Summary
Hier beschrijven we een protocol waarmee histologische en moleculaire analyse van monsters van de huid na Candida albicans intradermale injectie. Dit protocol behoudt zijn de structurele integriteit van de huid en zorgt voor de lokalisatie van weefsel-ingezeten of nieuw aangeworven immune cellen, alsmede de verspreiding van de ziekteverwekker.
Abstract
De huid is een zeer uitgebreide orgaan van het lichaam en, als gevolg van deze grote oppervlakte, het is voortdurend blootgesteld aan micro-organismen. Huid schade kan gemakkelijk leiden tot infecties in de dermis die kan, op hun beurt in de verspreiding van ziekteverwekkers in de bloedbaan resulteren. Inzicht in hoe het immuunsysteem vecht infecties in de zeer vroeg stadium en hoe de host kunt elimineren de ziekteverwekkers is een belangrijke stap om de basis voor toekomstige therapeutische interventies. Hier beschrijven we een model van Candida albicans infectie die de processen die zich tijdens een infectie voordoen, met inbegrip van wanneer het pathogene agens is verstreken, de epitheliale barrière, evenals de immune reactie ontlokte door de C. albicans vroeg kunt visualiseren invasie. We gebruikten deze infectie model histologische analyses die aantonen dat de immuuncellen die infiltreren in de huid, evenals de aanwezigheid en de lokalisatie van het pathogene agens uitvoeren. Monsters genomen nadat de infectie kan worden verwerkt voor RNA extractie.
Introduction
Het menselijk lichaam is bedekt met een extreem hoog aantal micro-organismen. De oppervlakte van de huid is de habitat van bijna een miljoen bacteriën per vierkante centimeter1. Dit nummer, echter overeen niet met het volledige scala aan micro-organismen die de huid koloniseert. Naast bacteriën, is het menselijk lichaam gekoloniseerd door vele schimmel soorten, met inbegrip van C. albicans, die in staat zijn om te overleven op de mucosa en de huid niveau2is.
In de afgelopen jaren is het percentage van de mensen gediagnosticeerd met schimmelinfecties enorm toegenomen. Dat komt vooral door het hogere aantal immuungecompromitteerde personen, dat wil zeggen, HIV-positieve patiënten en patiënten die zijn gegaan door chemotherapie of Immunosuppressieve medicijnen na transplantatie3. In een surveillance studie, uitgevoerd in de Verenigde Staten, toonde Wisplinghoff et al. dat 9,5% van de nosocomiale bloedbaan infecties werden veroorzaakt door Candida soorten4. Als gevolg van het toegenomen voorkomen van schimmelinfecties, en met name vanwege het verhoogde percentage van Candida -soorten infecties van de bloedbaan geconstateerde, is begrijpen hoe deze ziekteverwekker ontsnapt aan de controle van het immuunsysteem zeer belangrijk.
C. albicans is een dimorphic schimmel die in verschillende morfologische vormen zoals gist, blastospores, pseudohyphae en schimmeldraden afhankelijk van de omgevingsomstandigheden5 groeit. In zijn hyphal vorm, C. albicans toont van zijn hoogste capaciteit van invasiviteit en heeft de mogelijkheid om te penetreren het epitheel6.
C. albicans infecties zijn bestudeerd met behulp van verschillende experimentele benaderingen. Het meest voorkomende model van infectie is de intraveneuze injectie van C. albicans gist7. Echter houdt dit model niet rekening alle processen die gebeuren voordat de schimmel beheert te verspreiden in de bloedbaan. Een ander model maakt gebruik van de mogelijkheid van C. albicans invasie van het epithelium. Deze methode, ook bekend als het schuurpapier model8, werd ontwikkeld door Gaspari et al. in 19989, en bestaat uit het gebruik van schuurpapier aan de huid, waardoor het stratum corneum alvorens C. albicansabrade. Deze procedure kan de schimmel te doordringen van het epitheel, waardoor de analyse van de invasieve capaciteiten van deze pathogenen. Tot slot, andere modellen van infecties voor de gastro-intestinale10 en11 van de luchtwegen zijn gebruikt in verschillende studies.
De vorming van een wond (zoals in het schuurpapier model) zorgt ervoor dat de activering van verschillende opleidingstrajecten, met inbegrip van immuun cel aanwerving en activering, teneinde het helende proces12. Dit kan veranderen of maskeren de immuunrespons specifiek ontlokte tegen de ziekteverwekker, waardoor verstorende resultaten.
Hier beschrijven we een methode van huidinfectie die eerste wond vorming vermijdt en de inductie van een basale inflammatoire omgeving. Als u wilt behouden de intact epitheliale structuur, injecteren we direct C. albicans in zijn hyphal vorm in de diepe derma. Hoewel een enkele injectie milde ontsteking uitlokken kan, het bedrag van de ontsteking is beperkt en beperkt in vergelijking tot de vorming van een open wond in de zand papieren model. De aanpak die we hier beschrijven maakt het mogelijk de studie van de immuunrespons voor schimmelinfectie en verspreiding terwijl het vermijden van de buitensporige en reeds bestaande inflammatoire omgeving veroorzaakt door mechanische schade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alles wat de procedures waren goedgekeurd onder de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) en geëxploiteerd onder toezicht van de Vakgroep dierlijke bronnen op kinderen's ziekenhuis (boog) in Boston Children's Hospital of goedgekeurd door de Italiaanse Ministerie van volksgezondheid en verricht op grond van de institutionele Animal Care Comité bij de Universiteit van Milaan-Bicocca.
1. C. albicans voorbereiding
- Cultuur C. albicans, stam CAF3-113, in buizen met rijke medium (gist extract pepton dextrose (YEPD), 1% (m/v) gistextract, 2% (g/v) van Bacto pepton, 2% (g/v) glucose) aangevuld met uridine (50 mg/L) bij 25 ° C. Onder deze omstandigheden groeit C. albicans als een gist.
Opmerking: Andere stammen van C. albicans kunnen worden gebruikt, zoals de klinische isoleren C. albicans stam SC531413. Aangezien wij onlangs is gebleken dat de colitis proces wordt veroorzaakt door het activeren van het aangeboren immuunsysteem14, theoretisch elke C. albicans stam die optimale zowel componenten van de celwand en structuur, alsmede de kunnen afkomstig zijn van de projecties van het hyphal, kan worden gebruikt. - Bewaken van de cultuur door het tellen van de cellulaire concentratie met behulp van een cel teller analyzer.
- Oogst de cultuur als een concentratie van ongeveer 8 x 106 cellen/mL wordt bereikt. Ook een spectrofotometer gebruiken voor het meten van de OD600.
Opmerking: Meestal een waarde van OD600 = 1 komt overeen met een concentratie van de gist van 3 x 107 cellen/mL, maar titratie wordt aanbevolen. - Resuspendeer de cultuur in YEPD-uridine medium, gebruik HEPES (50 mM, pH 7.5) als een buffer-agent en de cultuur bij 37 ° C voor het opwekken van schimmeldraden formatie uit te broeden. Controleer hyphal formatie onder een microscoop op 100 X vergroting. Hyphal formatie is zichtbaar 5 h na kweken bij 37 ° C; echter gebruiken de cellen 16 h na incubatie bij 37 ° C wanneer het hyphal percentage bijna 95% van de totale cultuur bereikt.
- Als u wilt verder verrijken de voorbereiding in hyphal concentratie, centrifuge aliquots van de cultuur bij 3300 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in steriele PBS bij een concentratie van 1 x 108 schimmeldraden/mL.
2. diepe dermale injectie
- 24 h prior de infectie-procedure, anesthetize van de muizen met een intraperitoneale injectie van ketamine (80-100 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg), en dan scheren de flank van de muizen met behulp van een elektrische clipper.
Opmerking: Na elke procedure waarbij anesthesie, plaatst de muizen onder een lamp verwarming totdat zij efficiënt hebben teruggekregen. - Rusten de muizen gedurende 24 uur om te voorkomen dat een ontsteking als gevolg van het proces van het scheren.
- 24 uur na de ingreep scheren, anesthetize de muizen met een intraperitoneale injectie van ketamine (80-100 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg).
- Controleer de poot reflex om ervoor te zorgen dat de muizen diep zijn verdoofd. De paw reflex beoordelen door knijpen stevig de poot. Als de verdoving wordt bereikt, wordt het dier pijn niet voelen en niet beweegt.
- C. albicans schimmeldraden in de diepe derma met een 0.3 mL insuline-injectiespuit met een naald van de 30 G x 8 mm in een eindvolume van 50 µL/injectie, overeenkomt met 5 x 106 schimmeldraden/injectie te injecteren.
- Trek de huid van de geschoren flank strak gebruikend twee vingers om het volume rechtstreeks in de diepe derma injecteren. Plaats de naald met een hoek van 10-15° met de schuine kant van de naald naar boven.
- Met deze hoek, zullen het pathogene agens worden ingespoten met een diepte van ongeveer 300-500 µm. Om ervoor te zorgen dat de injectie is goed uitgevoerd, Controleer dat het geïnjecteerde volume vormt een hobbel dat is geabsorbeerd een paar minuten na de injectie.
Opmerking: De bult gevormd na de injectie van ongeveer 1 cm2zal worden. Dit is het gebied dat op het punt van de aangewezen tijd voor moleculaire of histologische analyse zal worden verwijderd. - Punten van minder dan 24 uur (aanbevolen) markeren voor tijd het gebied van infectie met een viltstift, aangezien de bult gevormd met de injectie voor een paar minuten aanhoudt, waarna het wordt geabsorbeerd. Voor de punten van de tijd van 24 uur of meer is deze stap niet vereist, aangezien een maagzweer of een cyste zal duidelijk zichtbaar zijn.
3. voorbeeld van de collectie en voorbereiding histologische kleuring
- De muizen volgens institutionele procedures euthanaseren.
- Met behulp van chirurgische pincet, trek de huid op de grens van de geïnjecteerde site, eerder is gemarkeerd met de marker pen. Met behulp van chirurgische scharen, accijnzen de geïnfecteerde site door het snijden van de huid na de duidelijke lijn.
Opmerking: Wees voorzichtig te scheiden van de huid van het buikvlies via ronde tip schaar. - Dompel de huid in een wegwerp basis mal gevuld met optimale scherpe temperatuur (OCT) samengestelde, met de interne kant van de huid boven. Bevriezen het monster in vloeibare stikstof totdat de verbinding wit wordt. Niet laat de vloeibare stikstof dekking van het monster, voordat het volledig is bevroren, aangezien dit het monster beschadigen zou.
Opmerking: Let op! Draag tijdens stap 3.3, een gelaatsscherm voor bescherming tegen vloeibare stikstof. - Indien de monsters niet onmiddellijk worden gebruikt voor het prepareren van objectglaasjes, bewaar ze snel bij-80 ° C.
Opmerking: Monsters kunnen worden opgeslagen bij-80 ° C voor onbepaalde tijd.
4. voorbereiding van de dia 's
- Snij het monster doormidden voor te bereiden op de segmenten histologie vanaf het midden van het monster.
- 5-µm dikke sneden met een cryostaat gesneden.
Opmerking: Voor monsters van de huid, de temperatuur van de cryostaat mag niet hoger zijn dan-25 ° C. Een hogere temperatuur zou veroorzaken, een gedeeltelijk smelten van de H-OCT en daarom niet in de juiste positie de monsters zou worden gehandhaafd ten tijdens de procedure snijden. - Positief geladen Microscoop dia's gebruiken voor het verzamelen van de segmenten.
- Als de verzamelde segmenten niet kort na de bereiding worden gebruikt, bewaar ze bij-20 ° C. Op dit punt, kunnen segmenten worden achtergelaten bij-20 ° C voor onbepaalde tijd.
5. de haematoxyline en eosine-kleuring
- Vlek van de dia's door onderdompeling in Gill Haematoxyline voor 4 min. Wash de dia's in stromend kraantjeswater voor 5 min.
- Vlek van de dia's door onderdompeling in eosine Y oplossing voor 1 min. Wash de dia's in stromend kraantjeswater voor 5 min. spoelen de dia's met behulp van gedestilleerd water voordat u doorgaat het protocol.
- Uitdrogen door onderdompeling in serieel toenemende concentraties van ethanol oplossingen (50%, 70%, 80%, 95%, 100%). Onderdompelen van de dia's voor 15 s in elke oplossing van ethanol.
- Hiermee schakelt u de dia's gedurende ten minste 2 minuten door onderdompeling in een histologisch clearing-agent.
- Monteer de dia's met behulp van montage medium en omslag enten.
- Verwerven van beelden van de dia's met een Microscoop dia scanner bij een 40 X vergroting.
6. periodieke Acid-Schiff (BK) kleuring
- Herstellen van de dia's met ≥99.5% aceton bij kamertemperatuur voor 1 min. Wash de dia's in stromend kraantjeswater voor 1 min.
- Vlek dia's in 3 wijzigingen van gedestilleerd water door onderdompeling in periodieke zure oplossing (1 g/dL) gedurende 5 minuten wassen met de dia's.
- Vlek van de dia's door onderdompeling in Schiff van reagens voor 15 min. Wash de dia's in stromend kraantjeswater voor 5 min.
- Vlekken van de dia's door onderdompeling in Gill Haematoxyline 5 min. wassen de dia's in stromend kraantjeswater voor 30 s.
- Het uitdrogen van de dia's door onderdompeling in 3 wijzigingen van 100% ethanol. Onderdompelen van de dia's voor 15 s telkens.
- Hiermee schakelt u de dia's gedurende ten minste 2 minuten door onderdompeling in een histologisch clearing-agent.
- Monteer de dia's met behulp van montage medium en omslag enten.
- Verwerven van beelden van de dia's met een Microscoop dia scanner.
7. voorbeeld van de collectie en voorbereiding van RNA extractie
- De muizen volgens institutionele procedures euthanaseren. Verwijder de huid monsters zoals in stap 3.2.
- Dompel de monsters in een tube module-cap 2 mL met 1 mL reagens voor zure guanidinium kaliumthiocyanaat-fenol-chloroform extractie.
Opmerking: Het protocol hier kan worden onderbroken en de monsters kunnen worden opgeslagen bij-80 ° C. - Snij het monster in stukken van ongeveer 0,2 cm2 met behulp van chirurgische pincet.
Opmerking: Let op! De meeste van de reagentia voor RNA isolatie zijn giftig en mutagene. Stap 7.3 en 7.4 moet gebeuren onder een zuurkast. - Het monster Smash met een kraal molen met een snelheid van 20 oscillaties/s voor 20 min. alternatief, een mechanische potter kan worden gebruikt.
- Controleer de effectieve homogenisering van de monsters door op zoek naar de aanwezigheid van intact stukken van huid. Herhaal deze stap als de monsters zijn niet volledig gehomogeniseerd.
- Centrifugeer de monsters bij 16.000 x g gedurende 1 min. houden het supernatant voor RNA extractie en gooi de pellet. Deze stap wordt uitgevoerd om te elimineren haar en vuil dat de extractie-kolommen kan blokkeren.
- Doorgaan met RNA extractie met behulp van RNA zuivering kolommen14.
- Het gebruik van een spectrofotometer RNA reiniging en concentratie te beoordelen. Als RNA extracten niet onmiddellijk voor cDNA voorbereiding gebruikt worden, slaan de monsters bij-80 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Door de injectie van het pathogene agens rechtstreeks in de diepe derma blijft de structurele morfologie van het weefsel intact (figuur 1A).
De handhaving van de structurele integriteit van de huid kan de detectie van immune cellen en hun lokalisatie op de site van infectie. De hogere vergroting weergegeven in figuur 1B onthult dat het abces bestaat voornamelijk uit polymorfonucleaire leukocyten (PMCs) waarin de verspreiding van het pathogene agens door haar opsluiting op de site van infectie. Aanwerving van PMCs, zoals neutrofielen, kan de vorming van het abces, dus het vermijden van de verspreiding van de schimmel binnen het weefsel14. Hogere vergrotingen (Figuur 1 c, D) laten zien hoe de omliggende gebieden van het abces ook in PMCs zijn verrijkt.
Door het handhaven van de structurele integriteit, kan de lokalisatie van het pathogene agens tijdens de infectie worden bepaald. Profiteren van de verhoogde hoeveelheid polysacchariden in de celwand van C. albicans, de identificatie van het pathogeen werd uitgevoerd met behulp van PAS kleuring, die een kleur paars-magenta geeft aan de schimmel. Zoals blijkt uit figuur 2A, PAS kleuring toont duidelijk aan dat het pathogene agens is beperkt binnen het abces, gevormd door de indienstneming van granulocyten14. C. albicans is duidelijk zichtbaar op de hogere vergroting (figuur 2B), en het lijkt te worden omringd door necrotische en immuun cellen.
Met behulp van de hierboven beschreven methode, kunnen het proces van de infectie en de daaruit voortvloeiende ontsteking worden gevolgd na verloop van tijd. Bij de zeer begin, immuun cel leidt aanwerving tot de vorming van een abces (figuur 1A en figuur 3A). Wanneer de analyse van het huidweefsel werd verlengd tot 48-72 uur, de verstoring van de structuren van de huid en de vorming van een litteken werd gevisualiseerd (figuur 3B, C). De vorming van deze structuur is te wijten aan de helende fase, die volgt op de uitzetting van de pathogeen-14.
Het proces dat tot de vorming van een zweer leidt kan worden gevolgd voor enkele dagen na de infectie. Zoals blijkt uit figuur 4A, weergeven C57BL/6 wild-type muizen een colitis proces dat na verloop van tijd verhoogt. Ongeveer Toon 70-80% van de muizen vorming van ulcère 72 uur na besmetting. Als gevolg van de variabiliteit van het experimentele, moeten ten minste 8 muizen worden gebruikt in elk experiment. Voor statistische analyse, is het aanbevolen om het gebruik van een minimum van 8-10 muizen voor elke ulceratie score als vergelijken verschillende genotypen of behandelingen. In dit geval moet zelfs kleine verschillen zichtbaar zijn. Illustratieve afbeeldingen van de colitis proces worden getoond in figuur 4B. Bij specifieke behandelingen of genetische tekortkomingen, de vorming van de zweer kan worden verminderd en/of ingetrokken14. In sommige gevallen, wordt in plaats van het Ulcus, een cyste gevormd, zoals geïllustreerd in figuur 4C.
Buiten de haematoxyline en eosine en PAS kleuring, de dia's kunnen worden gekleurd voor een specifieke cellulaire markers of met andere immunohistochemische technieken om beter te visualiseren: collageenvezels; cytokine/chemokines locatie in het weefsel; en immuun cel identiteit en ruimtelijke verdeling.
Naast histologisch preparaat, kunnen steekproeven ook worden gebruikt voor moleculair analyses. De gehele injectieplaats kan worden weggesneden, wat betreft de histologische preparaten, en verwerkt voor RNA extractie. RNA extractie uit het weefsel maakt de studie en de identificatie van deze genen-upregulated tijdens de infectie met het pathogene agens oplevert. De mogelijkheid voor het verwerken van de monsters voor moleculair analyses is een belangrijk instrument is, samen met de histologische analyse, om beter karakteriseren het soort immune reactie ontlokte tegen het pathogene agens en de verordening tijdens de vroege en late stadia na de uitdaging14.
Figuur 1: onderhoud van de huid morfologie en cellulaire lokalisatie. (A) alle lagen worden bewaard. Epitheel, adipocytes en spiercellen zijn gemakkelijk herkenbaar. (B) polymorfonucleaire leukocyten (gemarkeerd met pijlen) kunnen worden geïdentificeerd binnen het abces. (C, D) Hogere vergrotingen Toon de aanwezigheid van polymorfonucleaire leukocyten (pijlen) in het gebied rond het abces. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Identificatie van C. albicans. (A) C. albicans kan worden opgespoord in het weefsel met de PAS kleuring. (B) hogere vergroting beter visualiseren de schimmel, gekleurd in het paars, beperkt binnen het abces. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: follow-up van het inflammatoire proces. (A) aan het begin van het inflammatoire proces ontlokte door C. albicans injectie, granulocyten worden gerekruteerd om te vormen van een abces te beperken van het pathogene agens oplevert. (B, C) De vorming van ulcère is noodzakelijk voor de uitwijzing van de schimmel. Het helende weefsel wordt gekenmerkt door een verandering in de structurele integriteit van de huid en kan leiden tot de vorming van een litteken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: kinetiek van ulceratie. (A) de colitis proces volgt een trend van toename tijdens de eerste dagen na de infectie. 72 h na de infectie, 70-80% van de muizen toont een zweer op de plaats van de infectie. 16 C57BL/6 wild type dieren werden gebruikt. (B) illustratieve foto's van zweren die 48 uur na infectie ontwikkeld. (C) illustratieve foto's van cyste vorming na infectie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschreven we een methode van C. albicans infectie te bestuderen van het inflammatoire proces dat wordt gestart bij de ingang van de schimmel in de diepe derma.
Hoewel huid abces formatie een relatief zeldzame gebeurtenis op C. albicans infectie15 is, kan injectie van de schimmel direct in de diepe derma niet alleen de studie van fungale gestuurde abces vorming, maar ook de analyse van specifieke immune cellen die deel uitmaken van bevatten schimmel verspreid. Met de hier beschreven methode, is het mogelijk om te bestuderen de interactie tussen immune cellen, alsmede de aanwerving van de immuuncellen die belangrijk zijn voor de controle van de schimmel verspreiding, terwijl het vermijden van een ontstekingsreactie tegen mechanische schade of wond vorming. Inderdaad, de mogelijkheid om te houden van de epitheliale structuur intact is belangrijk om te voorkomen dat de ontwikkeling van een inflammatoire omgeving veroorzaakt door een mechanische prikkel, zoals een schuren. Als theorized voor de eerste keer door Polly Matzinger in 199416, kunnen schade signalen, in feite, het activeren van een immuunrespons en daarom krachtig beïnvloeden de immune reactie ontlokte door het pathogene agens oplevert.
Schade in verband moleculaire patronen (DAMPs) kunnen afkomstig zijn uit dode cellen, maar ze kunnen ook worden vrijgegeven onder stress-omstandigheden. Aangezien deze signalen kunnen worden geproduceerd in situaties van weefselschade, zou de vorming van een wond een hyper-inflammatoire omgeving zelfs vóór de context van een infectie veroorzaken. De methode die wij hebben beschreven de vrijlating van DAMPs beperkt en beperkt zo de aanwezigheid van verstorende elementen.
Bovendien is de injectie van een ziekteverwekker rechtstreeks in de diepe derma is een methodologie die kan worden gebruikt, niet alleen voor schimmelinfecties, maar ook voor bacteriële uitdagingen. Een andere pathogenen die verantwoordelijk zijn voor een verhoogd aantal gevallen van beide cutane en bloedbaan infecties is Staphylococcus aureus4. We hebben onlangs aangetoond hoe dit protocol is ook een belangrijk instrument om te studeren van S. aureus -infectie14. S. aureus is met name bekend in kliniek voor haar vermogen om vorm abcessen in verschillende districten van de lichaam-17. Injectie van S. aureus in het diepe derma leidt tot de vorming van abcessen, waardoor tegelijkertijd de studie van de zeer vroege evenementen, die verreden door S. aureus tegenkomen evenals de betrokkenheid van de immuunrespons die tot de genezing leiden fase.
Ten slotte, een ander belangrijk kenmerk van de hier beschreven methode is dat het onderhoud van een intact epitheliale structuur de mogelijkheid geeft om het histologisch analyseren de lokalisatie van immune cellen en de activering van verschillende trajecten die kunnen worden ruimtelijk gecompartimenteerd. Onder deze experimentele omstandigheden, in feite, de verschillende anatomische structuren van de huid niet worden gewijzigd en zowel immuuncellen en inflammatoire mediatoren kunnen worden gevisualiseerd in een precieze locatie.
Het gebruik van deze methode die de ruimtelijke spreiding van immuuncellen bewaart is daarom ideaal voor een beter begrip van de rol van elke cellulaire type tijdens schimmel en bacteriële huidinfecties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
FG wordt ondersteund door de Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (IG 2016Id.18842), Cariplo Foundation (Grant 2014-0655) en Fondazione Regionale per la Ricerca Henelit (FRRB).
IZ wordt ondersteund door de NIH grant 1R01AI121066-01A1, 1R01DK115217, HDDC P30 DK034854 grant, Harvard Medical School Milton gevonden, CCFA Senior Research Awards (412708), de Eleanor en Miles Shore 50e verjaardag Fellowship-programma, en de Cariplo Foundation ( 2014-0859).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| PBS | Euroclone | ECB4053L | warm in 37 °C bath before use |
| H-OCT compound | histo-line laboratories | R0030 | |
| Gill's Hematoxilyn | histo-line laboratories | 09-178-2 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | histo-line laboratories | 09-209-05 | |
| Ethanol absolute | scharlau | ET00232500 | |
| Citro-HISTOCLEAR | histo-line laboratories | R0050 | |
| Eukitt, mounting medium | bio-optica | ||
| Acetone | sigma-aldrich | 179124 | |
| PAS staining system | sigma-aldrich | 395B-1KT | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | |
| D(+)-Glucose anhydrous for molecular biology | Applichem PanReac | 50-99-7 | |
| Uridine | Merck Millipore | 8451 | |
| HEPES | Applichem PanReac | A1070,0500 | |
| Safe-Lock tubes 2 mL | eppendorf | 30121597 | |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596018 | Toxic, corrosive and mutagen. Use all precaution needed |
| Rneasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| liquid nitrogen | Wear eye protection | ||
| Instrument | |||
| Coulter Counter-Particle Count | Beckman Coulter | ||
| Centrifuge 5415 R | eppendorf | ||
| MC 3000 Microtome Cryostat | histo-line laboratories | ||
| TissueLiser | QIAGEN | ||
| Materials | |||
| 0.3 ml Insulin Syringe with a 30G x 8mm needle | BD | 324826 | |
| Surgical forceps | |||
| Surgical scissors | |||
| Base mould disposable | histo-line laboratories | 2781 | |
| Positively charged bio microscope slides | bio-optica | 09-2000 | |
| Cover slips 24 x 50 mm | thermo scientific | 11911998 |
References
- Belkaid, Y., Segre, J. A. Dialogue between skin microbiota and immunity. Science. 346 (6212), 954-959 (2014).
- Kashem, S. W., Kaplan, D. H. Skin Immunity to Candida albicans. Trends Immunol. 37 (7), 440-450 (2016).
- Havlickova, B., Czaika, V. A., Friedrich, M.
- Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. P., Edmond, M. B. Nosocomial Bloodstream Infections in US Hospitals: Analysis of 24,179 Cases from a Prospective Nationwide Surveillance Study. Clin Infect Dis. 39 (3), 309-317 (2004).
- Romani, L. Immunity to fungal infections. Nat Rev Immunol. 4 (1), 11-24 (2004).
- Odds, F. C.
- MacCallum, D. M., Odds, F. C. Temporal events in the intravenous challenge model for experimental Candida albicans infections in female mice. Mycoses. 48 (3), 151-161 (2005).
- Dai, T., Kharkwal, G. B., Tanaka, M., Huang, Y. -Y., Bil de Arce, V. J., Hamblin, M. R. Animal models of external traumatic wound infections. Virulence. 2 (4), 296-315 (2018).
- Gaspari, A. A., Burns, R., Nasir, A., Ramirez, D., Barth, R. K., Haidaris, C. G. CD86 (B7-2), but not CD80 (B7-1), expression in the epidermis of transgenic mice enhances the immunogenicity of primary cutaneous Candida albicans infections. Infect Immun. 66 (9), 4440-4449 (1998).
- Koh, A. Y. Murine models of Candida gastrointestinal colonization and dissemination. Eukaryot Cell. 12 (11), 1416-1422 (2013).
- Mear, J. B., et al. Candida albicans Airway Exposure Primes the Lung Innate Immune Response against Pseudomonas aeruginosa Infection through Innate Lymphoid Cell Recruitment and Interleukin-22-Associated Mucosal Response. Infect Immun. 82 (1), 306-315 (2014).
- Leoni, G., Neumann, P. -A., Sumagin, R., Denning, T. L., Nusrat, A. Wound repair: role of immune-epithelial interactions. Mucosal Immunol. 8 (5), 959-968 (2015).
- Fonzi, W. A., Irwin, M. Y. Isogenic strain construction and gene mapping in Candida albicans. Genetics. 134 (3), 717-728 (1993).
- Santus, W., et al. Skin infections are eliminated by cooperation of the fibrinolytic and innate immune systems. Sci Immunol. 2 (15), (2017).
- Florescu, D. F., Brostrom, S. E., Dumitru, I., Kalil, A. C. Candida albicans Skin Abscess in a Heart Transplant Recipient. Infect Dis Clin Pract. 18 (4), 243-246 (2010).
- Pradeu, T., Cooper, E. L. The danger theory: 20 years later. Front Immunol. 3, 287 (2012).
- Cheng, A. G., DeDent, A. C., Schneewind, O., Missiakas, D. A play in four acts: Staphylococcus aureus abscess formation. Trends Microbiol. 19 (5), 225-232 (2011).
