Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Bestämning av optimala kromosomala belägenheten för ett DNA-Element i Escherichia coli använder en ny metod för Transposon-medierad

Published: September 11, 2017 doi: 10.3791/55946
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Biology, Section for Functional Genomics and Center for Bacterial Stress Response and Persistence (BASP), University of Copenhagen, 2Department of Microbiology and Infection Control, Statens Serum Institut

Summary

Här användes kraften i en transposon-medierad slumpmässiga införandet av ett icke-kodande DNA-element att lösa sin optimala kromosomala position.

Abstract

Den optimala kromosomala position(er) av ett visst DNA-element var/bestämdes av slumpmässiga transposon-medierad införande som följt av fitness urval. I bakterier, kan effekterna av genetiska samband på funktionen av en genetisk faktor vara svårt att bedöma. Flera mekanismer, inklusive topologiska effekter, transkriptionell störningar från närliggande gener eller replikering-associerad gen dosering, kan påverka funktionen av ett givet genetiska element. Här beskriver vi en metod som tillåter slumpmässiga integrationen av ett DNA-element i kromosomen av Escherichia coli och välj de mest gynnsamma platser med en enkel tillväxt tävling experimentera. Metoden utnyttjar ett väl beskrivna transposon-baserat system för slumpmässig införande, tillsammans med ett urval av de starkaste clone(s) av tillväxt fördel, ett förfarande som är enkelt justerbar experimentella behov. Arten av de starkaste clone(s) kan bestämmas genom helgenom-sekvensering på en komplex flera klonal befolkning eller lätt gen promenader för snabb identifiering av utvalda kloner. Här användes icke-kodande DNA regionen DARS2, som kontrollerar inledandet av kromosomkopiering i E. coli, som ett exempel. Fungera av DARS2 är känt för att påverkas av replikering-associerad gen dosering; den närmare DARS2 blir till beskärningen av DNA-replikation, desto mer aktiv blir det. DARS2 infogades slumpmässigt i kromosomen av en DARS2-bort stam. De resulterande kloner som innehåller enskilda infogningar var poolade och tävlade mot varandra för hundratals generationer. Slutligen var de starkaste klonerna kännetecknas och visade sig innehålla DARS2 införas i nära närhet till den ursprungliga platsen för DARS2 .

Introduction

Funktionen för eventuella genetiska element kan påverkas av dess läge i genomet. I bakterier resulterar detta främst från inblandning av transkriptionen av angränsande gener, lokala DNA topologi eller replikering-associerad gen dosering. I synnerhet processer för DNA-replikation och segregering är kontrollerade, åtminstone delvis, av icke-kodande kromosomala regioner1och korrekt funktion av dessa regioner beror på genomisk läge/kontext. I E.coli, exempel är webbplatsen dif , krävs för syster kromosom upplösning2; KOPS sekvenser, krävs för kromosom segregation3; och datA, DARS1och DARS2 regioner, krävs för korrekt kromosomala replikering kontroll (nedan; 4). Vi presenterar en metod som möjliggör den slumpmässiga omlokalisering, urval och bestämning av optimala genetiska samband med någon viss genetiska element, exemplifieras här med studien av DARS2 icke-kodande regionen.

I E. coli, DnaA ansvarar proteinet initieraren för DNA-strängen ingående enda replikering ursprungoriCoch för rekrytering av helicase DnaB5,6,7. DnaA tillhör AAA+ (dvs. ATPases som är associerad med olika verksamheter) proteiner och kan binda både ATP och ADP med liknande hög tillhörighet5. Nivån på DnaAATP toppar vid inledande8, där DnaAATP bildar en multimer på oriC som utlöser DNA dubbelsidig öppning9. Efter initiering, oriC görs tillfälligt otillgänglig för återinsättande på grund av kvarstad genom en mekanism som involverar bindningen av proteinet SeqA till hemimethylated oriC10,11. Under kvarstad DnaAATP är minskas genom minst två mekanismer: reglerande inaktivering av DnaA (RIDA)12,13 och datA-beroende DnaAATP hydrolys (DDAH)14 ,15. Både RIDA och DDAH främja omvandling av DnaAATP till DnaAADP. Innan en ny omgång av initiering, DnaAADP är återaktiveras till DnaAATP på specifika DnaA-återaktivera sekvenser (DARS): DARS1 och DARS216,17. Kromosomala datA, DARS1,och DARS2 regioner är icke-kodande och agera på ett förkläde-liknande sätt att modulera DnaAATP/DnaAADP omvandling. Dessa regioner, utanför beskärningen av replikering, aktivera montering av en komplex DnaA för antingen inaktivering (datA; 14) eller aktivering (DARS1 och DARS2; 17) av DnaA. Ta bort DARS2 i en cell förändrar inte massa fördubbling tid men resultaten i asynkron replikering inledande15,16,18. Dock DARS2-bristfällig celler har en fitness kostnad jämfört med ett annat syngena vildtyp under både kontinuerlig tillväxt konkurrens i rikt medium eller under etableringen av kolonisationen i mus inälvan18. Detta indikerar att även mindre förändringar i communityn/ursprung koncentration har en negativ effekt på bakteriell fitness. I E. colifinns det ett selektionstryck att upprätthålla kromosom symmetri (dvs. två nästan lika långa replikering armar)19. De datA, DARS1och DARS2 -regionerna har samma relativa avstånd att oriC i alla E. coli stammar sekvenserade18, trots stora variationer i kromosom storlek.

Här använder vi regionen DARS2 av E. coli som ett exempel för identifiering av de kromosomala position(er) som är optimal för dess funktion. DARS2 sattes in in i den NKBOR transposon och den resulterande NKBOR::DARS2 transposon därefter infogas slumpmässigt i genomet hos MG1655 ΔDARS2. Genererade vi således en samling celler, varje som har DARS2 placerade på en annan plats på kromosomen. En in vitro- konkurrens, där alla celler i samlingen var poolade och tävlade mot varandra under kontinuerlig tillväxt i LB för en uppskattningsvis 700 generationer, utfördes. Resultatet av konkurrens experiment bestämdes övervakas/med hjälp av Southern blot, lätt gen promenader och helgenom-sekvensering (WGS; (Se figur 1). Slutpunkten kloner lösas genom lätt gen promenader präglades av flödescytometri att utvärdera cellcykeln parametrar. I ett flöde flödescytometrisk analys, kan Cellstorlek, DNA-innehåll och inledande synchrony mätas för ett stort antal celler. Under flödescytometri, ett flöde av enstaka celler passerar en ljusstråle av lämplig våglängd att excitera färgade DNA, som samtidigt registreras av fotomultiplikatorer som den utsända fluorescensen, ett mått på DNA-innehåll, under förutsättning att cellerna är färgade för DNA. I framåtspritt ljus är ett mått på cellen samlas20.

In vitro- konkurrens experimentet presenterar vi här används för att ta itu med frågor som rör vikten av kromosomala position och genomisk sammanhang av det genetiska elementet. Metoden är objektiv och lätt att använda.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Transposon bibliotekets samling

Obs: de kromosomala locus DARS2 klonats till mini Tn 10-baserat transposon, NKBOR (på pNKBOR) 21, vilket resulterar i NKBOR:: DARS2 (pJFM1). pNKBOR kan erhållas online 22. pNKBOR är en R6K-baserade självmord vektor som kräver de initierare protein π för replikering 23. Plasmiden pJFM1 är därför kunna replikera i en E. coli-stam (t.ex. Dh5α λ pir) som innehåller en kromosomala kopia av genen pir. Men när pJFM1 förvandlas till den Pir-brist vildtyp MG1655, pJFM1 kan inte replikera, leder till valet av kanamycin-resistenta kloner som genereras av de slumpmässiga införanden av NKBOR:: DARS2 till bakteriell kromosomen. För enkelhet benämns dessa DARS2 infogningar. Se figur 1 för en schematisk presentation av metodiken.

  1. Förbered electrocompetent MG1655 Δ DARS2 från aktivt växande celler i Lysogeny buljong (LB) odlas vid 37 ° C 24.
  2. Electroporate pJFM1 in electrocompetent MG1655 Δ DARS2, enligt Gonzales o.a. 24
    1. add 1 µg av pJFM1 (i vatten 1 µL) till 40 µL av electrocompetent E. coli MG1655 Δ DARS2 och överföra denna blandning till en pre kylda, sterila 0,2 cm lucka kyvetten. Infoga kyvetten i elektroporation kammaren. Electroporate 18 kV, 500 Ω och 25 µF; tidskonstanten bör ~5.0 ms, och inga överslag bör inträffa.
    2. Snabbt återställa bakteriesuspensionen genom omblandning det i 1 mL av pre värmde LB buljong och överföring till en 15 mL provrör.
    3. Låta cellerna återhämta sig genom inkubation under kolsyrat odlingsbetingelser vid 37 ° C i 30 min, utan antibiotika urval. Tavla bakterierna på LB agarplattor kompletteras med 50µg/mL kanamycin och inkubera vid 37 ° C över natten.
  3. Räkna kolonierna från elektroporation: en koloni anses lika med en kromosomala transposon införande.
    Obs: Kolonier kan räknas av ögat eller med en koloni räknare. Antalet kolonier är omvänt proportionell mot det genomsnittliga avståndet mellan de transposoner ligger i kromosomen av varje klon.
  4. Add 1 mL LB buljong till varje tallrik och tvätta av alla kolonier; 1 mL LB buljong bör vara tillräcklig för att tvätta bort ~ 100.000 kolonier. Återanvändning i samma 1 mL LB buljong att öka bakteriell koncentrationen. Pool alla kolonier i en och samma tub 50 mL.
  5. Vortex röret och frysa start materialet (t = 0). För att frysa den, blanda 1 mL cellsuspension med 1 mL 50% glycerol på is. Överföra rören för att torka is i 10 min. När kulturerna är frysta, överföra dem till-80 ° C frys.
    Obs: En cell koncentration av minst 50 000 CFU/mL förväntas i detta steg.

2. Konkurrens Experiment i LB

  1. Tina transposon biblioteket från-80 ° C på is. Mix av pipettering.
  2. Överföra 100 µL av transposon biblioteket 10 ml av LB i en 15 mL provrör.
  3. Växer cellerna, kolsyrat av ständig skakning (250 rpm), för 8 h vid 37 ° C till stationär fas (dvs OD 600 = ~ 4.0). Justera dessa parametrar till olika tillväxt villkorar, som önskat.
  4. Sprida bakteriell befolkningen genom kontinuerlig överföringar till färska förvärmd medium varje ~ 10 generationer. Gör detta genom att överföra 10 µL av den föregående stationära fas kulturen till 10 mL färsk LB och växer för en annan 8 h till den stationära fasen (dvs OD 600 = ~ 4.0).
    Obs: Eftersom start- och optiska densitet är samma, en 1.000-faldig utspädning motsvarar ~ 10 generationer av tillväxt (2 10 = 1024). Den bakteriella populationen kan antingen sprids direkt till färska förvärmd medium eller sparas på 0-4 ° C (på is) och förökade följande dag. LB var används här för att se till så många cellulära dubbleringar i så kort tid som möjligt (en fördubbling tid nära 22 min).
  5. Efter varje 100 generationer av konkurrensen, spara fem 1 mL prov vid-80 ° C (enligt beskrivningen i steg 3.3).
  6. Om fitness skillnaderna mellan celler som innehåller enskilda transposon infogningar förväntas vara små, hålla varaktigheten av konkurrensen länge; här, 700 generationer (t = 700) användes.

3. Southern Blot analys att övervaka konkurrensen Experiment över tiden

  1. Förbered proben för södra blot (1 kb avsnitt av NKBOR) genom att utföra polymeras-kedjereaktion (PCR) förstärkning med specifika primers: NKBOR_Probe_FW : gatgttggacgagtcggaat och NKBOR_Probe_RV: cgttacatccctggcttgtt.
    1. Inkubera vid 98 ° C i 30 s för inledande denaturering. Utför sedan 35 cykler vid 98 ° C för 10 s, 60 ° C under 30 s och 72 ° C för 45 s. För den slutliga förlängningen, använda 72 ° C i 10 min.
      Obs: Mallen för PCR-reaktionen var en renad pNKBOR plasmid 21.
    2. Märka den resulterande PCR-fragmenten med [α - 32P] dATP använda slumpmässiga primer, enligt Smith 25.
  2. Förbereda totala cellular DNA enligt Løbner-Olesen och von Freiesleben 26 för t = 0 och valda tidpunkter tills t = 700 Beräknad generationer konkurrens.
  3. Smälta den totala cellular DNA med Pvu I, som skär den NKBOR innehållande regionen intresseanmälan en gång bara i en region inte omfattas av sonden; 1 enhet Pvu jag kan användas helt smälta 1 µg substrat DNA.
    Obs: Sonden kommer att känna igen fragment som innehåller en del av transposon, tillsammans med kromosomala DNA av olika längder, beroende på insticksstället.
  4. Utföra en Southern blot använder en 0,7% agarosgel enligt Løbner-Olesen och von Freiesleben 26.

4. Identifiering av de starkaste kloner

  1. användning lätt gen promenader, som beskrivs av Harrison m.fl. 27, att identifiera DARS2 införande platser från enda kloner (isolerad på LB tallrikar) efter 700 uppskattade generationer av konkurrensen. fler band på Southern blot, mer isolaten behövs för att täcka alla transposon infogningar.
    1. Isolerat genomiskt DNA PCR-mallen. Sprida bakterier på en LB agarplatta innehållande 50 µg/mL kanamycin och inkubera vid 37 ° C under natten. Växa enstaka kolonier övernattning i LB buljong vid 37 ° C och därefter överför 20 µL till 200 µL Ånghärdad destillerat vatten (eller Använd DNA rening, som i steg 3,2).
      1. Vortex att blanda. Värm blandningen vid 100 ° C för 10 min och centrifugera vid max hastighet för 5 min. Spara cellen lysate vid-20 ° C för framtida användning.
    2. Designa tre kapslade grundfärger att glödga inom transposon val (se figur 2 för en grafisk representation av PCR-strategin).
      Obs: Utforma kapslade Primers bör säkerställa att kapslade Primer 3 ligger närmast den kända 5 ' slutet av transposon DNA, följt av kapslade Primers 2 och 1. Avståndet mellan kapslade Primer 3 och 5 ' slutet av kända transposon DNA bör räcka för en sekvens genomläsning från kända DNA till det okända DNA (för att hitta specifika kromosomala transposon insticksstället). Följande kapslade grundfärger användes för NKBOR: pNKBOR_Nested3_RV: gcagggctttattgattcca, pNKBOR_Nested2_RV: tcagcaacaccttcttcacg, och pNKBOR_Nested1_RV: actttctggctggatgatgg. Slumpmässiga primers som innehåller kända restriktionsenzym erkännande webbplatser används också. För att säkerställa ett resultat, bör man använda minst två olika slumpmässiga grundfärger. Den begränsning platser för restriktionsenzym (e.g.,Sau 3AI och Hin dIII) bör placeras på 3 ' slut och föregås av tio slumpmässiga baser så som 5 ' - NNNNNNNNNNGATC - 3 ' och 5 ' - NNNNNNNNNNAAGCTT - 3 ' är primers innehållande en Sau 3AI webbplats (GATC) och en Hin dIII webbplats (AAGCTT), respektive, där N = A, T, G eller C.
    3. Användning 200 ng av genomisk DNA i en 20 µL PCR-reaktion. Inkubera vid 98 ° C under 30 s för den inledande denaturering. Utföra 25 cykler vid 98 ° C för 30 s, 50 ° C för 15 s, och 72 ° C under 4 minuter. För den slutliga förlängningen, använda 72 ° C för 10 min. Använd primer par bestående av kapslade Primer 1 och en av slumpmässiga primers.
    4. Använda primer par bestående av kapslade Primer 2 och samma slumpmässiga primer från andra förstärkning, med 1 µL av dess tidigare reaktion som en mall.
    5. Upprepa steg 4.1.4 med primer par bestående av kapslade Primer 3 och samma slumpmässiga primern.
    6. Kör produkterna från den slutliga PCR-reaktionen på en 1,5% agarosgel och fläcken med etidiumbromid. Klipp ut ett band i intervallet 100-800 bp och isolera DNA med hjälp av några kommersiella DNA gel utvinna kit enligt tillverkaren ' s riktning. Återsuspendera DNA i 15 µL vatten.
      Obs: försiktighet. Etidiumbromid är giftigt och måste hanteras med försiktighet.
    7. Sekvens bandet isolerade i det föregående steget (steg 4.1.6), med kapslade Primer 3 som den sekvensering primer, med Sanger sekvensering på en kommersiell leverantör.
  2. Utföra WGS.
    1. Utföra WGS den totala DNA extraheras från utvalda prov som samlats under konkurrens experimentet, som beskrivs av Frimodt-Møller et al 4.
  3. Utföra sekvensering analys.
    1. Justera Parade-end läser till 150 Ns angränsande till NKBOR, AF310136.1 1 904 … 2 204 med ett intervall mellan utsäde delsträngar (S, 1, 1,15) och ett maximalt antal tvetydiga tecken (L, 0, 0,9) Bowtie2 28.
    2. Välj den arrangera i rak linje läser och sedan åter rikta in till båda MG1655 ref | NC_000913.3 och NKBOR gb | AF310136 använder blastN 29
    3. tilldela införlivande införande positioner i korsningar MG1655-NKBOR.

5. Flödescytometri

  1. samla in prover för flödescytometri.
    1. Balans varje kultur genom att upprätthålla det exponentiella tillväxtfasen minst 10 generationer. Kontrollera den OD 600 och se till att det aldrig överstiger 0,3.
    2. Samla in två typer av flöde prover.
      1. För RIF-rundgång, överför 1 mL av kultur till en 15 mL tub som innehåller 30 µL av RIF-CEF (300 µg/mL rifampicin och 36 µg/mL cefalexin upplöst i 12,5 mM NaOH). Lämna det vid 37 ° C i minst 4 h av skakningar.
        Obs: Rifampicin indirekt blockerar inledandet av kromosomkopiering samtidigt pågående rundor av replikering att fortsätta till uppsägning. Cefalexin förhindrar celldelning, vilket resulterar i replikering runout (RIF-rundgång) och ansamling av celler med fullt replikerad kromosomer. Av antalet fullt replikerad kromosomer är lika med antalet ursprung vid tiden för behandling med rifampicin och cefalexin 20.
      2. För EXP-provet, överföring 1 mL exponentiellt växande kultur till ett 1,5 mL rör på ice.
  2. Fixa cellerna som följer. Skörda cellerna genom centrifugering vid 15 000 x g under 5 minuter vid 4 ° C. återsuspendera pelleten i 100 µL av iskall 10 mM Tris pH 7,5 och tillsätt 1 mL iskallt 77% etanol. Lagra proverna vid 4 ° C fram till användning.
  3. Färga cellerna som följer. Skörda 100-300 µL fasta celler genom centrifugering vid 15 000 x g i 15 min. ta bort supernatanten och återsuspendera pelleten i 130 µL av " DNA färgning lösning " (90 µg/mL mithramycin, 20 µg/mL etidiumbromid, 10 mM MgCl 2 och 10 mM Tris pH 7.5). Sätta proverna på is och i mörkret; proverna är redo för flödescytometri Flödesanalys efter 10 min.
    Obs: Andra DNA fläckar än etidiumbromid och mithramycin kan också använda 30 , 31.
  4. Fastställa ursprunget per cell, den relativa cellmassan och det relativa DNA-innehållet av flödescytometri Flödesanalys.
    1. Utföra flödescytometri, som tidigare beskrivits 32. Kör RIF-rundgång och EXP-prover med flöde cytometer tillverkaren ' anvisningar . För mithramycin- och etidiumbromid bromid-färgade celler, använder excitation våglängder 395 och 440 nm och fluorescensen ovan 565 nm.
      1. Att bestämma relativ massa och relativa DNA cellinnehållet, köra EXP-proverna att få singel-parameter framåt-ljus scatter kontra cell nummer histogram och fluorescensintensiteten kontra cell nummer histogram för minst 30 000 evenemang motsvarande cell signalen.
      2. Användning framåtspritt ljus singel-parameter distribution att mäta den genomsnittliga relativt cell Mass
        Obs: Framåtspritt ljus är ett mått på den genomsnittliga cell mass 20.
      3. Användning fluorescens intensitet singel-parameter distributioner att mäta den genomsnittliga DNA innehåll 20.
      4. Erhålla DNA koncentrationen som förhållandet av genomsnittliga DNA-innehåll till den genomsnittliga cell mass 20.
    2. Bestämma antalet ursprung per cell.
      1. Kör RIF-rundgång prover att erhålla singel-parameter fluorescensintensiteten kontra cell nummer histogram för minst 30 000 evenemang motsvarande cell signalen.
      2. Användning fluorescens intensitet singel-parameter distributioner att bestämma antalet kromosomer i varje cell 20.
  5. Beräkna indexet communityn (Ai).
    1. Beräkna Ai, som beskrivs av Løbner-Olesen et al. 32, med hjälp av fluorescens intensitet enda parameter fördelningorna av RIF-rundgång proverna och formeln Ai = (f3 + f5 + f6 + f7) / (f2 + f4 + f8), där fx är bråkdel cellerna med x antal fullt replikerad kromosomer. Överväga initieringar asynkron när A > 0,1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En Southern blot gjordes för att kontrollera att DARS2 delades slumpmässigt i hela kromosomen i transposon biblioteket (t = 0) och som de starkaste klonerna skulle kvarstå över tid. Southern blot utfördes på DNA extraheras från inledande transposon poolen (vid t = 0) och varje uppskattningsvis 100 ur 700 generationer av konkurrensen (figur 3). Här, den totala cellular DNA från varje tidpunkt var smält med den Pvujag restriktionsenzym, känt att skära transposon NKBOR::DARS2 en gång bara i en region som inte omfattas av sonden. Southern blot var utforskad med en radioaktivt märkt DNA-fragment som komplement till en del av NKBOR. Som framgår av figur 3, första DARS2 poolen (t = 0) saknade distinkt band, som visar att DARS2 infördes slumpmässigt hela kromosomen. Över tid, ett mönster framkom där den första stora poolen av DARS2 kloner utvecklats till endast en eller ett fåtal framhärdande DARS2 kloner (figur 3; t = 0 till t = 700).

I exemplet som visas identifierades DARS2 införande platser från konkurrens experiment med WGS och lätt gen promenader. Här, WGS användes för att identifiera införande platser från start poolen (t = 0) och efter 300, 400 och 700 generationer av konkurrensen. Observera att täckningen i de nuvarande djupsekvensering var otillräcklig för en fullständig kartläggning av införande platser vid t = 0; Det ger dock en representativ delmängd av det totala antalet infogningar. WGS bekräftade Southern blot resultatet (dvs. urvalet av de starkaste DARS2 klonerna), slutar med cirka 98% av alla DARS2 infogningar nära vildtyp DARS2 kromosomala läge (DARS2 Klon IR och klon rppH), medan resterande 2% var någon annanstans på kromosomen (figur 4). Detta tyder starkt på att vildtyp ställning är optimalt för DARS2 funktion. Vid t = 400, en infogning hittades på motsatt replikering armen med en nästan identisk avstånd till oriC som vildtyp DARS2 läge (figur 4), men denna kortisättning återfanns inte efter 700 generationer. Således, replikering-associerad gen dosering kan inte vara den enda faktorn för optimal position.

Lätt gen promenader användes för att identifiera DARS2 infogningar platser i enda kloner isolerad efter 700 uppskattade generationer av konkurrensen. Här, identifierades de två DARS2 införande platser som nämns ovan (DARS2 klon IR och klon rppH). Lätt gen promenader var bara gjort på 20 kloner, och detta förklarar varför alla DARS2 infogningar platser som kartlagts i WGS inte var identifieras. DARS2-bristfällig celler var tidigare visat att initiera replikering i communityn och att ha en minskning av ursprung koncentration i förhållande till vildtyp celler4,16,17, 18. vi använde därför flödescytometri att lösa sömnapparater i inledandet av innehåll för DNA-replikering och cellulära ursprung för de två valda stammar (DARS2 klon IR och klon rppH), som i båda fallen återställdes till vildtyp nivåer (figur 5). Ett representativt exempel på en stam som har en enda kopia av DARS2 ligger i slutstationen visas (figur 5E). Här, återställer förekomsten av ett DARS2 -element i slutstationen inte synchrony eller cellulära ursprung innehållet till vildtyp nivåer, medan de valda DARS2 kloner IR och rppH göra.

Figure 1
Figur 1 : Metodik översikt. Schematisk presentation av metoden. Kromosomala DARS2 regionen är klonade in mini Tn10 på pNKBOR, skapa pJFM1. pJFM1 omvandlas till E. coli MG1655 ΔDARS2, som utlöser en slumpmässig isättning av DARS2 kopplade till Tn10 på kromosomen av E. coli MG1655 ΔDARS2. Cirka 70.000 kloner, vardera med en annan kromosomal DARS2 införande, var poolade och tävlade direkt mot varandra i LB buljong vid 37 ° C. I direkt konkurrens i LB buljong utfördes för en uppskattningsvis 700 generationer, där ett prov var isolerad för varje 100 generationer av direkt konkurrens. Totala DNA var extraheras från varje enstaka prov och används för södra blotting och identifiering av DARS2 infogningar av WGS. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Grafisk presentation av lätt gen walking. Denna figur illustrerar en genomisk DNA mall med en okänd DNA-sekvens som gränsar till en känd sekvens med grundning platser för slumpmässiga primer och kapslade grundfärger 1, 2 och 3. Resultaten av de tre efterföljande kompletteringar görs med tre designade kapslade primers illustreras nedan. Den slutliga produkten (från omgång 3) är sekvenserade använder kapslade Primer 3. Denna siffra var anpassad från Harrison m.fl. 27. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Southern blot probed för NKBOR. Southern blot analys av DARS2 infogningar i en DARS2-bristfällig stam. Genomiskt DNA extraheras från varje ~ 100 generationer av direkt konkurrens, börjar vid t = 0 och slutar vid 700 generationer, var smält med Pvujag och gel-fractionated. Blot var hybridiseras med en NKBOR sond (se protokoll). t anger antalet generationer av konkurrensen. Denna siffra var anpassad från Frimodt-Møller o.a. 4. HMW och LMW är högmolekylära vikt och lågmolekylärt DNA, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Grafisk representation av löserEd transposon infogningar platser i ΔDARS2. Positionerna för oriC, datA, DARS1, DARS2, och terC indikeras. DARS2 införande platser i ΔDARS2 vid t = 0 (svarta staplar), t = 400 (ljus blå staplar), t = 500 (röda staplar), och t = 700 (gröna staplar), lösas genom full-Genomsekvensering. Denna siffra var gjorda med DNAPlotter33 och anpassades från Frimodt-Møller o.a. 4. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Representativa flöde flödescytometri histogram av transposon platser hittade lätt gen fots vid t = 700. Celler odlades i AB minimalmedium kompletteras med 0,2% glukos, 10 µg/mL tiamin och 0,5% casamino syror vid 37 ° C. Vildtyp och ΔDARS2 visas i A och B, respektive. Derivat av vildtyp stammen MG1655 saknar DARS2 på det ursprungliga locus och istället bära en kopia av DARS2 på den löst transposon webbplats rrpH, IR och slutstationen (terC) visas i C, D och E, respektive. Denna siffra var anpassad från Frimodt-Møller o.a. 4 att visa ett DARS2 läge som resulterar i en cellcykeln anomali (terC) eller som återställer vildtyp fenotypen(rrpH, IR). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den metod som använts här tar fördel av state-of-the-art tekniker att besvara en svår fråga angående optimal genomisk positionen för en genetisk faktor. Slumpmässiga införandet av det genetiska element (medieras av transposon) möjliggör snabb och enkel insamling av tusentals kloner som sedan kan göras för att tävla mot varandra att välja för optimal position för utredas genetiska elementet (dvs. den starkaste klonen).

Här, DARS2 sattes in in i det mini-Tn10-baserat transposon, NKBOR. Valet av transposon är viktigt för efterföljande analys av infogningar platser. Flera olika transposoner har använts i transposon-regisserad insticksstället sekvensering (TraDIS) experiment, såsom mini-Tn5Km234 och mer populärt val, i Himar I Mariner transposon35, 36 (en senaste översyn av detta, se van Opijnen och Camilli36). Vi siktade för 70.000 inledande slumpmässigt införanden av DARS2, vilket ger ungefär en DARS2 insättning evert 65 bp i MG1655 genomet. Detta kan enkelt justeras genom att minska eller öka den inledande poolen av kolonier som samlas in.

Här valde vi för kontinuerlig överföringar i LB batch kulturer, men konkurrensen experimentet kan även utföras i annat medium eller under olika förhållanden, inklusive med hjälp av en chemostat37. Förfarandet kan dessutom ändras för att tillgodose eventuella villkor val, inklusive olika påfrestningar, såsom oxidativ, osmotisk eller antibiotika stress. För att kontrollera förekomsten av ihållande kloner över tid, man kan göra minst tre saker: WGS; transposon sekvensering (Tn-Seq); eller, som här, en Southern Blot. Slutligen, lätt gen promenader kan göras på några kloner, med den ytterligare fördelen att transposon införande platser identifieras enda kloner, så att effekten av specifik insticksstället kan analyseras fenotypiskt.

Valet av fenotypiska test för att utvärdera resultatet av en tävling experiment är beroende av regionen undersökta. Vi använde flödescytometri, som är en kraftfull metod att mäta cellcykeln parametrar av bakterier. Här, avslöjade flödescytometri att den valda kromosomala position(er) av DARS2, (dvs. DARS2 infogningar stänga till vildtyp DARS2 position) resulterade i korrekt reglering av replikering initiering ( dvs, synchrony och DNA-koncentration). De optimala kromosomala position(er) för DARS2 valdes delvis på grund av ordentlig replikering-associerad gen doseringen och delvis på grund av gynnsamma genomisk närmiljön som är viktig för DARS2 funktion4.

Här en icke-kodande DNA elementet undersöktes, men detta skulle kunna utvidgas till någon kodning region i val. En nyligen genomförd studie fann att genuttrycket varierade ~ 300-fold, beroende på dess position på kromosomen, utan klar korrelation till replikering-associerad gen dosering38. Den metod som beskrivs här kan ge viktiga insikter om förhållandet mellan genomisk placeringen av en särskild gen, dess transkriptionell aktivitet och associerade fitness fördelen. Detta kunde i teorin hjälpa till med valet av genomisk positioner, vilket leder till starkare uttryck för en viss gen, som i sin tur kunde vara av intresse för engineering nya, förbättrade stammar för produktion av rekombinanta proteiner.

Eftersom E. coli innehåller begränsade intergenic regioner39, kommer, transposon infogningar i de flesta fall störa gene(s). Detta kan ibland skapa falska positiva där de starkaste clone(s) inte är markerade på grund optimal kromosomala ställning av genetiska elementet i fråga, utan snarare eftersom en gen störs - som på andra sätt, ger en fitness fördel under den konkurrens experiment4.

Denna metod utnyttjar en lätt-till-använda transposon system, där någon region i val kan vara integrerade på måfå platser. Designade konkurrens experimentet kan ändras för att omfatta valfritt antal urval andra krafter än ren tillväxt, som kan ses här. Inställningarna kan också ändras för att vara enbart baserat på Tn-Seq, vilket ger en större sekvensering upplösning av infogningar platser än WGS, används här. Denna förutsättningslös metod bör användas för att belysa nya spännande funktioner i-hittills uncharacterized organismer, som kan visa att det finns gemensamma tendenser i kromosomala organisationen av Eubacteria.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Författarna har finansierats genom bidrag från Novo Nordisk Foundation, Lundbeck Foundation och danska National Research Foundation (DNRF120) genom centrum för bakteriell stressreaktion och persistens (BASP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Autoclaved Mili-Q water None
Electroporation Cuvettes, 0.1 cm Thermo Fisher Scientific P41050
Bio-Rad MicroPulser Electroporation System Bio-Rad 165-2100
LB Broth Thermo Fisher Scientific 12780029 
LB Agar, powder (Lennox L agar) Thermo Fisher Scientific 22700025
Glycerol Thermo Fisher Scientific 17904
Fisherbrand Plastic Petri Dishes Fisher Scientific S33580A
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-432-22
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-53A
Nunc CryoTubes Sigma-Aldrich V7634 
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL) Thermo Fisher Scientific F530S
dATP, [α-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml, 250 µCi PerkinElmer BLU012H250UC
DECAprime II DNA Labeling Kit Thermo Fisher Scientific AM1455
Spectrophotometer  SF/MBV/03.32 Pharmacia
Hermle Centrifuge    SF/MBV/03.46 Hermle
Ole Dich Centrifuge  SF/MBV/03.29 Ole Dich
Eppendorftubes 1.5 mL Sigma-Aldrich T9661
Eppendorftubes 2.0 mL Sigma-Aldrich T2795
Sodium Chloride Merck 6404
96% Ethanol Sigma-Aldrich 16368
Trizma HCl Sigma-Aldrich T-3253
Phenol Ultra Pure BRL 5509UA
Chloroform Merck 2445
Ribonuclease A type II A Sigma-Aldrich R5000
Sodiumdodecylsulphate (SDS) Merck 13760
Lysozyme Sigma-Aldrich L 6876
Isopropanol Sigma-Aldrich 405-7
0.5M Na-EDTA pH 8.0 BRL 5575 UA
Kanamycin sulfate Sigma-Aldrich 10106801001
PvuI (10 U/µL) Thermo Fisher Scientific ER0621
UltraPure Agarose Thermo Fisher Scientific 16500500
DNA Gel Loading Dye (6X) Thermo Fisher Scientific R0611
Tris-Borate-EDTA buffer Sigma-Aldrich T4415
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E7637
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 433160
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich 71687
Whatman 3MM papers Sigma-Aldrich WHA3030931
SSC Buffer 20× Concentrate Sigma-Aldrich S6639
Amersham Hybond-N+ GE Healthcare RPN119B
Ficoll 400 Sigma-Aldrich F8016
Polyvinylpyrrolidone Sigma-Aldrich PVP40
Bovine Serum Albumin - Fraction V Sigma-Aldrich 85040C
Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes Sigma-Aldrich D1626
Carestream Kodak  BioMax  light film Sigma-Aldrich Z373494
GenElute  Gel Extraction Kit Sigma-Aldrich NA1111 
GenElute  PCR Clean-Up Kit Sigma-Aldrich NA1020
T100  Thermal Cycler Bio-Rad
SmartSpec Plus Spectrophotometer Bio-Rad
Rifampicin Serva 34514.01
Cephalexin Sigma-Aldrich C4895
Mithramycin Serva 29803.02
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich 246964
Apogee A10 instrument Apogee

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Lobner-Olesen, A. Control of bacterial chromosome replication by non-coding regions outside the origin. Curr Genet. , (2016).
  2. Sherratt, D. J., et al. Recombination and chromosome segregation. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 359 (1441), 61-69 (2004).
  3. Bigot, S., et al. DNA motifs that control E. coli chromosome segregation by orienting the FtsK translocase. EMBO J. 24 (21), 3770-3780 (2005).
  4. Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Lobner-Olesen, A. DNA Replication Control Is Linked to Genomic Positioning of Control Regions in Escherichia coli. PLoS Genet. 12 (9), 1006286 (2016).
  5. Kornberg, A., Baker, T. A. DNA Replication, Second Edition. , University Science Books. (1992).
  6. Kaguni, J. M. Replication initiation at the Escherichia coli chromosomal origin. Curr Opin Chem Biol. 15 (5), 606-613 (2011).
  7. Leonard, A. C., Grimwade, J. E. Regulation of DnaA assembly and activity: taking directions from the genome. Annu Rev Microbiol. 65, 19-35 (2011).
  8. Kurokawa, K., Nishida, S., Emoto, A., Sekimizu, K., Katayama, T. Replication cycle-coordinated change of the adenine nucleotide-bound forms of DnaA protein in Escherichia coli. EMBO J. 18 (23), 6642-6652 (1999).
  9. Sekimizu, K., Bramhill, D., Kornberg, A. ATP activates dnaA protein in initiating replication of plasmids bearing the origin of the E. coli chromosome. Cell. 50 (2), 259-265 (1987).
  10. Brendler, T., Austin, S. Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences. EMBO J. 18 (8), 2304-2310 (1999).
  11. Lu, M., Campbell, J. L., Boye, E., Kleckner, N. SeqA: a negative modulator of replication initiation in E. coli. Cell. 77 (3), 413-426 (1994).
  12. Katayama, T., Kubota, T., Kurokawa, K., Crooke, E., Sekimizu, K. The initiator function of DnaA protein is negatively regulated by the sliding clamp of the E. coli chromosomal replicase. Cell. 94 (1), 61-71 (1998).
  13. Kato, J., Katayama, T. Hda, a novel DnaA-related protein, regulates the replication cycle in Escherichia coli. EMBO J. 20 (15), 4253-4262 (2001).
  14. Kasho, K., Katayama, T. DnaA binding locus datA promotes DnaA-ATP hydrolysis to enable cell cycle-coordinated replication initiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (3), 936-941 (2013).
  15. Kitagawa, R., Ozaki, T., Moriya, S., Ogawa, T. Negative control of replication initiation by a novel chromosomal locus exhibiting exceptional affinity for Escherichia coli DnaA protein. Genes Dev. 12 (19), 3032-3043 (1998).
  16. Fujimitsu, K., Senriuchi, T., Katayama, T. Specific genomic sequences of E. coli promote replicational initiation by directly reactivating ADP-DnaA. Genes Dev. 23 (10), 1221-1233 (2009).
  17. Kasho, K., Fujimitsu, K., Matoba, T., Oshima, T., Katayama, T. Timely binding of IHF and Fis to DARS2 regulates ATP-DnaA production and replication initiation. Nucleic Acids Res. 42 (21), 13134-13149 (2014).
  18. Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Lobner-Olesen, A. Control regions for chromosome replication are conserved with respect to sequence and location among Escherichia coli strains. Front Microbiol. 6, 1011 (2015).
  19. Bergthorsson, U., Ochman, H. Distribution of chromosome length variation in natural isolates of Escherichia coli. Mol Biol Evol. 15 (1), 6-16 (1998).
  20. Boye, E., Steen, H. B., Skarstad, K. Flow cytometry of bacteria: a promising tool in experimental and clinical microbiology. J Gen Microbiol. 129 (4), 973-980 (1983).
  21. Rossignol, M., Basset, A., Espeli, O., Boccard, F. NKBOR, a mini-Tn10-based transposon for random insertion in the chromosome of Gram-negative bacteria and the rapid recovery of sequences flanking the insertion sites in Escherichia coli. Res Microbiol. 152 (5), 481-485 (2001).
  22. SHIGEN. , Available from: http://shigen.nig.ac.jp (2017).
  23. Shafferman, A., Helinski, D. R. Structural properties of the beta origin of replication of plasmid R6K. J Biol Chem. 258 (7), 4083-4090 (1983).
  24. Gonzales, M. F., Brooks, T., Pukatzki, S. U., Provenzano, D. Rapid protocol for preparation of electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae. J Vis Exp. (80), (2013).
  25. Smith, D. R. Random primed labeling of DNA. Methods Mol Biol. 18, 445-447 (1993).
  26. Lobner-Olesen, A., von Freiesleben, U. Chromosomal replication incompatibility in Dam methyltransferase deficient Escherichia coli cells. EMBO J. 15 (21), 5999-6008 (1996).
  27. Harrison, R. W., Miller, J. C., D'Souza, M. J., Kampo, G. Easy gene walking. Biotechniques. 22 (4), 650-653 (1997).
  28. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  29. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
  30. Stepankiw, N., Kaidow, A., Boye, E., Bates, D. The right half of the Escherichia coli replication origin is not essential for viability, but facilitates multi-forked replication. Mol Microbiol. 74 (2), 467-479 (2009).
  31. Lobner-Olesen, A. Distribution of minichromosomes in individual Escherichia coli cells: implications for replication control. EMBO J. 18 (6), 1712-1721 (1999).
  32. Lobner-Olesen, A., Skarstad, K., Hansen, F. G., von Meyenburg, K., Boye, E. The DnaA protein determines the initiation mass of Escherichia coli K-12. Cell. 57 (5), 881-889 (1989).
  33. Carver, T., Thomson, N., Bleasby, A., Berriman, M., Parkhill, J. DNAPlotter: circular and linear interactive genome visualization. Bioinformatics. 25 (1), 119-120 (2009).
  34. Eckert, S. E., et al. Retrospective application of transposon-directed insertion site sequencing to a library of signature-tagged mini-Tn5Km2 mutants of Escherichia coli O157:H7 screened in cattle. J Bacteriol. 193 (7), 1771-1776 (2011).
  35. van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nat Methods. 6 (10), 767-772 (2009).
  36. van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nat Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).
  37. Jeong, H., Lee, S. J., Kim, P. Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat. J Vis Exp. (115), (2016).
  38. Bryant, J. A., Sellars, L. E., Busby, S. J., Lee, D. J. Chromosome position effects on gene expression in Escherichia coli K-12. Nucleic Acids Res. 42 (18), 11383-11392 (2014).
  39. Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).

Tags

Genetik problemet 127 slumpmässiga transposon införande pool kultur konkurrens optimal genomisk sammanhang helgenom-sekvensering lätt gen promenader cellcykeln analys av flödescytometri
Bestämning av optimala kromosomala belägenheten för ett DNA-Element i <em>Escherichia coli</em> använder en ny metod för Transposon-medierad
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Frimodt-Møller, J., Charbon,… More

Frimodt-Møller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Løbner-Olesen, A. Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach. J. Vis. Exp. (127), e55946, doi:10.3791/55946 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter