Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

עמוק עורי הזרקת כמו מודל של קנדידה אלביקנס דלקת עור עבור ניתוחים היסטולוגית

Published: June 13, 2018 doi: 10.3791/57574
Automatic Translation
1, 1, 1, *1, *1,2
1Department of Biotechnology and Biosciences, University of Milano-Bicocca, 2Harvard Medical School and Division of Gastroenterology, Boston Children's Hospital
* These authors contributed equally

Summary

כאן נתאר פרוטוקול המאפשר ניתוח היסטולוגית ומולקולרית של דגימות עור לאחר ההזרקה intradermal קנדידה אלביקנס . פרוטוקול זה שומר על שלמות המבנה של העור ומאפשר הלוקליזציה של תאים חיסוניים רקמות-תושב או שזה עתה מגויסים, כמו גם את ההתפלגות הפתוגן.

Abstract

העור הוא איבר מאוד מורחבת של הגוף, עקב זה משטח גדול, ללא הרף ייחשף מיקרואורגניזמים. נזק לעור יכול בקלות להוביל דלקות הדרמיס והתוצאה בתורו, יכול, להיות הפצת פתוגנים למחזור הדם. הבנת איך מערכת החיסון נלחם זיהומים בשלב מוקדם מאוד, איך המחשב המארח יכול לחסל פתוגנים היא צעד חשוב כדי להגדיר את הבסיס עבור התערבויות טיפוליות עתידיות. כאן נתאר מודל של זיהום קנדידה אלביקנס שיכולים להמחיש את התהליכים המתרחשים מוקדם במהלך זיהום, כולל בעת המחלה עברה את מחסום האפיתל, כמו גם את התגובה החיסונית שהפיק את אלביקנס ג הפלישה. השתמשנו מודל זיהום זה כדי לבצע ניתוח היסטולוגית המציגים את התאים החיסוניים זה לחדור את העור, כמו גם את הנוכחות ואת לוקליזציה של המחלה. הדגימות שנאספו לאחר הזיהום ניתן לעבד לחילוץ RNA.

Introduction

גוף האדם מכוסה עם מספר גבוה מאוד של מיקרואורגניזמים. לפני השטח של העור הוא בית הגידול של כמעט מיליון חיידקים לכל סנטימטר מרובע1. מספר זה, עם זאת, אינו משקף על המגוון המלא של מיקרואורגניזמים והצנרות העור. בנוסף חיידקים, גוף האדם הוא התנחלו על ידי מינים פטרייתי רבים, כולל אלביקנס ג, שזה מסוגל לשרוד הן את הרירית והן את העור ברמה2.

בשנים האחרונות גדל מאוד האחוז של אנשים שאובחנו עם זיהומים פטרייתיים. זאת בעיקר בשל העלייה במספר אנשים immunocompromised, קרי, חולי HIV-חיובי. וכלפי מטופלים עברו כימותרפיה או תרופות לדיכוי המערכת החיסונית לאחר השתלת3. במחקר מעקב שנערך בארצות הברית, Wisplinghoff. et al. הראה כי 9.5% של זיהומים nosocomial למחזור הדם שנגרמו על ידי זנים של קנדידה 4. עקב המופע מוגברת של זיהומים פטרייתיים, במיוחד בגלל האחוז מוגברות של קנדידה מינים נמצאו במהלך זיהומים למחזור הדם, הבנת איך הפתוגן הזה בורח השליטה של מערכת החיסון היא מאוד חשוב.

ג אלביקנס הוא בפטריה dimorphic שגדלה בצורות מורפולוגיות שונות כגון שמרים, blastospores, pseudohyphae ו- hyphae בהתאם לתנאים סביבתיים5. בצורתו hyphal, אלביקנס ג מציג את הקיבולת הגבוהה שלו invasiveness ויש לו את היכולת לחדור את אפיתל6.

זיהומים אלביקנס ג נחקרו באמצעות מספר גישות ניסיוניות. המודל הנפוץ ביותר של זיהום הוא הזרקה תוך ורידי של שמרים אלביקנס ג 7. עם זאת, מודל זה לא להתחשב בכל התהליכים זה יקרה לפני הפטריה מצליח להתפשט למחזור הדם. מודל נוסף מנצל היכולת של אלביקנס ג לפלוש האפיתל. בשיטה זו, המכונה גם נייר דגם8, פותחה על ידי Gaspari et al. . ב 19989, מורכב באמצעות נייר חול כדי תשפשפו את העור, וכך למנוע את הקרנית לפני החלת אלביקנס ג. הליך זה מאפשר את הפטרייה לחדור האפיתל, ובכך מאפשר ניתוח פולשני ביכולות של הפתוגן הזה. לבסוף, דגמים אחרים של זיהומים במערכת העיכול10 ו כלי הנשימה11 השתמשו במחקרים שונים.

היווצרות פצע (כמו דגם נייר חול) גורמת את ההפעלה של כמה מסלולים, כולל תא החיסון גיוס והפעלה, על מנת לקדם את תהליך הריפוי12. זה יכול לשנות או להסתיר את התגובה החיסונית במיוחד elicited נגד המחלה, ובכך מוביל משתנה מתערב תוצאות.

כאן נתאר שיטת דלקת עור זה מונע היווצרות פצע הראשונית ואת של אינדוקציה של סביבה דלקתית הבזליים. כדי לשמור על המבנה אפיתל ללא פגע, ישירות נזריק אלביקנס ג בצורתה hyphal ב למחרת היום עמוק. אף-על-פי זריקה אחת יכול להפיק דלקת קלה, הכמות של דלקת מוגבלת, מוגבל לעומת היווצרות פצע פתוח כמו דגם נייר חול. הגישה כי אנו מתארים כאן מאפשר המחקר של התגובה החיסונית לזיהום פטרייתי, התפשטה תוך הימנעות הסביבה דלקתית מוגזמת ולא קיימים נגרם נזק מכני.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים היו מאושרים תחת טיפול בעלי חיים מוסדיים ו שימוש הוועדה (IACUC) ולא פעלו תחת פיקוחו של המחלקה של משאבים בעלי חיים לילדים חולים (קשת) בבית החולים לילדים בבוסטון או אושרו על-ידי האיטלקי משרד הבריאות והופיע תחת מוסדיים חיה טיפול הוועדה ב האוניברסיטה של מילאנו-ביקוקה.

1. הכנה ג אלביקנס

  1. תרבות ג אלביקנס, זן CAF3-113, צינורות המכילות בינוני עשיר (דקסטרוז peptone תמצית שמרים (YEPD), תמצית שמרים 1% (w/v), 2% (w/v) מה נשארתי Peptone, 2% (w/v) גלוקוז) בתוספת uridine (50 מ"ג/ליטר) ב 25 º C. בתנאים אלה אלביקנס ג גדל כמו שמרים.
    הערה: זנים אחרים אלביקנס ג יכול לשמש, כגון זן SC5314 אלביקנס ג 13לבודד קליני. מאז לאחרונה הראו כי התהליך כיבית הנגרמת על ידי הפעלת מערכת החיסון המולדת14, תיאורטית כל זן אלביקנס ג המתחזק את רכיבי קיר התא והן המבנה, כמו גם היכולת מקורם ההקרנות hyphal, יכול לשמש.
  2. נטר את התרבות על ידי ספירת הריכוז הסלולר באמצעות מנתח מונה תא.
  3. הקציר התרבות כאשר הוא מגיע ריכוז של 8 x 106 תאים למ"ל. לחלופין, השתמש ספקטרופוטומטרים כדי למדוד את יתר600.
    הערה: בדרך כלל, ערך של יתר600 = 1 מקביל ריכוז השמרים של 3 x 107 תאים למ"ל, אך מומלץ טיטור.
  4. Resuspend התרבות YEPD-uridine בינוני, באמצעות HEPES (50 מ מ, pH 7.5) כסוכן מאגר, דגירה התרבות ב 37 ° C כדי לעודד היווצרות hyphae. בדוק היווצרות hyphal תחת מיקרוסקופ בהגדלה X 100. צורה hyphal היא גלויה 5 שעות לאחר culturing ב 37 מעלות צלזיוס; עם זאת, להשתמש התאים 16 h לאחר דגירה ב 37 מעלות צלזיוס כאשר האחוז hyphal מגיע כמעט 95% של התרבות הכולל.
  5. להעשיר עוד את ההכנה בריכוז hyphal, צנטריפוגה aliquots של התרבות-3,300 g x עבור 5 דק. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב- PBS סטרילי-ריכוז של עונה 1 פרק 108 hyphae/mL....

2. הזרקת עורי עמוק

  1. 24 שעות לפני ההליך זיהום, עזים ומתנגד העכברים עם זריקה בקרום הבטן של קטאמין (80-100 מ"ג/ק"ג), חריגות השירותים הווטרינריים (10 מ"ג/ק"ג), ואז מגלחים את האגף של העכברים באמצעות של קוצץ חשמלי.
    הערה: לאחר כל נוהל הכרוכים בהרדמה, הנח העכברים תחת מנורת חימום עד הם התאוששו ביעילות.
  2. שאר העכברים במשך 24 שעות ביממה למנוע כל דלקת עקב תהליך הגילוח.
  3. 24 שעות לאחר הניתוח גילוח, עזים ומתנגד העכברים עם זריקה בקרום הבטן של קטאמין (80-100 מ"ג/ק"ג), חריגות השירותים הווטרינריים (10 מ"ג/ק"ג).
  4. בדוק את רפלקס כפה על מנת להבטיח כי העכברים הם מרדימים עמוקות. להעריך את רפלקס פאו מאת בחוזקה צובט את כף הרגל. אם ההרדמה מושגת, החיה לא להרגיש כאב, לא זזה.
  5. מזריקים hyphae אלביקנס ג ב למחרת עמוק באמצעות מזרק אינסולין 0.3 mL עם מחט 30 G x 8 מ מ נפח סופי של 50 µL הזרקה, המקביל 5 x 106 hyphae הזרקה.
    1. משוך את העור של האגף מגולח מתוח בעזרת שתי אצבעות כדי להזריק את עוצמת הקול ישירות בלמחרת היום עמוק. הכנס את המחט עם זווית של 10-15° עם שפוע של המחט פונה כלפי מעלה.
    2. בזווית זו, המחלה להיות מוזרק עם עומק של 300-500 מיקרומטר. כדי להבטיח שההזרקה מבוצעת טוב, בדוק האחסון מוזרק יוצר בליטה זה נספג כמה דקות לאחר ההזרקה.
      הערה: בליטה נוצרו לאחר הזריקה יהיה של 1 ס מ.2. זהו האזור יוסר בנקודת הזמן המיועד לבדיקה היסטולוגית או מולקולרית.
    3. נקודות זמן על פחות מ 24 שעות (מומלץ) לסמן את האזור של זיהום עם עט מרקר, מאז המכשול הקים עם ההזרקה נמשכת לכמה דקות, אחרי אשר נספגות. עבור נקודות זמן של 24 שעות או יותר, שלב זה אינו נדרש, כי אולקוס או ציסטה יהיה גלוי בבירור.

3. לטעום איסוף והכנה היסטולוגית מכתים

  1. המתת חסד העכברים על פי הנהלים מוסדיים.
  2. בעזרת מלקחיים כירורגיים, משוך את העור בגבול של אתר מוזרק, שסומן קודם לכן עם טוש. באמצעות מספריים כירורגיים, לסלק את האתר הנגוע על ידי חיתוך העור אחרי קו מסומן.
    הערה: להיות זהירים להפריד את העור הצפק בעזרת המספריים עגול.
  3. לטבול את העור של תבנית הבסיס חד פעמי מלא עם טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) במתחם, עם הצד הפנימי של העור כלפי מעלה. להקפיא את הדגימה של חנקן נוזלי עד למתחם הופך לבן. לא נותנים החנקן הנוזלי לכסות המדגם לפני זה קפוא לחלוטין כפי שזה היה פוגע. המדגם.
    הערה: זהירות! במהלך שלב 3.3, ללבוש מגן הפנים להגנה מפני חנקן נוזלי.
  4. אם הדגימות לא משמשים מיד להכנה שקופיות, במהירות לאחסן אותם ב- 80 ° c
    הערה: דוגמאות שניתן לאחסן ב- 80 ° C ללא הגבלת זמן.

4. הכנה של שקופיות

  1. לחצי את הדגימה כדי להכין את הפרוסות היסטולוגיה החל המרכז של המדגם.
  2. חותכים 5-מיקרומטר פרוסות עבות עם cryostat.
    הערה: עבור דגימות עור, הטמפרטורה של cryostat לא צריך להיות גבוה מ-25 מעלות צלזיוס. טמפרטורה גבוהה יותר תגרום התכה חלקית של ה-H-OCT ומתוחזק ולכן הדגימות לא להיות בתנוחה הנכונה במהלך ההליך חיתוך.
  3. השתמש שקופיות מיקרוסקופ הטעון חיובית כדי לאסוף את הפרוסות.
  4. אם הפרוסות שנאספו לא משמשים מיד לאחר ההכנה, לאחסן אותם ב-20 ° C. בשלב זה, פרוסות שניתן לאחסן ב-20 ° C ללא הגבלת זמן.

5. hematoxylin & אאוזין מכתים

  1. כתם השקופיות על-ידי טבילה hematoxylin של גיל עבור 4 דק לשטוף את השקופיות פועל מי ברז למשך 5 דקות.
  2. כתם שהשקופיות על-ידי טבילה אאוזין Y לפתרון מינימלית 1 לשטוף את השקופיות פועל ברז מים במשך 5 דקות יש לשטוף את השקופיות בעזרת מים מזוקקים לפני שתמשיך את הפרוטוקול.
  3. מייבשים על ידי טבילה באופן סדרתי הגדלת ריכוזי אתנול פתרונות (50%, 70%, 80%, 95%, 100%). לטבול את השקופיות 15 s בכל הפתרונות אתנול.
  4. לנקות את השקופיות למשך לפחות 2 דקות על ידי טבילה סוכן סליקה היסטולוגית.
  5. לטעון את השקופיות בעזרת הרכבה בינונית, שער גולשת.
  6. לרכוש תמונות של השקופיות עם סורק שקופיות מיקרוסקופ בהגדלה גדולה-X 40.

6. חומצה המחזורית-שיף (PAS) מכתים

  1. לתקן השקופיות עם אצטון % ≥99.5 בטמפרטורת החדר במשך דק 1. שטיפת בשקופיות זורמים מהברז עבור 1 דקות.
  2. כתם השקופיות על-ידי טבילה בפתרון המחזורית חומצה (1 g/dL) עבור 5 דק שטיפת בשקופיות 3 שינויים של מים מזוקקים.
  3. כתם השקופיות על-ידי טבילה ריאגנט של שיף במשך 15 דקות לשטוף את השקופיות פועל מי ברז למשך 5 דקות.
  4. כתם על השקופיות על-ידי טבילה hematoxylin של גיל עבור 5 דק. לשטוף את השקופיות מפעיל ברז ל 30 s.
  5. מייבשים את השקופיות על-ידי טבילה 3 שינויים של 100% אתנול. לטבול את השקופיות 15 s בכל פעם.
  6. לנקות את השקופיות למשך לפחות 2 דקות על ידי טבילה סוכן סליקה היסטולוגית.
  7. לטעון את השקופיות בעזרת הרכבה בינונית, שער גולשת.
  8. לרכוש תמונות של השקופיות עם סורק שקופיות מיקרוסקופ.

7. לטעום איסוף והכנה החילוץ-RNA

  1. המתת חסד העכברים על פי הנהלים מוסדיים. הסר את דגימות עור כמו שלב 3.2.
  2. לטבול את הדגימות צינור כובע הצמד 2 מ"ל עם 1 מ"ל של ריאגנט לחילוץ thiocyanate-פנול-כלורופורם חומצה guanidinium.
    הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן, ניתן לאחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס.
  3. לחתוך את הדגימה לחתיכות של 0.2 ס מ2 באמצעות מלקחיים כירורגיים.
    הערה: זהירות! רוב ריאגנטים עבור בידוד ה-RNA הם רעילים מוטגניות. צעדים 7.3 7.4 חייב להיעשות תחת ברדס fume.
  4. לרסק את הדגימה עם מפעל חרוז במהירות של תנודות בשנייה 20 על 20 דק. לחלופין, קדר מכני יכול לשמש.
  5. בדוק את המגון יעיל של הדגימות וחיפש את הנוכחות של חתיכות שלמות של העור. חזור על שלב זה אם הדגימות לא הומוגני לגמרי.
  6. Centrifuge הדגימות-16,000 x g עבור 1 מינימלית לשמור את supernatants לחילוץ RNA וזורקים בגדר. שלב זה מבוצע כדי לחסל שיער ופסולת יכול לחסום את העמודות החילוץ.
  7. להמשיך עם החילוץ-RNA באמצעות עמודות טיהור רנ א14.
  8. השתמש ספקטרופוטומטרים לאמוד ריכוז וטיהור של RNA. אם RNA תמציות לא משמשים מיד להכנה cDNA, אחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

באמצעות ההזרקה של המחלה ישירות בלמחרת היום עמוק, המורפולוגיה מבנית של רקמת נשאר שלם (איור 1 א').

שמירה על העור המבנית מאפשרת הגילוי של תאים חיסוניים ולוקליזציה שלהם באתר של זיהום. ההגדלה גבוה יותר באיור איור 1B מגלה כי המורסה מורכבת בעיקר מ אורך חייהם לויקוציטים (PMCs) המכילים את התפשטות המחלה על ידי ריתוק שלה באתר של זיהום. גיוס של PMCs, כגון נויטרופילים, מאפשרת היווצרות של המורסה, וכך למנוע הפצת הפטרייה בתוך רקמת14. הגדלה גבוהה יותר (איור 1C, D) מראים איך והסביבה של המורסה גם מועשרים ב- PMCs.

על ידי שמירה על שלמות המבנה, הלוקליזציה של המחלה במהלך הזיהום יכול להיקבע. ניצול של התוכן מוגברות של סוכרים בדופן התא אלביקנס ג, זיהוי המחלה בוצעה באמצעות צביעת PAS, מה שנותן צבע סגול-אדום-מגנטה הפטריה. כפי שמוצג באיור 2A, צביעת PAS מראה בבירור כי המחלה מוגבל בתוך המורסה, שהוקמה על ידי הגיוס של גרנולוציטים14. ג אלביקנס בבירור בהגדלה גבוהה יותר (איור 2B), נראה להיות מוקף עם נמק ותאי מערכת החיסון.

באמצעות השיטה המתוארת לעיל, תהליך זיהום ודלקת הסוגר ניתן בעקבות לאורך זמן. מהתא ממש בהתחלה, המערכת החיסונית גיוס מוביל להיווצרות מורסה (איור 1A ו- 3A איור). בעת הניתוח של רקמת העור הוארכו עד 48-72 שעות, שיבוש המבנים העור ואת היווצרות צלקת היה מדמיין (איור 3B, ג). היווצרות של מבנה זה הוא שלב הריפוי כי בעקבות הגירוש של פתוגן14.

תהליך שמוביל להיווצרות כיב ניתן בעקבות מספר ימים לאחר ההדבקה. כפי שמוצג באיור 4A, C57BL/6 פראי-סוג עכברים להציג תהליך כיבית המגבירה לאורך זמן. בסביבות 70-80% של העכברים להציג היווצרות כיב 72 h לאחר ההדבקה. עקב השתנות ניסיוני, עכברים לפחות 8 צריך לשמש בכל ניסוי. לשם ניתוח סטטיסטי, מומלץ להשתמש לפחות 8-10 עכברים עבור כל ציון כיבת אם השוואת אחרים שונים או טיפולים. במקרה זה, הבדלים קטנים אפילו צריך להיות גלוי. תמונות המחשה של תהליך כיבית מוצגים באיור 4B. על טיפולים ספציפיים או ליקויים גנטיים, היווצרות הכיב יכול להיות מופחת ו/או יושב14. במקרים מסוימים, במקום הכיב, ציסטה נוצרת, כמופיע ב- 4C איור.

חוץ Hematoxylin & אאוזין, צביעת PAS, השקופיות יכול להיות מוכתם או סמני הסלולר ספציפי או עם אחרים stainings immunohistochemical משופרת: סיבי קולגן; ציטוקין/נוגדנים למיקום בתוך הרקמה; תא החיסון זהות, התפוצה המרחבית.

בנוסף הכנה היסטולוגית, דגימות יכול לשמש גם ניתוחים מולקולריים. ההזרקה כולו ניתן טוחנות, לגבי הכנות היסטולוגית, ולעבד לחילוץ RNA. החילוץ-RNA מתוך הרקמה מאפשר לימוד זיהוי של upregulated הגנים האלה במהלך הזיהום עם המחלה. האפשרות לעבד את הדגימות עבור ניתוחים מולקולריים היא כלי חשוב, יחד עם ניתוח היסטולוגית, כדי לאפיין את סוג התגובה החיסונית elicited נגד המחלה ורגולציה שלו בשלבים מוקדם ומאוחר לאחר אתגר14.

Figure 1
איור 1: תחזוקה של העור מורפולוגיה וסלולר הלוקליזציה. (א) כל השכבות נשמרים. האפיתל, adipocytes, תאי שריר הם קל לזיהוי. (B) אורך חייהם לויקוציטים (מודגשים עם חצים) ניתן לזהות בתוך המורסה. (C, D) הגדלה גבוהה יותר להציג את הנוכחות של אורך חייהם לויקוציטים (חיצים) באזור הסובב את האבצס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: זיהוי של אלביקנס ג. (א) ג אלביקנס יכולים להתגלות בתוך רקמת עם צביעת PAS. הגדלה גבוהה יותר (B) משופרת של הפטריה, צבעונית בסגול, מוגבלת בתוך המורסה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: המשך של תהליך דלקתי. (א) בתחילת מאוד של תהליך דלקתי שהפיק אלביקנס ג הזרקה, גרנולוציטים מגויסים כדי ליצור מורסה כדי לתחום את הפתוגן. (B, C) היווצרות של אולקוס הכרחית גירושו של הפטריה. הרקמה ריפוי מאופיין על-ידי שינוי השלמות. המבנית של העור והוא יכול להוביל להיווצרות של צלקת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: קינטיקה של כיבי. (א) תהליך כיבית כדלקמן מגמת עלייה במהלך הימים הראשונים לאחר ההדבקה. 72 h לאחר ההדבקה, 70-80% מהעכברים מראה אולקוס באתר של זיהום. 16 חיות פראי סוג C57BL/6 שימשו. (B) תמונות המחשה של כיבים שהתפתח 48 שעות לאחר ההדבקה. (ג) תמונות המחשה של היווצרות ציסטה לאחר ההדבקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן אנחנו תיאר שיטה של זיהום אלביקנס ג ללמוד תהליך דלקתי שמאותחלת הכניסה פטרייתי ב למחרת היום עמוק.

אף-על-פי להצטברות של העור הוא אירוע נדיר יחסית על זיהום אלביקנס ג 15, הזרקה של הפטרייה ישירות בלמחרת היום עמוק מאפשר לא רק חקר היווצרות מורסה מונחה-פטרייתי, אלא גם הניתוח של החיסון ספציפי תאים להשתתף להכיל פטרייתי להתפשט. עם השיטה המתוארת כאן, זה אפשרי ללמוד את האינטראקציה בין תאים חיסוניים, כמו גם הגיוס של תאים חיסוניים חשובים בהשתלטות על התפשטותה פטרייתי, תוך הימנעות איזושהי תגובה דלקתית לפצע או פגיעה מכנית צורה. אכן, האפשרות לשמור על המבנה אפיתל ללא פגע חשוב להימנע הפיתוח של סביבה דלקתית הנגרמת על ידי גירוי מכני, כגון שחיקה. בתור תיאוריה בפעם הראשונה על ידי פולי מצלם ב 199416, אותות נזק ניתן, למעשה, להפעיל תגובה חיסונית, כתוצאה מכך, מנע בעוצמה להשפיע על התגובה החיסונית שהפיק את הפתוגן.

נזקים הקשורים דפוסי מולקולרית (DAMPs) יכול לנבוע תאים מתים, אבל הם גם יכול להיות משוחרר בתנאים מתח. מאז אותות אלה יכולים להיווצר במצבים של נזק לרקמות, היווצרות פצע יגרום סביבה היפר-דלקתיות עוד לפני בהקשר של זיהום. השיטה שתיארנו מגביל את שחרורו של DAMPs, ובכך מפחית את הנוכחות של בלבול אלמנטים.

יתר על כן, ההזרקה של. חיידק ישירות בלמחרת היום עמוק היא מתודולוגיה יכול לשמש לא רק עבור זיהומים פטרייתיים, אלא גם לאתגרים חיידקי. אחראי על מספר גבוה של מקרים של שניהם עורית אחרת הפתוגן זיהומים למחזור הדם היא Staphylococcus aureus4. לאחרונה הראינו איך פרוטוקול זה היא גם כלי חשוב ללמוד S. aureus זיהום14. בפרט, S. aureus ידוע במרפאה בגלל יכולתו טופס מורסות במחוזות מספר של גוף ה-17. הזרקה של S. aureus ב למחרת היום עמוק שמוביל היווצרות אבצס, ובכך מאפשר במקביל חקר האירועים מאוד מוקדם מונע על ידי S. aureus מפגש כמו גם מעורבותם של תגובות חיסוניות להוביל לריפוי שלב.

לבסוף, תכונה חשובה נוספת של המתודולוגיה המתוארת כאן היא כי שמירה על מבנה תקין של אפיתל נותן את האפשרות לנתח בהיסטולוגיה הלוקליזציה של תאים חיסוניים והפעלה של מסלולים נפרדים, זה יכול להיות במרחב ממודר. בתנאים אלה ניסיוני, למעשה, מבנה אנטומי שונה של העור לא ישונה, תאים חיסוניים וגם מתווכים דלקתיים, ניתן לאבחן במיקום מדויק.

השימוש בשיטה זו ששומרת את התפוצה המרחבית של תאים חיסוניים ולכן אידיאלי כדי להבין טוב יותר את התפקידים של כל אחד מסוגי הסלולר במהלך זיהומים פטרייתיים, חיידקי עור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

FG נתמכת על ידי Associazione Italiana לכל החיפוש אחר לה סול Cancro (IG 2016Id.18842), קרן Cariplo (גרנט 2014-0655) דל'אנג'לו Regionale לכל la החיפוש אחר Biomedica (FRRB).
איז נתמך על-ידי NIH גרנט 1R01AI121066-01A1, 1R01DK115217, HDDC P30 DK034854 גרנט, הרווארד בית הספר לרפואה מילטון נמצאו פרסי מחקר בכיר CCFA (412708), אלינור, החוף Miles תכנית העמיתים יום הנישואין ה-50 שלהם, את (קרן Cariplo 2014-0859).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
PBS Euroclone ECB4053L warm in 37 °C bath before use
H-OCT compound histo-line laboratories R0030
Gill's Hematoxilyn histo-line laboratories 09-178-2
Eosin Y solution, alcoholic histo-line laboratories 09-209-05
Ethanol absolute scharlau ET00232500
Citro-HISTOCLEAR histo-line laboratories R0050
Eukitt, mounting medium bio-optica
Acetone sigma-aldrich 179124
PAS staining system sigma-aldrich 395B-1KT
Bacto Peptone BD 211677
Bacto Yeast Extract BD 212750
D(+)-Glucose anhydrous for molecular biology Applichem PanReac 50-99-7
Uridine Merck Millipore 8451
HEPES Applichem PanReac A1070,0500
Safe-Lock tubes 2 mL eppendorf 30121597
TRIzol Reagent Life Technologies 15596018 Toxic, corrosive and mutagen. Use all precaution needed
Rneasy Mini Kit QIAGEN 74104
liquid nitrogen Wear eye protection
Instrument
Coulter Counter-Particle Count Beckman Coulter
Centrifuge 5415 R eppendorf
MC 3000 Microtome Cryostat histo-line laboratories
TissueLiser QIAGEN
Materials
0.3 ml Insulin Syringe with a 30G x 8mm needle  BD 324826
Surgical forceps
Surgical scissors
Base mould disposable histo-line laboratories 2781
Positively charged bio microscope slides bio-optica 09-2000
Cover slips 24 x 50 mm thermo scientific 11911998

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Belkaid, Y., Segre, J. A. Dialogue between skin microbiota and immunity. Science. 346 (6212), 954-959 (2014).
  2. Kashem, S. W., Kaplan, D. H. Skin Immunity to Candida albicans. Trends Immunol. 37 (7), 440-450 (2016).
  3. Havlickova, B., Czaika, V. A., Friedrich, M. Epidemiological trends in skin mycoses worldwide. Mycoses. 51, 2-15 (2008).
  4. Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. P., Edmond, M. B. Nosocomial Bloodstream Infections in US Hospitals: Analysis of 24,179 Cases from a Prospective Nationwide Surveillance Study. Clin Infect Dis. 39 (3), 309-317 (2004).
  5. Romani, L. Immunity to fungal infections. Nat Rev Immunol. 4 (1), 11-24 (2004).
  6. Odds, F. C. Pathogenesis of Candida infections. J Am Acad Dermatol. 31 (3), S2-S5 (1994).
  7. MacCallum, D. M., Odds, F. C. Temporal events in the intravenous challenge model for experimental Candida albicans infections in female mice. Mycoses. 48 (3), 151-161 (2005).
  8. Dai, T., Kharkwal, G. B., Tanaka, M., Huang, Y. -Y., Bil de Arce, V. J., Hamblin, M. R. Animal models of external traumatic wound infections. Virulence. 2 (4), 296-315 (2018).
  9. Gaspari, A. A., Burns, R., Nasir, A., Ramirez, D., Barth, R. K., Haidaris, C. G. CD86 (B7-2), but not CD80 (B7-1), expression in the epidermis of transgenic mice enhances the immunogenicity of primary cutaneous Candida albicans infections. Infect Immun. 66 (9), 4440-4449 (1998).
  10. Koh, A. Y. Murine models of Candida gastrointestinal colonization and dissemination. Eukaryot Cell. 12 (11), 1416-1422 (2013).
  11. Mear, J. B., et al. Candida albicans Airway Exposure Primes the Lung Innate Immune Response against Pseudomonas aeruginosa Infection through Innate Lymphoid Cell Recruitment and Interleukin-22-Associated Mucosal Response. Infect Immun. 82 (1), 306-315 (2014).
  12. Leoni, G., Neumann, P. -A., Sumagin, R., Denning, T. L., Nusrat, A. Wound repair: role of immune-epithelial interactions. Mucosal Immunol. 8 (5), 959-968 (2015).
  13. Fonzi, W. A., Irwin, M. Y. Isogenic strain construction and gene mapping in Candida albicans. Genetics. 134 (3), 717-728 (1993).
  14. Santus, W., et al. Skin infections are eliminated by cooperation of the fibrinolytic and innate immune systems. Sci Immunol. 2 (15), (2017).
  15. Florescu, D. F., Brostrom, S. E., Dumitru, I., Kalil, A. C. Candida albicans Skin Abscess in a Heart Transplant Recipient. Infect Dis Clin Pract. 18 (4), 243-246 (2010).
  16. Pradeu, T., Cooper, E. L. The danger theory: 20 years later. Front Immunol. 3, 287 (2012).
  17. Cheng, A. G., DeDent, A. C., Schneewind, O., Missiakas, D. A play in four acts: Staphylococcus aureus abscess formation. Trends Microbiol. 19 (5), 225-232 (2011).

Tags

אימונולוגיה זיהום גיליון 136 עור קנדידה אלביקנס זיהום המערכת החיסונית אימונוהיסטוכימיה היסטולוגיה
עמוק עורי הזרקת כמו מודל של <em>קנדידה אלביקנס</em> דלקת עור עבור ניתוחים היסטולוגית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Santus, W., Mingozzi, F., Vai, M.,… More

Santus, W., Mingozzi, F., Vai, M., Granucci, F., Zanoni, I. Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses. J. Vis. Exp. (136), e57574, doi:10.3791/57574 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter