Summary
Aquí se describe un protocolo que permite el análisis histológico y molecular de muestras de piel después de la inyección intradérmica de Candida albicans . Este protocolo mantiene la integridad estructural de la piel y permite la localización de las células inmunes residentes de tejido o recién contratadas así como la distribución de patógenos.
Abstract
La piel es un órgano extremadamente extendido del cuerpo y, debido a esta gran superficie, está continuamente expuesto a microorganismos. Daño de la piel puede fácilmente conducir a infecciones en la dermis que, a su vez, resulta en la diseminación de patógenos en el torrente sanguíneo. Entender cómo el sistema inmunológico combate infecciones en la etapa muy temprana y cómo el host puede eliminar los patógenos es un paso importante para establecer la base para futuras intervenciones terapéuticas. Aquí describimos un modelo de infección por Candida albicans que puede visualizar los procesos que ocurren durante una infección, incluso cuando el patógeno ha superado la barrera epitelial, así como la respuesta inmune provocada por el C. albicans invasión. Se utilizó este modelo de infección realizar análisis histológicos que muestran las células inmunes que infiltran la piel, así como la presencia y localización del patógeno. Las muestras recogieron después de la infección puede ser procesada para la extracción de RNA.
Introduction
El cuerpo humano se cubre con un número extremadamente alto de microorganismos. La superficie de la piel es el hábitat de casi 1 millón de bacterias por centímetro cuadrado1. Este número, sin embargo, no refleja la completa variedad de microorganismos que coloniza la piel. Además de las bacterias, el cuerpo humano es colonizado por muchas especies de hongos, incluyendo C. albicans, que es capaz de sobrevivir tanto en la mucosa y la piel nivel2.
En los últimos años, el porcentaje de personas diagnosticadas con infecciones micóticas ha aumentado enormemente. Esto es principalmente debido al mayor número de personas inmunocomprometidas, es decir, pacientes seropositivos y pacientes que han pasado por quimioterapia o fármacos inmunosupresores después del trasplante3. En un estudio de vigilancia realizado en los Estados Unidos, Wisplinghoff et al demostró que 9,5% de las infecciones de torrente sanguíneo nosocomial fueron causadas por Candida especies4. Debido a la mayor ocurrencia de infecciones por hongos y sobre todo por el elevado porcentaje de especies de Candida durante las infecciones del torrente sanguíneo , entender cómo este patógeno escapa del control del sistema inmunitario es extremadamente importante.
C. albicans es un hongo dimorfo que crece en diferentes formas morfológicas tales como levadura, pseudomicelio, pseudohyphae e hifas dependiendo de las condiciones ambientales5. En su forma hifal, C. albicans muestra su mayor capacidad de invasión y tiene la capacidad de penetrar el epitelio6.
Infecciones por C. albicans se han estudiado utilizando varias aproximaciones experimentales. El modelo más común de infección es la inyección intravenosa de C. albicans levadura7. Sin embargo, este modelo no toma en cuenta todos los procesos que suceden antes de que el hongo se las arregla para difundir al torrente sanguíneo. Otro modelo aprovecha la habilidad de C. albicans para invadir el epitelio. Este método, también conocido como el papel de la arena modelo8, fue desarrollado por Gaspari et en 19989y consiste en utilizar papel de lija para desgastar la piel, eliminando la capa córnea antes de aplicar la C. albicans. Este procedimiento permite que el hongo al penetrar en el epitelio, lo que permite el análisis de la capacidad invasiva de este patógeno. Por último, otros modelos de infecciones gastrointestinales10 y vías respiratorias11 se han utilizado en diferentes estudios.
La formación de una herida (como en el modelo de papel de lija) provoca la activación de varias vías, incluyendo el reclutamiento de células inmunes y activación, con el fin de promover la curación del proceso12. Esto puede alterar o enmascarar la respuesta inmune provocada específicamente contra el patógeno, lo que conduce a la confusión de resultados.
Aquí describimos un método de infección de la piel que evita la formación de la herida inicial y la inducción de un entorno inflamatorio basal. Para mantener la estructura epitelial intacta, inyectamos directamente C. albicans en su forma hifal en la dermis profunda. A pesar de que una sola inyección puede provocar inflamación leve, la cantidad de inflamación está limitada y restringida en comparación con la formación de una herida abierta como en el modelo de papel de lija. El método que se describe aquí permite el estudio de la respuesta inmunológica a la infección por hongos y la propagación evitando el ambiente inflamatorio excesivo y preexistente causado por daños mecánicos.
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Protocol
Todos los procedimientos fueron aprobados bajo el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) y operados bajo la supervisión del Departamento de recursos de animales a los niños del Hospital (arco) en el Hospital infantil de Boston o fueron aprobadas por el italiano Ministerio de salud y el Comité institucional cuidado Animal en la Universidad de Milano-Bicocca.
1. preparación de C. albicans
- Cultivo de C. albicans, cepa CAF3 113, en tubos que contengan medio Rico (levadura extracto peptona dextrosa (YEPD), extracto de levadura 1% (w/v), 2% (w/v) de Bacto peptona, glucosa de 2% (w/v)) suplementado con uridina (50 mg/L) a 25 ° C. En estas condiciones, C. albicans crece como una levadura.
Nota: Otras cepas de C. albicans pueden utilizarse, tales como la clínica aislar C. albicans tensión SC531413. Puesto que hemos demostrado recientemente que el proceso ulceroso es inducido por la activación del sistema inmune innato14, teóricamente cada cepa de C. albicans que mantiene sus componentes de pared celular y estructura, así como capacidad para originar proyecciones hifal, podría ser utilizado. - Vigilar la cultura contando la concentración celular utilizando un analizador de contador de células.
- La cultura de la cosecha cuando alcanza una concentración de aproximadamente 8 x 106 células/mL. Como alternativa, utilice un espectrofotómetro para medir el OD600.
Nota: Generalmente, un valor de OD600 = 1 corresponde a una concentración de la levadura de 3 x 107 células/mL, pero se recomienda la titulación. - Resuspender el cultivo en medio YEPD-uridina, con HEPES (50 mM, pH 7,5) como agente tampón e incubar el cultivo a 37 ° C para inducir la formación de hifas. Comprobar formación hyphal bajo un microscopio a 100 aumentos. Formación hifal es visible 5 h después de cultivo a 37 ° C; sin embargo, usar las células 16 h después de la incubación a 37 ° C cuando el porcentaje hyphal alcanza casi el 95% de la cultura total.
- Para enriquecer más lejos la preparación en la concentración hifal, alícuotas de la centrifugadora de la cultura a 3.300 x g por 5 min deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado en PBS estéril a una concentración de 1 x 108 hifas/mL.
2. la inyección cutánea profunda
- antes de 24 h el procedimiento de infección anestesiar los ratones con una inyección intraperitoneal de ketamina (80-100 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg) y luego afeitarse el flanco de los ratones con una maquinilla eléctrica.
Nota: Después de cualquier procedimiento con anestesia, coloque los ratones bajo una lámpara de calefacción hasta que han recuperado eficazmente. - Resto de los ratones durante 24 h evitar cualquier inflamación debido al proceso de afeitado.
- 24 h después del procedimiento de afeitado, anestesiar los ratones con una inyección intraperitoneal de ketamina (80-100 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg).
- Comprobar el reflejo de la pata para asegurarse de que los ratones son profundamente anestesiados. Evaluar el reflejo de la pata firmemente pellizcando la pata. Si se logra la anestesia, el animal no siente dolor y no se mueve.
- Inyectar la hifas de C. albicans en la dermis profunda utilizando una jeringa de insulina de 0,3 mL con aguja 30 x 8 mm en un volumen final de 50 μL, inyección, correspondientes a 5 x 106 hifas/inyección.
- Tire de la piel del flanco afeitado tensa con dos dedos para inyectar el volumen directamente en la dermis profunda. Inserte la aguja con un ángulo de 10-15° con el bisel de la aguja hacia arriba.
- Con esta perspectiva, se inyectará el patógeno con una profundidad de aproximadamente 300-500 μm. Para asegurar que la inyección se realiza bien, compruebe que el volumen inyectado forma una protuberancia que es absorbido unos minutos después de la inyección.
Nota: La protuberancia formada después de la inyección de aproximadamente 1 cm2. En esta zona que se suprimirá en el momento designado para análisis molecular o histológico. - Para los puntos de tiempo de menos de 24 h (se recomienda) marcar el área de la infección con un rotulador, ya que la protuberancia formada con la inyección persiste durante unos minutos, después de lo cual se absorbe. Para los puntos de tiempo de 24 h o más, este paso no es necesario, porque una úlcera o un quiste será claramente visible.
3. muestra y preparación para la tinción histológica
- Eutanasia a los ratones según los procedimientos institucionales.
- Con unas pinzas quirúrgicas, tire de la piel en la frontera del sitio inyectado, previamente marcado con el rotulador. Con unas tijeras quirúrgicas, suprimir el sitio infectado cortando la piel siguiendo la línea marcada.
Nota: Tenga cuidado de separar la piel del peritoneo con tijeras de punta redonda. - Sumerja la piel en un molde de base desechable llenado de temperatura corte óptimo (OCT) compuesto, con la parte interna de la piel hacia arriba. Congelar la muestra en nitrógeno líquido hasta que el compuesto se convierte en blanco. No permita que el nitrógeno líquido cubre la muestra antes de completamente congelado, esto dañaría la muestra.
Nota: PRECAUCIÓN! En el paso 3.3, use una careta para protección de nitrógeno líquido. - Si las muestras no se utilizan inmediatamente para la preparación de los portaobjetos, rápidamente almacénelas a-80 ° C.
Nota: Las muestras pueden almacenarse a-80 ° C indefinidamente.
4. elaboración de diapositivas
- Cortar la muestra en la mitad para preparar los cortes para histología desde el centro de la muestra.
- Corte 5-μm rodajas gruesas con un criostato.
Nota: Para las muestras de piel, la temperatura de criostato no debe ser superior a-25 ° C. Una temperatura más alta podría causar una fusión parcial de lo H-OCT y por lo tanto, las muestras no se mantendría en la posición correcta durante el procedimiento de corte. - Uso cargado positivamente portaobjetos para recoger las rodajas.
- Si no se utilizan las láminas recogidas poco después de la preparación, almacenarlos a-20 ° C. En este punto, rebanadas pueden almacenarse a-20 ° C indefinidamente.
5. hematoxilina & eosina
- Mancha las diapositivas por inmersión en hematoxilina de Gill para 4 minutos lavar los portaobjetos en agua corriente durante 5 minutos.
- Mancha con que las diapositivas por inmersión en solución de eosina Y para 1 minuto lavan los portaobjetos en el chorro del grifo durante 5 minutos enjuague los portaobjetos agua destilada antes de continuar con el protocolo.
- Deshidratar por inmersión en serie aumentar concentraciones de soluciones de etanol (50%, 70%, 80%, 95%, 100%). Sumerja los portaobjetos por 15 s en cada solución de etanol.
- Claro las diapositivas por al menos 2 min por inmersión en un agente de claro histológico.
- Montar las diapositivas utilizando el medio de montaje y cubreobjetos.
- Adquisición de imágenes de las diapositivas con un escáner de diapositivas de microscopio en un aumento de X 40.
6. ácido-Schiff periódico (PAS) tinción
- Fije las correderas con ≥99.5% acetona a temperatura ambiente durante 1 minuto lavar los portaobjetos en agua corriente durante 1 minuto.
- Mancha las diapositivas por inmersión en solución de ácido peryódico (1 g/dL) para 5 minutos Lave los portaobjetos en 3 cambios de agua destilada.
- Mancha las diapositivas por inmersión en reactivo de Schiff de 15 min lavado de los portaobjetos en agua corriente durante 5 minutos.
- Las diapositivas de la mancha por inmersión en hematoxilina de Gill para 5 minutos Lave los portaobjetos en agua corriente durante 30 s.
- Deshidratar el portaobjetos por inmersión en 3 cambios de etanol 100%. Sumerja los portaobjetos durante 15 s cada vez.
- Claro las diapositivas por al menos 2 min por inmersión en un agente de claro histológico.
- Montar las diapositivas utilizando el medio de montaje y cubreobjetos.
- Adquisición de imágenes de las diapositivas con un escáner de diapositivas de microscopio.
7. colección y preparación para la extracción de ARN de la muestra
- Eutanasia a los ratones según los procedimientos institucionales. Extraer las muestras de piel como en el paso 3.2.
- Sumergir las muestras en un tubo de snap-cap 2 mL con 1 mL de reactivo para extracción del tiocianato-fenol-cloroformo de guanidinio ácido.
Nota: El protocolo puede ser una pausa aquí y las muestras pueden conservarse a-80 ° C. - Cortar la muestra en trozos de aproximadamente 0,2 cm2 con unas pinzas quirúrgicas.
Nota: PRECAUCIÓN! La mayoría de los reactivos para aislamiento de RNA son tóxicas y mutagénicas. Medidas 7.3 y 7.4 debe realizarse bajo una campana de humos. - Romper la muestra con un molino de grano a una velocidad de 20 oscilaciones/s durante 20 min como alternativa, puede usarse un potter mecánico.
- Compruebe la efectiva homogeneización de las muestras buscando la presencia de piezas intactas de la piel. Repita este paso si las muestras no son completamente homogeneizadas.
- Centrifugar las muestras a 16.000 x g durante 1 min Mantenga los sobrenadantes para la extracción de RNA y descartar el precipitado. Este paso se realiza para eliminar el pelo y la suciedad que podría bloquear las columnas de extracción.
- Continuar con la extracción de RNA usando RNA purificación columnas14.
- Use un espectrofotómetro para evaluar concentración y purificación de RNA. Si los extractos de RNA no se usan inmediatamente para preparación de ADNc, almacenar las muestras a-80 ° C.
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Representative Results
A través de la inyección del patógeno directamente en la dermis profunda, la morfología estructural del tejido sigue siendo intacto (figura 1A).
El mantenimiento de la integridad estructural de la piel permite la detección de las células inmunes y su localización en el sitio de la infección. El aumento mayor que se muestra en la figura 1B muestra que el absceso se compone principalmente de leucocitos polimorfonucleares (CMP) que contengan la propagación del patógeno por su confinamiento en el sitio de la infección. Reclutamiento de las CMP, como neutrófilos, permite la formación del absceso, evitando así la propagación del hongo en el tejido14. Aumentos más altos (figura 1, D) muestran cómo los alrededores del absceso también se enriquecen en CMP.
Manteniendo la integridad estructural, se puede determinar la localización del patógeno durante la infección. Aprovechando el elevado contenido de polisacáridos en la pared celular de C. albicans, la identificación del patógeno se realizó mediante tinción de PAS, que da un color púrpura magenta al hongo. Como se muestra en la figura 2A, Tinción PAS, muestra claramente que el patógeno se limita dentro del absceso, formado por el reclutamiento de granulocitos14. C. albicans es claramente visible en la ampliación más alta (figura 2B), y aparece rodeado por las células necróticas e inmunes.
Con el método arriba descrito, el proceso de infección y la inflamación consecuente pueden seguirse en el tiempo. En la célula inmune, muy principio reclutamiento conduce a la formación de un absceso (figura 1A y Figura 3A). Cuando el análisis de los tejidos de la piel se prolongó hasta 48-72 h, la desorganización de las estructuras de la piel y la formación de una cicatriz fue visualizada (figura 3B, C). La formación de esta estructura obedece a la fase de curación que sigue a la expulsión del patógeno14.
El proceso que conduce a la formación de una úlcera puede ser seguido durante varios días después de la infección. Como se muestra en la Figura 4A, C57BL/6 ratones de tipo salvaje mostrar un proceso ulceroso que aumenta con el tiempo. Unos 70-80% de los ratones muestran la formación de una úlcera 72 h después de la infección. Debido a la variabilidad experimental, por lo menos 8 ratones deben utilizarse en cada experimento. Para el análisis estadístico, se recomienda utilizar un mínimo de 8-10 ratones para cada puntuación de ulceración si comparando diferentes genotipos o tratamientos. En este caso, incluso pequeñas diferencias deben ser visibles. Fotos ilustrativas del proceso ulceroso se muestran en la Figura 4B. Tratamientos específicos o deficiencias genéticas, la formación de la úlcera puede ser reducida o abrogado14. En algunos casos, en lugar de la úlcera, un quiste se forma, como se ilustra en la figura 4.
Distintos de hematoxilina y eosina y la coloración de PAS, las diapositivas pueden teñirse para ambos marcadores celulares específicos o con otros los stainings de immunohistochemical para visualizar mejor: las fibras de colágeno; citoquinas/quimioquinas ubicación dentro del tejido; e identidad inmune celular y distribución espacial.
Además de la preparación histológica, las muestras se pueden utilizar también para los análisis moleculares. El sitio entero puede ser suprimido, en cuanto a las preparaciones histológicas y procesado para la extracción de RNA. Extracción de RNA del tejido permite el estudio e identificación de los genes upregulated durante la infección con el patógeno. La posibilidad de procesar las muestras para los análisis moleculares es una herramienta importante, junto con el análisis histológico, para caracterizar el tipo de respuesta inmune sacado contra el patógeno y su regulación durante las etapas tempranas y tardía después el reto14.
Figura 1: mantenimiento de la localización celular y morfología de la piel. (A) todas las capas se conservan. Epitelio, adipocitos y células musculares son fácilmente reconocibles. (B) los leucocitos polimorfonucleares (resaltados con flechas) pueden ser identificados dentro del absceso. (C, D) Aumentos más altos muestran la presencia de leucocitos polimorfonucleares (flechas) en el área que rodea el absceso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Identificación de C. albicans. (A) C. albicans puede detectarse dentro del tejido con la tinción de PAS. El aumento mayor (B) para visualizar mejor el hongo, teñido en púrpura, confinado dentro del absceso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: seguimiento del proceso inflamatorio. (A) al principio del proceso inflamatorio provocado por inyección de C. albicans , granulocitos son reclutados para formar un absceso para limitar el patógeno. (B, C) La formación de una úlcera es necesaria para la expulsión del hongo. El tejido de cicatrización se caracteriza por una alteración en la integridad estructural de la piel y puede conducir a la formación de una cicatriz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: cinética de la ulceración. (A) el proceso ulceroso sigue una tendencia de aumento durante los primeros días después de la infección. 72 h después de la infección, 70-80% de los ratones muestra una úlcera en el sitio de la infección. Se utilizaron 16 animales de tipo salvaje de C57BL/6. (B) cuadros ilustrativos de las úlceras que desarrollaron 48 horas después de la infección. (C) cuadros ilustrativos de la formación del quiste después de la infección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí describimos un método de infección por C. albicans para estudiar el proceso inflamatorio que se inicia en la entrada de hongos en la dermis profunda.
Aunque la formación de abscesos de la piel es un acontecimiento relativamente raro sobre C. albicans infección15, inyección del hongo directamente en la dermis profunda permite no sólo el estudio de la formación del absceso basados en hongos, sino también el análisis de inmune específica células que participan para contener propagación de hongos. Con el método descrito aquí, es posible estudiar la interacción entre las células inmunes, así como el reclutamiento de las células inmunes que son importantes para controlar la propagación de hongos, evitando cualquier respuesta inflamatoria al daño mecánico o de la herida formación. De hecho, la posibilidad de mantener intacta la estructura epitelial es importante evitar el desarrollo de un entorno inflamatorio causado por un estímulo mecánico, como una abrasión. Como teoría por primera vez por Polly Matzinger en 199416, señales de daños pueden, de hecho, activar una respuesta inmune y, en consecuencia, potencialmente influir en la respuesta inmune inducida por el patógeno.
Patrones moleculares de daño asociado (DAMPs) pueden originarse de las células muertas, pero también pueden ser lanzados bajo condiciones de estrés. Ya que estas señales pueden ser producidas en situaciones de daño tisular, la formación de una herida podría causar un ambiente hiper inflamatorias antes el contexto de una infección. El método que hemos descrito limita la liberación de humedades y así reduce la presencia de elementos de confusión.
Por otra parte, la inyección de un agente patógeno directamente en la dermis profunda es una metodología que puede utilizarse no sólo para infecciones de hongos, sino también para los desafíos bacterianas. Otro agente patógeno responsable de un número elevado de casos de ambos cutáneas y las infecciones del torrente sanguíneo es Staphylococcus aureus4. Recientemente hemos demostrado cómo este protocolo también es una herramienta importante para el estudio de la infección de S. aureus 14. En particular, S. aureus es conocido en la clínica por su capacidad de forma abscesos en varios distritos del cuerpo17. Inyección de S. aureus en la dermis profunda conduce a la formación de abscesos, permitiendo al mismo tiempo el estudio de los acontecimientos muy tempranos conducido por S. aureus se encuentran así como la participación de las respuestas inmunes que conducen a la curación fase.
Por último, otra característica importante de la metodología descrita aquí es que el mantenimiento de una estructura epitelial intacta da la posibilidad de analizar histológicamente la localización de las células inmunes y la activación de distintas vías que pueden ser espacio compartimentado. Bajo estas condiciones experimentales, de hecho, no se alteran las diferentes estructuras anatómicas de la piel y las células inmunes y mediadores inflamatorios se pueden visualizar en una localización precisa.
El uso de este método que conserva la distribución espacial de las células inmunes por lo tanto es ideal para entender mejor los roles de cada tipo celular durante infecciones fúngicas y bacterianas de la piel.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
FG es apoyado por la Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (IG 2016Id.18842), la Fundación Cariplo (Grant 2014-0655) y Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (FRRB).
IZ es apoyado por NIH grant 1R01AI121066-01A1, 1R01DK115217, HDDC P30 DK034854 grant, Harvard Medical School Milton Found, CCFA Senior Research Awards (412708), Eleanor y Miles Shore 50 aniversario programa de becas y la Fundación Cariplo ( 2014-0859).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| PBS | Euroclone | ECB4053L | warm in 37 °C bath before use |
| H-OCT compound | histo-line laboratories | R0030 | |
| Gill's Hematoxilyn | histo-line laboratories | 09-178-2 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | histo-line laboratories | 09-209-05 | |
| Ethanol absolute | scharlau | ET00232500 | |
| Citro-HISTOCLEAR | histo-line laboratories | R0050 | |
| Eukitt, mounting medium | bio-optica | ||
| Acetone | sigma-aldrich | 179124 | |
| PAS staining system | sigma-aldrich | 395B-1KT | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | |
| D(+)-Glucose anhydrous for molecular biology | Applichem PanReac | 50-99-7 | |
| Uridine | Merck Millipore | 8451 | |
| HEPES | Applichem PanReac | A1070,0500 | |
| Safe-Lock tubes 2 mL | eppendorf | 30121597 | |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596018 | Toxic, corrosive and mutagen. Use all precaution needed |
| Rneasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| liquid nitrogen | Wear eye protection | ||
| Instrument | |||
| Coulter Counter-Particle Count | Beckman Coulter | ||
| Centrifuge 5415 R | eppendorf | ||
| MC 3000 Microtome Cryostat | histo-line laboratories | ||
| TissueLiser | QIAGEN | ||
| Materials | |||
| 0.3 ml Insulin Syringe with a 30G x 8mm needle | BD | 324826 | |
| Surgical forceps | |||
| Surgical scissors | |||
| Base mould disposable | histo-line laboratories | 2781 | |
| Positively charged bio microscope slides | bio-optica | 09-2000 | |
| Cover slips 24 x 50 mm | thermo scientific | 11911998 |
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