunkt verdaut mit der Pvuich Restriktionsenzym bekannt, dass Transposon NKBOR schneiden::DARS2 einmal nur in einer Region, die von der Sonde nicht abgedeckt. Der Southern Blot wurde mit einem radioaktiv markierten DNA-Fragment komplementären Teil des NKBOR sondiert. Wie aus Abbildung 3, die anfänglichen DARS2 Pool (t = 0) es mangelte an unterschiedliche Banden, die zeigt, dass DARS2 nach dem Zufallsprinzip in das Chromosom eingefügt wurde. Im Laufe der Zeit eine Muster entstanden die ersten große Pool an DARS2 Klone in nur einem oder wenigen persistierende DARS2 Klone entstehen (Abbildung 3; t = 0 bis t = 700).
In dem gezeigten Beispiel wurden DARS2 Einfügung Websites aus dem Wettbewerb Experiment durch WGS und zu Fuß leicht Gen identifiziert. Hier wurde WGS zur Einfügung Standorte aus dem Start-Pool (t = 0) und nach 300, 400 und 700 Generationen des Wettbewerbs. Beachten Sie, dass die Berichterstattung in der vorliegenden Tiefe Sequenzierung nicht ausreichend für eine vollständige Zuordnung der Einfügung Websites bei t wurde = 0; Allerdings gibt es eine repräsentative Teilmenge der Gesamtzahl von Insertionen. WGS bestätigt das Southern Blot-Ergebnis (d. h. die Auswahl der fitteste DARS2 Klone), endend mit ca. 98 % aller DARS2 Einfügungen in der Nähe der Wildtyp DARS2 chromosomalen Position (DARS2 Klon-IR und Klon RppH), während die restliche 2 % an anderer Stelle auf dem Chromosom (Abbildung 4 wurden). Dies legt nahe, dass die Wildtyp-Position optimal für DARS2 Funktion ist. Bei t = 400, eine Insertion fand man auf den gegenüberliegenden Arm der Replikation mit einem fast identischen Abstand zu oriC als der Wildtyp DARS2 Position (Abbildung 4), aber diese Einfügung war noch nicht erholt nach 700 Generationen. Also kann nicht Replikation-assoziierten Gen Dosierung die einzige Determinante für optimale Position.
Einfach gen zu Fuß wurde verwendet, um DARS2 Einfügungen Standorte in einzelnen Klone isoliert, nachdem 700 geschätzte Generationen des Wettbewerbs zu identifizieren. Hier wurden die beiden DARS2 Einfügung Websites genannten (DARS2 Klon IR und Klon RppH) identifiziert. Einfach gen zu Fuß war nur auf 20 Klone, und dies erklärt, warum alle DARS2 Einfügungen, Standorte in WGS zugeordnet, nicht waren, erkannt. DARS2-mangelhafte Zellen zeigten sich zuvor zur Replikation in Asynchronie zu initiieren und zu einem geringeren Herkunft Konzentration im Vergleich zu Wildtyp Zellen4,16,17, 18. wir daher Durchflusszytometrie verwendet, um die Synchronität in der Einleitung der DNA-Replikation und zellulären Ursprung Gehalt für die beiden ausgewählten Stämme (DARS2 Klon IR und Klon RppH) zu beheben, die in beiden Fällen zu Wildtyp restauriert wurden Ebenen (Abbildung 5). Ein repräsentatives Beispiel für einen Stamm besitzen eine einzelne Kopie des DARS2 befindet sich in der Terminus wird (Abbildung 5E) angezeigt. Hier, das Vorhandensein eines DARS2 Elements in die Endstation nicht wiederhergestellt werden synchron oder den zellulären Ursprung Inhalt zu Wildtyp-Ebenen, während der ausgewählten DARS2 IR klont und RppH tun.
Abbildung 1 : Methodik Übersicht. Schematische Darstellung der Methodik. Die chromosomale Region DARS2 wird in den Mini Tn10 auf pNKBOR, Erstellen von pJFM1 geklont. pJFM1 verwandelt sich in E. Coli MG1655 ΔDARS2, die eine zufällige Einfügung des DARS2 auslöst Verbindung mit Tn10 auf dem Chromosom des E. Coli MG1655 ΔDARS2. Rund 70.000 Klone, die jeweils einer unterschiedlichen chromosomalen DARS2 Einfügung wurden gebündelt und gegeneinander direkt in LB Brühe bei 37 ° C. Die direkte Konkurrenz-Experiment in LB Brühe wurde für eine geschätzte 700 Generationen durchgeführt wo wurde eine Probe für jede 100 Generationen von direkter Konkurrenz isoliert. Der gesamte-DNA wurde jede einzelne Probe entnommen und von WGS für Southern blotting und die Identifizierung von DARS2 Einfügungen verwendet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Grafische Darstellung des Gehens einfach gen. Die folgende Abbildung zeigt eine genomische DNA-Vorlage einer unbekannten DNA-Sequenz angrenzend an einer bekannten Sequenz mit Grundierung Websites für zufällige Grundierung und Nested Primer 1, 2 und 3. Im folgenden werden die Ergebnisse der drei aufeinanderfolgenden Vergrößerungen durchgeführt unter Verwendung der drei gestaltete verschachtelten Zündkapseln dargestellt. Das Endprodukt (ab Runde 3) sequenziert mit Nested Primer 3. Diese Zahl wurde von Harrison Et al. 27. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Südlicher Fleck sondiert für NKBOR. Südlicher Fleckanalyse der DARS2 Einfügungen in eine DARS2-mangelhafte Belastung. Genomische DNA extrahiert aus jeder ~ 100 Generationen direkten Wettbewerb, ab t = 0 und endet bei 700 Generationen wurden mit Pvuich verdaut und Gel-fraktioniert. Der Fleck war hybridisiert mit einer NKBOR Sonde (siehe Protokoll). t gibt die Anzahl von Generationen von Wettbewerb. Diese Zahl wurde von Frimodt-Møller Et al. 4. HMW und LMW sind hochmolekulare und niedermolekulare Gewicht DNA. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Grafische Darstellung der ResolvEd Transposon Einfügungen Standorte in ΔDARS2. Die Positionen der oriC, Daten, DARS1, DARS2, und TerC werden angezeigt. DARS2 Einfügung Standorte in ΔDARS2 bei t = 0 (schwarze Balken), t = 400 (hellblaue Balken), t = 500 (roter Balken) und t = 700 (grüne Balken), gelöst durch voll-Genom-Sequenzierung. Diese Zahl wurde mit DNAPlotter33 und wurde angepasst von Frimodt-Møller Et al. 4. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : Repräsentative Flow Cytometry Histogramme der Transposon Webpages zu Fuss leicht Gen gefunden bei t = 700. Zellen wurden in minimaler Medium AB, ergänzt mit 0,2 % Glucose, 10 µg/mL Thiamin und 0,5 % Casamino Säuren bei 37 ° c gewachsen. Wildtyp und Δ ergeben sichDARS2 in A und B, beziehungsweise. Derivate der Wildtyp-Stamm MG1655 frei von DARS2 an den ursprünglichen Ort und tragen stattdessen eine Kopie der DARS2 bei gelöst Transposon Website RrpH, IR und der Endstation (TerC) erscheinen in C, D und E, bzw.. Diese Zahl wurde von Frimodt-Møller Et al. 4 , eine DARS2 Lage zu zeigen, das Ergebnis ist ein Zellzyklus-Anomalie (TerC) oder das Wiederherstellen des Wildtyp Phänotyps(RrpH, IR). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Die hier verwendete Methodik nutzt State-of-the-Art Techniken, eine schwierige Frage in Bezug auf die optimale genomische Position eines genetischen Elements zu beantworten. Die zufällige Aufnahme des genetischen Elements (vermittelt durch das Transposon) ermöglicht die schnelle und einfache Sammlung von Tausenden von Klone, die dann vorgenommen werden kann, wählen für die optimale Position des untersuchten genetischen Elements gegeneinander antreten (d.h. der fitteste Klon).
Hier wurde DARS2 in der Mini-Tn10eingefügt-basierte Transposon, NKBOR. Die Wahl der Transposon ist wichtig für die nachgelagerte Analyse von Einfügungen Websites. Mehrere verschiedene Transposons in unter der Regie von Transposon Insertionsstelle Sequenzierung (TraDIS) Experimente, wie Mini-Tn5Km234 und die bevorzugte Wahl der Himar benutzt worden ich Mariner Transposon35, 36 (für den letzten Beitrag davon, siehe van Opijnen und Camilli36). Unser Ziel war für 70.000 ersten zufälligen Einfügungen von DARS2, etwa eine DARS2 Einfügung verleiht 65 Evert bp im MG1655 Genom. Dies ist leicht einstellbar, durch verringern oder erhöhen die anfänglichen Pool von Kolonien gesammelt.
Hier entschieden wir uns für die kontinuierliche Übertragung in LB Batch Kulturen, aber der Wettbewerb Experiment kann auch durchgeführt werden, in ein anderes Medium oder unter anderen Bedingungen, einschließlich der Verwendung von einem Chemostat37. Darüber hinaus kann das Verfahren angepasst werden alle Bedingungen der Wahl, einschließlich verschiedene Belastungen, wie z.B. oxidativen, osmotische oder Antibiotika Stress. Überprüfen Sie das Vorhandensein von anhaltenden Klone im Laufe der Zeit, kann man mindestens drei Dinge: WGS; Transposon Sequenzierung (Tn-Seq); oder wie hier, ein Southern Blot. Schließlich kann leicht gen zu Fuß auf ein paar Klone mit den weiteren Vorteil durchgeführt werden, dass Transposon Einfügung Websites in einzelnen Klone identifiziert werden, so dass die Wirkung der spezifischen Insertionsstelle phänotypisch analysiert werden kann.
Die Wahl der phänotypischen Assay, das Ergebnis eines Experiments Wettbewerb zu bewerten hängt von der untersuchten Region. Wir verwendeten Durchflusszytometrie, die ist eine leistungsfähige Methode zur Messung der Zellzyklus Parameter von Bakterien. Hier, offenbart Durchflusszytometrie, dass die ausgewählten chromosomalen Position(en) des DARS2, (d. h. die DARS2 Einfügungen in der Wildtyp DARS2 Position der Nähe) die korrekte Regelung der Replikation Einleitung (geführt d.h., Synchronität und DNA-Konzentration). Die optimale chromosomalen Position(en) für DARS2 wurden teilweise durch die ordnungsgemäße Replikation-assoziierten Gen Dosierung und teilweise aufgrund der günstigen lokalen genomische Umgebung, die für DARS2 Funktion4wichtig.
Hier eine nicht-kodierende DNA-Element wurde untersucht, aber dies könnte erweitert werden, um kodierenden Region Wahl. Eine neue Studie fand, daß die Höhe der Genexpression verändert ~ 300-fold, abhängig von seiner Position auf dem Chromosom, ohne klare Korrelation zur Replikation-assoziierten Gen Dosierung38. Der hier beschriebene Ansatz könnte wichtige Einblicke in die Beziehung zwischen der genomischen Standort eines bestimmten Gens, die transkriptionelle Aktivität und der damit verbundenen Fitness Vorteil geben. Dies könnte theoretisch helfen bei der Auswahl der genomischen Positionen, was zu stärkeren Ausdruck eines bestimmten Gens, die wiederum für engineering neue, verbesserte Sorten für rekombinante Protein-Produktion von Interesse sein könnten.
Da E. Coli begrenzt intergenetischer Regionen39enthält, werden Transposon Einfügungen in den meisten Fällen ursächlich stören. Dies kann gelegentlich zu schaffen Fehlalarme wo sind die stärksten Clone(s) nicht aufgrund der optimalen chromosomalen Position des genetischen Elements ausgewählt in Frage, sondern eher, weil ein Gen unterbrochen wird -, die auf andere Weise bietet einen Fitness Vorteil während der Wettbewerb Experiment4.
Diese Methode nutzt eine einfach zu bedienende Transposon-System, wo jede Region der Wahl sein kann integriert nach dem Zufallsprinzip Standorte Gestaltete Wettbewerb Experiment kann geändert werden, um eine beliebige Anzahl der Auswahl andere Kräfte als reine Wachstum enthalten, wie hier zu sehen. Das Setup kann auch geändert werden, um rein Tn-Seq, beruhen auf denen ergibt sich eine größere Auflösung der Sequenzierung von Einfügungen Websites als WGS, hier verwendet. Diese unvoreingenommene Ansatz sollte verwendet werden, zu aufregenden neuen Features in so weit Fußgelenkes Organismen zu erhellen, die zeigen könnten, dass gemeinsame Trends in der chromosomalen Organisation der Eubakterien vorhanden.
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Disclosures
Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Die Autoren wurden durch Zuschüsse aus der Novo Nordisk Stiftung, die Lundbeck-Stiftung und der dänischen National Research Foundation (DNRF120) durch das Zentrum für bakterielle Stressantwort und Persistenz (BASP) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclaved Mili-Q water | None | ||
| Electroporation Cuvettes, 0.1 cm | Thermo Fisher Scientific | P41050 | |
| Bio-Rad MicroPulser Electroporation System | Bio-Rad | 165-2100 | |
| LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 12780029 | |
| LB Agar, powder (Lennox L agar) | Thermo Fisher Scientific | 22700025 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 17904 | |
| Fisherbrand Plastic Petri Dishes | Fisher Scientific | S33580A | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Nunc CryoTubes | Sigma-Aldrich | V7634 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
| dATP, [α-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml, 250 µCi | PerkinElmer | BLU012H250UC | |
| DECAprime II DNA Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1455 | |
| Spectrophotometer SF/MBV/03.32 | Pharmacia | ||
| Hermle Centrifuge SF/MBV/03.46 | Hermle | ||
| Ole Dich Centrifuge SF/MBV/03.29 | Ole Dich | ||
| Eppendorftubes 1.5 mL | Sigma-Aldrich | T9661 | |
| Eppendorftubes 2.0 mL | Sigma-Aldrich | T2795 | |
| Sodium Chloride | Merck | 6404 | |
| 96% Ethanol | Sigma-Aldrich | 16368 | |
| Trizma HCl | Sigma-Aldrich | T-3253 | |
| Phenol Ultra Pure | BRL | 5509UA | |
| Chloroform | Merck | 2445 | |
| Ribonuclease A type II A | Sigma-Aldrich | R5000 | |
| Sodiumdodecylsulphate (SDS) | Merck | 13760 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L 6876 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 405-7 | |
| 0.5M Na-EDTA pH 8.0 | BRL | 5575 UA | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 10106801001 | |
| PvuI (10 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | ER0621 | |
| UltraPure Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16500500 | |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fisher Scientific | R0611 | |
| Tris-Borate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T4415 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 433160 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 71687 | |
| Whatman 3MM papers | Sigma-Aldrich | WHA3030931 | |
| SSC Buffer 20× Concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| Amersham Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN119B | |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F8016 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | PVP40 | |
| Bovine Serum Albumin - Fraction V | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| Carestream Kodak BioMax light film | Sigma-Aldrich | Z373494 | |
| GenElute Gel Extraction Kit | Sigma-Aldrich | NA1111 | |
| GenElute PCR Clean-Up Kit | Sigma-Aldrich | NA1020 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | ||
| Rifampicin | Serva | 34514.01 | |
| Cephalexin | Sigma-Aldrich | C4895 | |
| Mithramycin | Serva | 29803.02 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 246964 | |
| Apogee A10 instrument | Apogee |
References
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