Summary
هنا يمكننا وصف بروتوكول يسمح للتحليل النسيجي والجزيئية لعينات الجلد بعد الحقن داخل الأدمة المبيضات البيض . هذا البروتوكول يحافظ على السلامة الهيكلية للجلد ويسمح بإضفاء الطابع المحلي على الخلايا المناعية المقيم في الأنسجة أو المعينين حديثا، فضلا عن توزيع الممرض.
Abstract
الجلد هيئة موسعة جداً للجسم، وسبب هذا السطح كبيرة، يتعرض باستمرار للكائنات الحية الدقيقة. يمكن أن يؤدي تلف الجلد بسهولة للإصابة بالعدوى في الأدمة مما يؤدي بدوره إلى نشر مسببات الأمراض إلى مجرى الدم. فهم كيف يحارب الجهاز المناعي العدوى في مرحلة مبكرة جداً، وكيف المضيف يمكن القضاء على مسببات الأمراض خطوة هامة لتعيين القاعدة للتدخلات العلاجية في المستقبل. هنا يصف لنا نموذجا لعدوى المبيضات البيض التي يمكن تصور العمليات التي تحدث مبكرا أثناء عدوى، بما في ذلك عند الممرض اجتاز الحاجز الظهارية، فضلا عن الاستجابة المناعية وأثارت قبل المبيضة الغزو. استخدمنا هذا النموذج الإصابة لإجراء تحاليل نسيجية تظهر الخلايا المناعية التي اختراق الجلد، فضلا عن وجود وإضفاء الطابع المحلي على مسببات المرض. جمع عينات بعد العدوى يمكن معالجتها لاستخراج الحمض النووي الريبي.
Introduction
جسم الإنسان مغطى عددا كبيرا جداً من الكائنات الحية الدقيقة. سطح الجلد هو موئل البكتيريا تقريبا 1 مليون كل سنتيمتر مربع1. ومع ذلك، لا يعكس هذا العدد، مجموعة كاملة من الكائنات المجهرية التي كولونيزيس الجلد. بالإضافة إلى البكتيريا، هو جسم الإنسان استعمر العديد من الأنواع الفطرية، بما في ذلك المبيضة، التي قادرة على البقاء على قيد الحياة في الأغشية المخاطية و الجلد المستوى2على حد سواء.
في السنوات الأخيرة، زادت النسبة المئوية للمصابين بالأمراض الفطرية هائلا. وهذا يرجع أساسا إلى ارتفاع عدد الأشخاص المناعة، أي، مرضى فيروس نقص المناعة البشرية والمرضى التي مرت بالعلاج الكيماوي أو الأدوية المثبطة للمناعة بعد زرع3. وفي مراقبة دراسة أجريت في الولايات المتحدة، أظهر ويسبلينغوف et al. أن 9.5% التهابات مجرى الدم في المستشفيات سببها المبيضات الأنواع4. بسبب زيادة حدوث الأمراض الفطرية، ولا سيما بسبب النسبة المئوية المرتفعة من المبيضات الأنواع التي تم العثور عليها أثناء التهابات مجرى الدم، فهم كيف يهرب هذا الممرض عنصر التحكم في الجهاز المناعي الغاية الهام.
المبيضة هو فطر ديمبرافيك الذي ينمو في مختلف الأشكال المورفولوجية مثل الخميرة، بلاستوسبوريس، بسيودوهيفاي، وخيوط فطرية تبعاً للظروف البيئية5. في شكله أصله، يظهر قدرته اختزاع أعلى المبيضة ولديه القدرة على اختراق ظهارة6.
وقد درست التهابات المبيضة باستخدام العديد من الطرق التجريبية. النموذج الأكثر شيوعاً للإصابة هو الحقن الوريدي من خميرة المبيضة 7. ومع ذلك، هذا النموذج لا تراعي جميع العمليات التي يحدث قبل تمكن الفطريات تنتشر في مجرى الدم. نموذج آخر يستفيد من قدرة المبيضة على غزو الظهارة. هذا الأسلوب، المعروف أيضا الرمل ورقة النموذجي8، وقد وضعته جاسبارى et al. في عام 19989، ويتكون من استخدام ورق الرمل كشط الجلد، وبالتالي القضاء على الطبقة القرنية قبل تطبيق المبيضة. يسمح هذا الإجراء الفطريات لاختراق الظهارة، مما يتيح تحليل قدرات الغازية من مسببات هذا المرض. وأخيراً، قد استخدمت نماذج أخرى من الالتهابات المعوية10 والمسالك التنفسية11 في دراسات مختلفة.
تشكيل الجرح (كما هو الحال في نموذج ورقة الرمال) يؤدي تفعيل مسارات عدة، بما في ذلك تجنيد الخلايا المناعية والتنشيط، بغية تعزيز عملية الشفاء12. هذا يمكن تغيير أو قناع الاستجابة المناعية تحديداً أثارت ضد مسببات المرض، مما يؤدي إلى التباس النتائج.
هنا يصف لنا طريقة العدوى الجلدية التي تتجنب الجرح الأولى تشكيل وتنظيم دورات تعريفية لبيئة تحريضية القاعدية. للحفاظ على هيكل الظهارية سليمة، مباشرة حقن المبيضة في شكله أصله في ديرما العميق. على الرغم من أن حقنه واحدة يمكن أن تثير التهاب معتدل، مقدار التهاب محدودة ومقيدة بالمقارنة إلى تشكيل جرحا مفتوحاً كما هو الحال في نموذج ورقة الرمل. أن النهج الذي يصف لنا هنا يتيح دراسة الاستجابة المناعية الفطرية وانتشار مع تجنب البيئة التحريضية المفرطة والموجودة من قبل بسبب الأضرار الميكانيكية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع الإجراءات التي كانت وافقت تحت "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) وتعمل تحت إشراف وزارة "الموارد الحيوانية" في الأطفال في مستشفى (قوس) في مستشفى بوسطن "الأطفال" أو أقرها الإيطالية وزارة الصحة والمضطلع بها في إطار "اللجنة الرعاية المؤسسية الحيوان" في جامعة ميلانو-بيكوكا.
1. إعداد المبيضة
- ثقافة البيض جيم، سلالة CAF3-113في أنابيب تحتوي على الغنية المتوسطة (الخميرة استخراج ببتون الدكستروز (ييبد)، واستخراج الخميرة 1% (w/v)، 2% (w/v) من بكتو ببتون، الجلوكوز 2% (w/v)) وتستكمل مع أردين (50 مغ/لتر) عند 25 درجة مئوية. في ظل هذه الظروف، ينمو المبيضة كخميرة.
ملاحظة: سلالات المبيضة أخرى يمكن استخدامها، مثل عزل السريرية المبيضة سلالة SC531413. منذ أظهرنا مؤخرا أن عملية التقرحي هو الناجم عن تفعيل نظام المناعة الفطرية14، كل سلالة المبيضة الذي يحافظ على كل من مكونات جدار الخلية وهيكلها، نظرياً، فضلا عن ويمكن استخدام القدرة على إسقاطات أصله، تنشأ. - رصد الثقافة عن طريق العد تركيز الخلوي استخدام محلل عداد خلية.
- حصاد الثقافة عندما يصل إلى تركيز من حوالي 8 × 106 خلايا/مل. بدلاً من ذلك، استخدم جهاز المطياف الضوئي قياس OD600.
ملاحظة: عادة، قيمة OD600 = 1 يتوافق مع تركيز خميرة 3 × 107 خلايا/مل، ولكن ينصح بالمعايرة. - ريسوسبيند الثقافة في المتوسط ييبد-أردين، استخدام حبيس (50 ملم، ودرجة الحموضة 7.5) كعامل المخزن مؤقت واحتضان الثقافة في 37 درجة مئوية للحث على تشكيل خيوط فطرية. تحقق من تكوين أصله تحت مجهر في 100 X التكبير. تشكيل أصله ح 5 مرئية بعد استزراع في 37 درجة مئوية؛ ومع ذلك، استخدام الخلايا ح 16 بعد الحضانة عند 37 درجة مئوية عندما تصل نسبة أصله إلى تقريبا 95% من مجموع الثقافة.
- لإثراء التحضير في تركيز أصله، مختبرين للطرد المركزي للثقافة في 3,300 س ز للحد الأدنى 5 تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه في برنامج تلفزيوني العقيمة بتركيز 1 × 108 خيوط فطرية مليلتر.
2-عمق الجلد حقن
- 24 ساعة قبل الإجراء العدوى، تخدير الفئران مع حقن داخل الكيتامين (80-100 مغ/كغ) وإكسيلازيني (10 مغ/كغ)، ويحلق ثم الجناح الفئران باستخدام ماكينة كهربائية.
ملاحظة: بعد أي إجراء ينطوي التخدير، مكان الفئران تحت مصباح تدفئة حتى أنهم استعادوا كفاءة. - بقية الفئران ل 24 ساعة لتجنب أي التهاب بسبب عملية الحلاقة.
- 24 ساعة بعد إجراء الحلاقة، تخدير الفئران مع حقن داخل الكيتامين (80-100 مغ/كغ) وإكسيلازيني (10 مغ/كغ).
- تحقق منعكس مخلب لضمان أن يتم تخديره الفئران عميق. تقييم منعكس مخلب معسر بحزم مخلب. إذا تحققت في التخدير، الحيوان لا يشعر بالألم ولا تتحرك.
- حقن خيوط فطرية المبيضة في ديرما العميقة باستخدام حقنه الأنسولين 0.3 مل بإبرة 30 × 8 مم في وحدة تخزين نهائي 50 ميليلتر/الحقن، الموافق 5 × 106 خيوط فطرية/الحقن.
- سحب جلد الجناح حلق مشدود استخدام اصبعين بغية إدخال وحدة التخزين مباشرة في ديرما العميق. أدخل الإبرة بزاوية من 10-15 درجة مئوية مع المجسم مشطوف الحواف الإبرة مواجهة.
- مع هذه الزاوية، سيتم حقن الممرض بعمق حوالي 300-500 ميكرون. لضمان الحقن تتم جيدا، التحقق من أن أشكال حجم حقن عثرة هو استيعاب بضع دقائق بعد الحقن.
ملاحظة: تشكل عثرة بعد سيتم ضخ حوالي 1 سم2. وهذا هو المجال الذي سيتم إزالة عند نقطة زمنية المعينة للتحليل الجزيئي أو النسيجي. - للنقاط الزمنية أقل من 24 ساعة (مستحسن) علامة منطقة الإصابة بقلم ماركر، منذ عثرة شكلت مع الحقن استمرت لبضع دقائق، بعدها يتم امتصاصه. للنقاط الزمنية 24 ساعة أو أكثر، هذه الخطوة غير مطلوبة، لأنه سيكون أما من قرحة أو كيسه مرئية بوضوح.
3-عينة من جمع وإعداد لتلطيخ نسيجية
- Euthanize الفئران وفقا للإجراءات المؤسسية.
- استخدام الملقط الجراحي، سحب الجلد عند الحدود لحقن الموقع، قبل وضع علامة بقلم ماركر. باستخدام مقص جراحي، المكوس الموقع المصابة بقطع الجلد بعد السطر ملحوظ.
ملاحظة: كن حذراً لفصل الجلد من الصفاق استخدام مقص نصيحة جولة. - تزج الجلد في قالب قاعدة المتاح مليئة بالقطع الأمثل درجة الحرارة (OCT) مركب، مع الجانب الداخلي من الجلد مواجهة. تجميد العينة في النتروجين السائل حتى يصبح أبيض المجمع. لا تدع النيتروجين السائل تغطية العينة قبل أنها مجمدة تماما، وهذا من شأنه أن يضر العينة.
ملاحظة: تنبيه! خلال الخطوة 3.3، ارتداء درع وجه للحماية من النتروجين السائل. - إذا لم يتم استخدام العينات فورا لإعداد الشرائح، سرعة تخزينها في-80 درجة مئوية.
ملاحظة: نماذج يمكن تخزينها في-80 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى.
4-إعداد الشرائح
- قص العينة في نصف إعداد الشرائح للأنسجة ابتداء من مركز العينة.
- قص 5-ميكرومتر شرائح سميكة مع كريوستات.
ملاحظة: لعينات الجلد، درجة حرارة كريوستات لا ينبغي أعلى من-25 درجة مئوية. درجة حرارة أعلى سيؤدي إلى ذوبان جزئي من ح-OCT و ولذلك لا تبقى العينات في الموقف الصحيح أثناء إجراء قطع. - استخدام شرائح المجهر مشحونة بشكل إيجابي إلى جمع الشرائح.
- إذا لم يتم استخدام الشرائح التي تم جمعها بعد الإعداد، تخزينها في-20 درجة مئوية. عند هذه النقطة، يمكن تخزين الشرائح في-20 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى.
5-توضع & ويوزين تلطيخ
- وصمة عار الشرائح بالانغماس في توضع في جيل لدقيقة 4 يغسل الشرائح في إدارة مياه الحنفية لمدة 5 دقائق.
- وصمة الشرائح بالانغماس في الحل ثم Y للحد الأدنى 1 يغسل الشرائح في إدارة مياه الحنفية لأدنى 5 شطف الشرائح باستخدام الماء المقطر قبل المتابعة في البروتوكول.
- يذوي بالانغماس في التسلسل التركيزات المتزايدة لحلول الإيثانول (50%، 70%، 80%، 95%، 100%). تزج الشرائح لمدة 15 ثانية في كل حل الإيثانول.
- مسح الشرائح لمدة 2 دقيقة على الأقل بالانغماس في عامل تطهير غذائها.
- جبل الشرائح باستخدام المتوسطة المتصاعدة وكشوف الغطاء.
- الحصول على صور الشرائح مع الماسح ضوئي شريحة مجهر تكبير X 40.
6-حمض الدوري-Schiff (PAS) تلطيخ
- إصلاح الشرائح مع الأسيتون % ≥99.5 في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 1 يغسل الشرائح في إدارة مياه الحنفية لمدة 1 دقيقة.
- وصمة عار الشرائح بالانغماس في حل حامض الدوري (1 غ/دل) لأدنى 5 يغسل الشرائح في التغييرات 3 من الماء المقطر.
- وصمة عار الشرائح بالانغماس في شيف لكاشف عن 15 دقيقة يغسل الشرائح في إدارة مياه الحنفية لمدة 5 دقائق.
- وصمة عار الشرائح بالانغماس في توضع في جيل للحد الأدنى 5 يغسل الشرائح في إدارة مياه الحنفية لمدة 30 ثانية.
- يذوي الشرائح بالانغماس في التغييرات 3 من الإيثانول 100%. تزج الشرائح لمدة 15 ثانية في كل مرة.
- مسح الشرائح لمدة 2 دقيقة على الأقل بالانغماس في عامل تطهير غذائها.
- جبل الشرائح باستخدام المتوسطة المتصاعدة وكشوف الغطاء.
- الحصول على صور الشرائح مع الماسح ضوئي شريحة مجهر.
7-عينة من جمع وإعداد لاستخراج الحمض النووي الريبي
- Euthanize الفئران وفقا للإجراءات المؤسسية. إزالة عينات الجلد كما هو الحال في الخطوة 3، 2.
- تزج العينات في أنبوب المفاجئة-كاب 2 مل مع 1 مل كاشف لاستخراج ثيوسيانات-الفينول-كلوروفورم حمض جوانيدينيوم.
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول هنا ويمكن تخزين العينات في-80 درجة مئوية. - قطع العينة إلى قطع حوالي 0.2 سم2 استخدام الملقط الجراحي.
ملاحظة: تنبيه! معظم الكواشف لعزل الحمض النووي الريبي من السمية ومطفره. خطوات 7.3 و 7.4 يجب أن يتم تحت غطاء دخان. - تحطيم العينة مع طاحونة حبة بسرعة ذبذبات/s 20 عن 20 دقيقة بدلاً من ذلك، يمكن استخدام بوتر ميكانيكية.
- فحص تجانس العينات الفعالة التي تبحث عن وجود أجزاء سليمة من الجلد. كرر هذه الخطوة إذا لم يتم تجانس العينات تماما.
- الطرد المركزي هذه العينات في س 16,000 ز 1 دقيقة تبقى سوبيرناتانتس لاستخراج الحمض النووي الريبي وتجاهل بيليه. يتم تنفيذ هذه الخطوة لإزالة الشعر والحطام التي يمكن أن تمنع استخراج الأعمدة.
- المضي قدما في استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام الحمض النووي الريبي تنقية الأعمدة14.
- استخدام جهاز المطياف الضوئي تقييم تنقية الحمض النووي الريبي وتركيز. إذا لم يتم استخدام مقتطفات الحمض النووي الريبي فورا لإعداد كدنا، تخزين العينات في-80 درجة مئوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
عن طريق حقن الممرض مباشرة في ديرما العميقة، يظل مورفولوجية الأنسجة الهيكلية سليمة (الشكل 1A).
الحفاظ على سلامة الجلد الهيكلي يتيح الكشف عن الخلايا المناعية وعلى التعريب في الموقع الإصابة. التكبير أعلى هو مبين في الشكل 1 باء يكشف أن الخراج يتكون أساسا من الكريات البيض النوى (الشركات العسكرية الخاصة) التي تحتوي على انتشار مسببات المرض بحبس به إلى الموقع الإصابة. التوظيف للشركات العسكرية الخاصة، مثل العَدلات، يتيح تشكيل الخراج، وبالتالي تجنب انتشار الفطر داخل أنسجة14. تكبير أعلى (الشكل 1، د) إظهار كيف يتم إثراء المناطق المحيطة بالخراج أيضا في هذه الشركات.
بالحفاظ على سلامة الهيكلية، يمكن تحديد توطين الممرض خلال العدوى. الاستفادة من محتوى السكريات مرتفعة في الجدار خلية المبيضة، تحديد مسببات المرض أجرى باستخدام PAS تلطيخ، الذي يعطي لون أرجواني أرجواني للفطريات. PAS تلطيخ تبين كما هو موضح في الشكل 2 ألف، بوضوح أن الممرض ينحصر داخل الخراج، شكلتها تجنيد المحببة14. المبيضة مرئية بوضوح في التكبير أعلى (الشكل 2)، ويبدو أن تكون محاطة بخلايا نخرية ومحصنة.
باستخدام الطريقة الموصوفة أعلاه، عملية الإصابة وما يترتب عليه من الالتهاب يمكن اتباعها مع مرور الوقت. في الخلية المناعية، وبداية جداً يؤدي التعيين إلى تكوين خراج (الشكل 1A والشكل 3 ألف). عندما تم تحليل أنسجة الجلد لفترات طويلة تصل إلى 48-72 ح، واختلال هياكل الجلد وتشكيل ندبة كانت تصور (الشكل 3، ج). ويعود تشكيل هذا الهيكل مرحلة الشفاء الذي يلي طرد الممرض14.
يمكن أن تتبع العملية التي تؤدي إلى تكوين قرحة لعدة أيام بعد الإصابة. كما هو موضح في الشكل 4A، الفئران البرية من نوع C57BL/6 عرض عملية التقرحي يزيد على مر الزمن. حوالي 70-80% الفئران تظهر تشكيل القرحة ح 72 بعد الإصابة. بسبب تقلب التجريبية، ينبغي أن تستخدم الفئران على الأقل 8 في كل تجربة. للتحليل الإحصائي، يوصي باستخدام الحد ني فئران 8-10 لكل نقاط تقرح إذا مقارنة الأنماط الجينية المختلفة أو العلاجات. وفي هذه الحالة، يجب أن تكون الاختلافات الصغيرة حتى مرئية. صور توضيحية لعملية التقرحي مبينة في الشكل 4B. إلى علاجات محددة أو العيوب الوراثية، تشكيل القرحة يمكن تخفيض أو إلغاء14. وفي بعض الحالات، بدلاً من القرحة، ورما يتكون، كما هو موضح في الشكل 4.
بخلاف الهيماتوكسيلين & ويوزين وتلطيخ PAS، يمكن الملون الشرائح أما علامات الخلوية محددة أو مع غيره ستينينجس المناعي رؤية أفضل: ألياف الكولاجين؛ موقع سيتوكين/المستقطبات داخل النسيج؛ وهوية الخلايا المناعية والتوزيع المكاني.
بالإضافة إلى إعداد غذائها، عينات يمكن أن تستخدم أيضا للتحليلات الجزيئية. موقع الحقن كامل يمكن اقتطعت، أما بالنسبة للتحضير النسيجي، ومعالجتها لاستخراج الحمض النووي الريبي. استخراج الحمض النووي الريبي من الأنسجة يسمح بدراسة وتحديد تلك الجينات upregulated خلال العدوى بمسببات المرض. إمكانية معالجة العينات للتحليلات الجزيئية أداة هامة، جنبا إلى جنب مع التحليل النسيجي، بغية تحسين توصيف نوع الاستجابة المناعية أثارت ضد مسببات المرض وتنظيمها خلال المراحل المبكرة والمتأخرة وبعد التحدي14.
رقم 1: صيانة للتعريب مورفولوجيا والخلوية الجلد. (أ) يتم الاحتفاظ بكل الطبقات. ظهارة و adipocytes وخلايا العضلات التي يمكن التعرف عليها بسهولة. يمكن التعرف على الكريات البيض النوى (ب) (وأبرز مع الأسهم) داخل الخراج. (ج، د) تكبير أعلى تظهر وجود الكريات البيض النوى (الأسهم) في المنطقة المحيطة بالخراج. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: تحديد المبيضة. (أ) المبيضة يمكن الكشف عنها داخل الأنسجة تلطيخ PAS. (ب) أعلى التكبير رؤية أفضل الفطر، الملون في الأرجواني، محصورة داخل الخراج. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: متابعة عملية تحريضية. (أ) في بداية عملية تحريضية بحقن المبيضة ، يعينون المحببة بغية تشكيل خراج حصر مسببات المرض. (ب، ج) تكوين قرحة ضروري لطرد الفطريات. شفاء الأنسجة تتميز بتغيير في السلامة الهيكلية للجلد ويمكن أن يؤدي إلى تشكيل ندبة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: حركية تقرح. (أ) عملية التقرحي يتبع اتجاه زيادة خلال الأيام الأولى بعد الإصابة. 72 ساعة بعد الإصابة، 70-80 في المائة الفئران يظهر قرحة في موقع الإصابة. وقد استخدمت الحيوانات البرية نوع C57BL/6 16. (ب) صور توضيحية من قرحة المعدة التي وضعها 48 ساعة بعد الإصابة. (ج) صور توضيحية لتشكيل كيسه بعد الإصابة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا يمكننا وصف أسلوب الإصابة المبيضة لدراسة عملية التحريضية التي يتم تهيئتها عند مدخل الفطرية في ديرما العميق.
على الرغم من أن تكوين خراج الجلد حدث نادر نسبيا عند الإصابة المبيضة 15، حقن الفطر مباشرة في ديرما عميق يسمح ليس فقط دراسة تشكيل الخراج يحركها الفطرية، ولكن أيضا تحليل المناعة محددة الخلايا التي تشارك لاحتواء انتشار الفطريات. مع الطريقة الموضحة هنا، فمن الممكن دراسة التفاعل بين الخلايا المناعية، فضلا عن تجنيد الخلايا المناعية التي تعتبر مهمة للسيطرة على انتشار الفطريات، مع تجنب أي استجابة التحريضية لأضرار ميكانيكية أو الجرح تشكيل. وفي الواقع، إمكانية الاحتفاظ بنية الظهارية سليمة أمر هام لتجنب تطوير بيئة الالتهابات الناجمة عن حافز ميكانيكية، مثل سحجه. اعتماداً للمرة الأولى قبل ماتزينجير بولي في 199416، إشارات الضرر يمكن وفي الواقع، تنشيط استجابة مناعية و، ونتيجة لذلك، أظهرت التأثير الاستجابة المناعية بمسببات المرض.
الأضرار المرتبطة أنماط الجزيئية (دامبس) يمكن أن تنشأ من الخلايا الميتة ولكن يمكن أيضا أن الإفراج عنهم تحت ظروف الإجهاد. حيث يمكن أن تنتج هذه الإشارات في حالات تلف الأنسجة، سيسبب تشكيل الجرح بيئة فرط تحريضية حتى قبل السياق للعدوى. الطريقة التي وصفناها يحد من الإفراج عن دامبس ومما يقلل من وجود التباس العناصر.
وعلاوة على ذلك، يتم حقن الممرض مباشرة في ديرما العميق منهجية يمكن استخدامها ليس فقط للأمراض الفطرية ولكن أيضا للتحديات البكتيرية. آخر الممرض المسؤول لعدد مرتفع من الحالات على حد سواء الجلدية والتهابات مجرى الدم هو المكوّرات العنقودية الذهبية4. وقد أظهرنا مؤخرا كيف أن هذا البروتوكول أيضا أداة هامة لدراسة عدوى المكوّرات س 14. على وجه الخصوص، يعرف المذهبة س. في عيادة لقدرته على شكل الخراجات في عدة مناطق من الجسم17. حقن في المذهبة س في ديرما العميق يؤدي إلى تشكيل الخراجات، مما يتيح في الوقت نفسه تواجه دراسة الأحداث المبكرة جداً يقودها في المذهبة س. فضلا عن إشراك الاستجابات المناعية التي تؤدي إلى شفاء المرحلة.
وأخيراً، سمة هامة أخرى للمنهجية الموصوفة هنا هو أن الحفاظ على بنية سليمة الظهارية يعطي إمكانية لتحليل الأشيع إضفاء الطابع المحلي على الخلايا المناعية وتفعيل مسارات متميزة يمكن أن تكون مكانياً مجزأة. في ظل هذه الظروف التجريبية، في الواقع، لم يتم تغيير مختلف الهياكل التشريحية للجلد ويمكن تصور الخلايا المناعية والتهابات وسطاء في موقع محدد.
ولذلك استخدام هذا الأسلوب الذي يحافظ على التوزيع المكاني للخلايا المناعية مثالية لتحسين فهم أدوار كل نوع الهاتف الخلوي أثناء الالتهابات الجلدية الفطرية والبكتيرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
FG تدعمه الإيطالية رابطة كل سول ريشيركا la كانكرو (IG 2016Id.18842) ومؤسسة كاريبلو (منحة 2014-0655) ومؤسسة الإقليمي الواحد la ريشيركا بيوميديكا (التثبت).
عز معتمد من قبل المعاهد الوطنية للصحة منحة 1R01AI121066-01A1، 1R01DK115217، DK034854 P30 هدك منحة، هارفارد طبية مدرسة ميلتون وجد ذلك أقدم الجوائز البحثية (412708)، إليانور والشاطئ كم "برنامج زمالة الذكرى" الخمسين، و (مؤسسة كاريبلو 2014-0859).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| PBS | Euroclone | ECB4053L | warm in 37 °C bath before use |
| H-OCT compound | histo-line laboratories | R0030 | |
| Gill's Hematoxilyn | histo-line laboratories | 09-178-2 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | histo-line laboratories | 09-209-05 | |
| Ethanol absolute | scharlau | ET00232500 | |
| Citro-HISTOCLEAR | histo-line laboratories | R0050 | |
| Eukitt, mounting medium | bio-optica | ||
| Acetone | sigma-aldrich | 179124 | |
| PAS staining system | sigma-aldrich | 395B-1KT | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | |
| D(+)-Glucose anhydrous for molecular biology | Applichem PanReac | 50-99-7 | |
| Uridine | Merck Millipore | 8451 | |
| HEPES | Applichem PanReac | A1070,0500 | |
| Safe-Lock tubes 2 mL | eppendorf | 30121597 | |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596018 | Toxic, corrosive and mutagen. Use all precaution needed |
| Rneasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| liquid nitrogen | Wear eye protection | ||
| Instrument | |||
| Coulter Counter-Particle Count | Beckman Coulter | ||
| Centrifuge 5415 R | eppendorf | ||
| MC 3000 Microtome Cryostat | histo-line laboratories | ||
| TissueLiser | QIAGEN | ||
| Materials | |||
| 0.3 ml Insulin Syringe with a 30G x 8mm needle | BD | 324826 | |
| Surgical forceps | |||
| Surgical scissors | |||
| Base mould disposable | histo-line laboratories | 2781 | |
| Positively charged bio microscope slides | bio-optica | 09-2000 | |
| Cover slips 24 x 50 mm | thermo scientific | 11911998 |
References
- Belkaid, Y., Segre, J. A. Dialogue between skin microbiota and immunity. Science. 346 (6212), 954-959 (2014).
- Kashem, S. W., Kaplan, D. H. Skin Immunity to Candida albicans. Trends Immunol. 37 (7), 440-450 (2016).
- Havlickova, B., Czaika, V. A., Friedrich, M.
- Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. P., Edmond, M. B. Nosocomial Bloodstream Infections in US Hospitals: Analysis of 24,179 Cases from a Prospective Nationwide Surveillance Study. Clin Infect Dis. 39 (3), 309-317 (2004).
- Romani, L. Immunity to fungal infections. Nat Rev Immunol. 4 (1), 11-24 (2004).
- Odds, F. C.
- MacCallum, D. M., Odds, F. C. Temporal events in the intravenous challenge model for experimental Candida albicans infections in female mice. Mycoses. 48 (3), 151-161 (2005).
- Dai, T., Kharkwal, G. B., Tanaka, M., Huang, Y. -Y., Bil de Arce, V. J., Hamblin, M. R. Animal models of external traumatic wound infections. Virulence. 2 (4), 296-315 (2018).
- Gaspari, A. A., Burns, R., Nasir, A., Ramirez, D., Barth, R. K., Haidaris, C. G. CD86 (B7-2), but not CD80 (B7-1), expression in the epidermis of transgenic mice enhances the immunogenicity of primary cutaneous Candida albicans infections. Infect Immun. 66 (9), 4440-4449 (1998).
- Koh, A. Y. Murine models of Candida gastrointestinal colonization and dissemination. Eukaryot Cell. 12 (11), 1416-1422 (2013).
- Mear, J. B., et al. Candida albicans Airway Exposure Primes the Lung Innate Immune Response against Pseudomonas aeruginosa Infection through Innate Lymphoid Cell Recruitment and Interleukin-22-Associated Mucosal Response. Infect Immun. 82 (1), 306-315 (2014).
- Leoni, G., Neumann, P. -A., Sumagin, R., Denning, T. L., Nusrat, A. Wound repair: role of immune-epithelial interactions. Mucosal Immunol. 8 (5), 959-968 (2015).
- Fonzi, W. A., Irwin, M. Y. Isogenic strain construction and gene mapping in Candida albicans. Genetics. 134 (3), 717-728 (1993).
- Santus, W., et al. Skin infections are eliminated by cooperation of the fibrinolytic and innate immune systems. Sci Immunol. 2 (15), (2017).
- Florescu, D. F., Brostrom, S. E., Dumitru, I., Kalil, A. C. Candida albicans Skin Abscess in a Heart Transplant Recipient. Infect Dis Clin Pract. 18 (4), 243-246 (2010).
- Pradeu, T., Cooper, E. L. The danger theory: 20 years later. Front Immunol. 3, 287 (2012).
- Cheng, A. G., DeDent, A. C., Schneewind, O., Missiakas, D. A play in four acts: Staphylococcus aureus abscess formation. Trends Microbiol. 19 (5), 225-232 (2011).
