Summary
Qui descriviamo un protocollo che permette l'analisi istologica e molecolare dei campioni della pelle dopo iniezione intradermica di Candida albicans . Questo protocollo mantiene l'integrità strutturale della pelle e permette per la localizzazione di cellule del sistema immunitario del tessuto-residente o recentemente reclutate come pure la distribuzione di agente patogeno.
Abstract
La pelle è un organo estremamente esteso del corpo e, a causa di questa grande superficie, è continuamente esposto a microrganismi. Danni alla pelle possono portare facilmente a infezioni nel derma che può, a sua volta, provoca la diffusione di agenti patogeni nel sangue. Comprendere come il sistema immunitario combatte le infezioni allo stadio molto precoce e come l'host può eliminare gli agenti patogeni è un passo importante per impostare la base per futuri interventi terapeutici. Qui descriviamo un modello di infezione dei albicans del Candida che può visualizzare i processi che si verificano precocemente durante un'infezione, anche quando l'agente patogeno ha superato la barriera epiteliale, come pure la risposta immunitaria da albicans del c. invasione. Abbiamo usato questo modello di infezione per eseguire analisi istologiche che mostrano le cellule immunitarie che infiltrano la pelle così come la presenza e la localizzazione dell'agente patogeno. I campioni raccolti dopo l'infezione possa essere elaborato per l'estrazione di RNA.
Introduction
Il corpo umano è ricoperto da un numero estremamente elevato di microrganismi. La superficie della pelle è l'habitat di quasi 1 milione di batteri per centimetro quadrato1. Questo numero, tuttavia, non riflette la varietà di microrganismi che colonizza la pelle. Oltre ai batteri, il corpo umano è colonizzato da numerose specie fungine, tra cui c. albicans, che è in grado di sopravvivere sia presso le mucose e la pelle livello2.
Negli ultimi anni, la percentuale di persone con diagnosticata di infezioni fungine è enormemente aumentato. Ciò è dovuto principalmente al maggior numero di persone immunocompromised, cioè, pazienti HIV-positivi e pazienti che sono passati attraverso la chemioterapia o farmaci immunosoppressori dopo trapianto3. In uno studio di sorveglianza effettuato negli Stati Uniti, Wisplinghoff et al hanno mostrato che il 9,5% delle infezioni nosocomiali flusso sanguigno erano causati da Candida specie4. Dovuto il caso aumentato di infezioni fungine e soprattutto per l'elevata percentuale di specie di Candida trovate durante infezioni del torrente sanguigno, capire come questo agente patogeno sfugge al controllo del sistema immunitario è estremamente importante.
C. albicans è un fungo dimorphic che cresce in diverse forme morfologiche come lievito, blastospores, pseudoife ed ife a seconda le condizioni ambientali5. Nella sua forma ifale, albicans del c. dimostra la sua capacità di invasività più alto e ha la capacità di penetrare l' epitelio6.
Infezioni da c. albicans sono stati studiati utilizzando diversi approcci sperimentali. Il modello più comune di infezione è l'iniezione endovenosa di c. albicans lievito7. Tuttavia, questo modello non prendere in considerazione tutti i processi che accadono prima il fungo riesce a diffondersi nel flusso sanguigno. Un altro modello sfrutta la capacità dei albicans del c. di invadere l'epitelio. Questo metodo, noto anche come la carta vetrata modello8, è stato sviluppato da Gaspari, et al. , 1998,9e consiste nell'usare la carta vetrata per abradere la pelle, eliminando così lo strato corneo prima di applicare i albicans del c.. Questa procedura permette al fungo di penetrare l'epitelio, consentendo così l'analisi delle capacità invasiva di questo agente patogeno. Infine, altri modelli di infezioni per la gastrointestinale10 e respiratorie11 sono stati utilizzati in diversi studi.
La formazione di una ferita (come nel modello di carta vetrata) provoca l'attivazione di parecchie vie, compreso il reclutamento delle cellule immuni e attivazione, al fine di promuovere la guarigione di processo12. Questo può alterare o mascherare la risposta immunitaria in particolare contro l'agente patogeno, così conducendo alla confusione risultati.
Qui descriviamo un metodo di infezione della pelle che evita la formazione di ferita iniziale e l'induzione di un ambiente infiammatorio basale. Per mantenere la struttura epiteliale intatta, iniettiamo direttamente albicans del c. nella sua forma ifale nel derma profondo. Anche se una singola iniezione può suscitare lieve infiammazione, la quantità di infiammazione è limitata e limitata rispetto alla formazione di una ferita aperta come nel modello di carta vetrata. L'approccio che descriviamo qui permette lo studio della risposta immunitaria all'infezione fungina e diffusione, evitando l'ambiente infiammatoria eccessiva e preesistente causata da danni meccanici.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutte le procedure sono state approvate sotto l'istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC) e operate sotto la supervisione del dipartimento di risorse animali ai bambini dell'ospedale (arco) al Children Hospital di Boston o sono stati approvati dall'italiano Ministero della salute e realizzata sotto il Comitato istituzionale di Animal Care presso l'Università di Milano-Bicocca.
1. preparazione di albicans del c.
- Cultura C. albicans, ceppo CAF3-113, in provette contenenti medium ricco (lievito estratto peptone destrosio (YEPD), Estratto di lievito 1% (p/v), 2% (p/v) di Bacto Peptone, 2% (p/v) di glucosio) completate con uridina (50 mg/L) a 25 ° C. In queste condizioni, albicans del c. si sviluppa come un lievito.
Nota: Altri ceppi di c. albicans possono essere utilizzati, come la clinica isolare c. albicans SC5314 ceppo13. Dal momento che recentemente abbiamo dimostrato che il processo ulceroso è indotta dall'attivazione del sistema immunitario innato14, teoricamente ogni ceppo di c. albicans che mantiene le sue componenti della parete cellulare e la struttura, così come il capacità di produrre proiezioni ifale, potrebbe essere utilizzato. - Monitorare la cultura contando la concentrazione cellulare utilizzando un analizzatore di contatore delle cellule.
- Raccogliere la cultura quando raggiunge una concentrazione di circa 8 x 106 cellule/mL. In alternativa, è possibile utilizzare uno spettrofotometro per misurare il OD600.
Nota: Di solito, un valore di OD600 = 1 corrisponde ad una concentrazione di lievito di 3 x 107 cellule/mL, ma si raccomanda una titolazione. - Risospendere la cultura nel mezzo YEPD-uridina, utilizzando HEPES (50 mM, pH 7.5) come agente tampone e incubare la coltura a 37 ° C per indurre la formazione di ife. Verifica ifale formazione sotto un microscopio a 100 ingrandimenti. Formazione ifale è visibile 5 h dopo la coltura a 37 ° C; Tuttavia, utilizzare le celle 16 h dopo incubazione a 37 ° C quando la percentuale ifale raggiunge quasi il 95% della coltura totale.
- Per arricchire ulteriormente la preparazione in concentrazione ifale, centrifuga aliquote della cultura a 3.300 x g per 5 min. eliminare il supernatante e risospendere il pellet in PBS sterile ad una concentrazione di 1 x 108 IFE/mL.
2. cutanea profonda iniezione
- 24 h prima della procedura di infezione, anestetizzare i topi con un'iniezione intraperitoneale di ketamina (80-100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) e poi radere il fianco dei topi utilizzare un tagliacapelli elettrico.
Nota: Dopo qualsiasi procedura che coinvolge l'anestesia, posizionare i topi sotto una lampada di riscaldamento fino a quando non hanno recuperato in modo efficiente. - Riposare i topi per 24 h evitare qualsiasi infiammazione dovuto il processo di rasatura.
- 24 h dopo la procedura di rasatura, anestetizzare i topi con un'iniezione intraperitoneale di ketamina (80-100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg).
- Controllare il riflesso di zampa per garantire che i topi sono anestetizzati. Valutare il riflesso di zampa pinzando saldamente la zampa. Se l'anestesia è raggiunto, l'animale non sente dolore e non si muove.
- Iniettare albicans del c. IFE nel derma profondo utilizzando una siringa da insulina 0,3 mL con un ago di 30 x 8 mm in un volume finale di 50 µ l/iniezione, corrispondente a 5 x 106 IFE/iniezione.
- Tendere la pelle del fianco rasato utilizzando due dita al fine di iniettare il volume direttamente nel derma profondo. Inserire l'ago con un angolo di 10-15° con la smussatura dell'ago rivolto verso l'alto.
- Con questa angolazione, l'agente patogeno sarà iniettato con una profondità di circa 300-500 µm. Per garantire che l'iniezione è ben eseguita, verificare che la forma volume iniettato un bump che è assorbita qualche min dopo l'iniezione.
Nota: L'urto formata dopo l'iniezione sarà di circa 1 cm2. Questa è l'area che verrà rimosso al punto di tempo designato per l'analisi molecolare o istologica. - Per intervalli di tempo di meno di 24 h (consigliato) è possibile delimitare la zona di infezione con un pennarello, poiché l'urto formata con l'iniezione persiste per alcuni minuti, dopo di che viene assorbito. Per intervalli di tempo di 24 ore o più, questo passaggio non è necessario, perché o un'ulcera o una ciste sarà chiaramente visibile.
3. raccolta e preparazione per colorazione istologica del campione
- Eutanasia i topi secondo procedure istituzionali.
- Utilizzando pinze chirurgiche, tirare la pelle al confine del sito iniettato, precedentemente contrassegnato con il pennarello. Utilizzando le forbici chirurgiche, accise sul sito infetto dal taglio di pelle che segue la linea tracciata.
Nota: Fare attenzione a separare la pelle dal peritoneum usando le forbici punta rotonda. - Immergere la pelle in uno stampo di base USA e getta riempito con temperatura di taglio ottimale (OCT) composto, con il lato interno della pelle rivolto verso l'alto. Congelare il campione in azoto liquido fino a quando il composto diventa bianco. Non lasciate che l'azoto liquido coprire il campione prima di esso è completamente congelato come questo danneggerebbe il campione.
Nota: attenzione! Durante la fase 3.3, indossare una maschera facciale per la protezione da azoto liquido. - Se gli esempi non vengono utilizzati immediatamente per la preparazione del vetrino, memorizzarle rapidamente a-80 ° C.
Nota: Campioni possono essere conservati a-80 ° C a tempo indeterminato.
4. preparazione dei vetrini
- Tagliare il campione a metà per preparare le fettine per istologia a partire dal centro del campione.
- Tagliare fette spesse 5-µm con un criostato.
Nota: Per campioni di pelle, la temperatura del criostato deve non essere supera a-25 ° C. Un' più alta temperatura causerebbe una fusione parziale di H-personalizzazione e pertanto i campioni sarebbero non essere mantenuti nella giusta posizione durante la procedura di taglio. - Utilizzare vetrini caricati positivamente per raccogliere le fette.
- Se le fette raccolte non vengono utilizzate subito dopo la preparazione, li conservare a-20 ° C. A questo punto, fette possono essere memorizzati a-20 ° C a tempo indeterminato.
5. ematossilina ed eosina
- Macchia le diapositive mediante immersione in ematossilina di Gill per 4 min. lavare i vetrini in acqua corrente per 5 min.
- Macchia che le diapositive mediante immersione in soluzione di eosina Y per 1 min. lavare i vetrini in acqua corrente per 5 min, sciacquare le diapositive utilizzando acqua distillata prima di continuare il protocollo.
- Disidratare mediante immersione in aumento in serie delle concentrazioni delle soluzioni di etanolo (50%, 70%, 80%, 95%, 100%). Immergere i vetrini per 15 s in ogni soluzione di etanolo.
- Cancellare le diapositive per almeno 2 min per immersione in un agente di compensazione istologico.
- Montare le diapositive utilizzando il mezzo di montaggio e vetrini coprioggetto.
- Acquisire immagini delle diapositive con scanner per diapositive un microscopio a un ingrandimento 40x.
6. acido periodico di Schiff (PAS) colorazione
- Difficoltà le diapositive con ≥ 99.5% acetone a temperatura ambiente per 1 min. lavare i vetrini in acqua corrente per 1 min.
- Macchia le diapositive mediante immersione in soluzione di acido periodico (1 g/dL) per 5 min, lavare i vetrini in 3 cambi di acqua distillata.
- Macchia le diapositive per immersione nel reattivo di Schiff per 15 min. lavare i vetrini in acqua corrente per 5 min.
- Colorare i vetrini mediante immersione in ematossilina di Gill per 5 min. lavare i vetrini in acqua corrente per 30 s.
- Disidratare i vetrini mediante immersione in 3 cambi di etanolo al 100%. Immergere i vetrini per 15 s ogni volta.
- Cancellare le diapositive per almeno 2 min per immersione in un agente di compensazione istologico.
- Montare le diapositive utilizzando il mezzo di montaggio e vetrini coprioggetto.
- Acquisire immagini delle diapositive con scanner per diapositive un microscopio.
7. raccolta e preparazione per estrazione del RNA del campione
- Eutanasia i topi secondo procedure istituzionali. Rimuovere i campioni di pelle come descritto al punto 3.2.
- Immergere i campioni in una provetta da 2 mL-salvapercussore con 1 mL di reagente per l'estrazione del tiocianato-fenolo-cloroformio di guanidinium acido.
Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui e i campioni possono essere conservati a-80 ° C. - Tagliare il campione in pezzi di circa 0,2 cm2 utilizzando pinze chirurgiche.
Nota: attenzione! La maggior parte dei reagenti per isolamento del RNA sono tossiche e mutagene. Punti 7.3 e 7.4 deve essere fatto sotto una cappa aspirante. - Smash il campione con un laminatoio del branello ad una velocità di 20 oscillazioni/s per 20 min. in alternativa, un vasaio meccanico possa essere utilizzato.
- Controllare l'effettiva omogeneizzazione dei campioni cercando la presenza di parti intatte della pelle. Ripetere questo passaggio se i campioni non sono completamente omogeneizzati.
- Centrifugare i campioni a 16.000 x g per 1 min. tenere i surnatanti estrazione del RNA e scartare il pellet. Questo passaggio viene eseguito per eliminare peli e detriti che potrebbero bloccare le colonne di estrazione.
- Procedere con l'estrazione di RNA mediante RNA purificazione colonne14.
- Utilizzare uno spettrofotometro per valutare la concentrazione e purificazione di RNA. Se RNA estratti non vengono utilizzati immediatamente per la preparazione di cDNA, conservare i campioni a-80 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Attraverso l'iniezione dell'agente patogeno direttamente nel derma profondo, la morfologia strutturale del tessuto rimane intatto (Figura 1A).
Il mantenimento dell'integrità strutturale della pelle permette la rilevazione delle cellule immuni e loro localizzazione presso il sito di infezione. Il maggiore ingrandimento mostrato in Figura 1B rivela che l'ascesso si compone principalmente di leucociti polimorfonucleari (PMC) che contengono la diffusione dell'agente patogeno di suo confinamento al sito di infezione. Reclutamento di PMC, come i neutrofili, permette la formazione di ascesso, evitando così la diffusione del fungo entro il tessuto14. Ingrandimenti superiori (Figura 1, D) mostrano come le zone circostanti dell'ascesso sono anche ricchi di PMC.
Mantenendo l'integrità strutturale, la localizzazione dell'agente patogeno durante l'infezione può essere determinata. Sfruttando l'elevato contenuto di polisaccaridi nella parete delle cellule dei albicans del c., l'identificazione dell'agente patogeno è stato effettuato usando la macchiatura PAS, che dà un colore viola-magenta al fungo. Come mostrato nella Figura 2A, colorazione PAS dimostra chiaramente che l'agente patogeno è confinato all'interno dell'ascesso, formata dal reclutamento di granulociti14. Albicans del c. è chiaramente visibile presso il maggiore ingrandimento (Figura 2B), e sembra di essere circondato da cellule necrotiche ed immuni.
Utilizzando il metodo sopra descritto, il processo di infezione e l'infiammazione conseguente può essere seguite nel tempo. Dalla cella fin dall'inizio, immune assunzioni conduce alla formazione di un ascesso (Figura 1A e Figura 3A). Quando l'analisi del tessuto della pelle è stata prolungata fino a 48-72 h, la rottura delle strutture della pelle e la formazione di una cicatrice è stata visualizzata (Figura 3B, C). La formazione di questa struttura è dovuto la fase di guarigione che segue l'espulsione del patogeno14.
Il processo che porta alla formazione di un'ulcera può essere seguito per diversi giorni dopo l'infezione. Come mostrato in Figura 4A, topi wild-type C57BL/6 visualizzare un processo ulceroso che aumenta nel tempo. Circa 70-80% dei topi mostrano la formazione di un'ulcera 72h dopo l'infezione. A causa della variabilità sperimentale, almeno 8 topi devono essere utilizzati in ogni esperimento. Per l'analisi statistica, si consiglia di utilizzare un minimo di 8-10 topi per ciascun punteggio di ulcerazione se confrontando diversi genotipi o trattamenti. In questo caso, anche le piccole differenze dovrebbero essere visibili. Foto illustrative del processo ulceroso è mostrati in Figura 4B. Trattamenti specifici o le mancanze genetiche, la formazione dell'ulcera può essere ridotta e/o abrogata14. In alcuni casi, anziché l'ulcera, una ciste è formata, come illustrato nella Figura 4.
Diverso da ematossilina ed eosina e colorazione PAS, le diapositive possono essere macchiate per entrambi gli indicatori cellulari specifici o con altri stainings immunohistochemical per visualizzare meglio: fibre di collagene; citochine/chemochine posizione all'interno del tessuto; identità delle cellule immuni e distribuzione spaziale.
Oltre alla preparazione istologica, campioni possono essere utilizzati anche per le analisi molecolari. Il sito di iniezione intero possa essere asportato, per quanto riguarda i preparati istologici ed elaborato per l'estrazione di RNA. Estrazione di RNA dal tessuto permette lo studio e l'identificazione di questi geni sovraregolati durante l'infezione con l'agente patogeno. La possibilità di trattare i campioni per analisi molecolari è uno strumento importante, insieme con l'analisi istologica, al fine di meglio caratterizzare il tipo di risposta immunitaria contro l'agente patogeno e la sua regolazione durante le fasi precoci e tardive Dopo la sfida14.
Figura 1: manutenzione della localizzazione cellulare e morfologia pelle. (A) tutti i livelli vengono mantenuti. Epitelio, adipociti e cellule muscolari sono facilmente riconoscibili. (B) leucociti polimorfonucleari (evidenziati con le frecce) possono essere identificati all'interno dell'ascesso. (C, D) Ingrandimenti superiori mostrano la presenza di leucociti polimorfonucleari (frecce) nella zona circostante l'ascesso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Identificazione dei albicans del c. (A) c. albicans può essere rilevato all'interno del tessuto con colorazione PAS. (B) più alto ingrandimento per visualizzare meglio il fungo, macchiato in viola, confinati all'interno dell'ascesso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Follow-up del processo infiammatorio. (A) all'inizio del processo infiammatorio suscitato da c. albicans iniezione, granulociti sono reclutati al fine di formare un ascesso per confinare l'agente patogeno. (B, C) La formazione di un'ulcera è necessaria per l'espulsione del fungo. Il tessuto di guarigione è caratterizzato da un'alterazione dell'integrità strutturale della pelle e può portare alla formazione di una cicatrice. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: cinetica dell'ulcerazione. (A) il processo ulceroso segue una tendenza di aumento durante i primi giorni dopo l'infezione. 72 ore dopo l'infezione, 70-80% dei topi dimostra un'ulcera al luogo dell'infezione. 16 animali di tipo selvatico C57BL/6 sono stati usati. (B) foto Illustrative delle ulcere che sviluppato 48h dopo l'infezione. (C) foto Illustrative di formazione della ciste dopo l'infezione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Qui abbiamo descritto un metodo di c. albicans infezione per studiare il processo infiammatorio che è iniziato al fungina ingresso nel derma profondo.
Anche se la formazione di ascesso della pelle è un evento relativamente raro su c. albicans infezione15, iniezione del fungo direttamente nel derma profondo permette non solo lo studio della formazione di ascesso fungoso-driven, ma anche l'analisi di specifici immune cellule che partecipano per contenere la diffusione fungine. Con il metodo descritto qui, è possibile studiare l'interazione tra cellule del sistema immunitario, come pure il reclutamento delle cellule immunitarie che sono importanti per controllare la diffusione fungina, evitando qualsiasi risposta infiammatoria al danno meccanico o ferita formazione. Infatti, la possibilità di mantenere inalterata la struttura epiteliale è importante per evitare lo sviluppo di un ambiente infiammatorio causato da uno stimolo meccanico, come ad esempio un'abrasione. Come teorizzato per la prima volta da Polly Matzinger nel 199416, danno segnali possono, infatti, attivare una risposta immunitaria e, di conseguenza, potentemente influenzare la risposta immunitaria provocata dall'agente patogeno.
Modelli molecolari di danno connesso (Damp) possono avere origine da cellule morte, ma possono essere rilasciati anche in condizioni di stress. Poiché questi segnali possono essere prodotte in situazioni di danno tissutale, la formazione di una ferita causerebbe un ambiente iper-infiammatorie anche prima del contesto di un'infezione. Il metodo che abbiamo descritto limita il rilascio di DAMPs e così riduce la presenza di elementi di confusione.
Inoltre, l'iniezione di un agente patogeno direttamente nel derma profondo è una metodologia che può essere utilizzata non solo per le infezioni fungine, ma anche per le sfide batteriche. Un altro agente patogeno responsabile di un elevato numero di casi sia cutanee e infezioni del torrente sanguigno è stafilococco aureo4. Abbiamo recentemente dimostrato come questo protocollo è anche un importante strumento per lo studio di S. aureus infezione14. In particolare, lo Staphylococcus aureus è conosciuto nella clinica per la sua capacità di ascessi forma in diversi distretti del corpo17. Iniezione di S. aureus nel derma profondo conduce alla formazione di ascessi, permettendo così allo stesso tempo lo studio degli eventi molto presto guidato da S. aureus incontro così come il coinvolgimento delle risposte immunitarie che portano alla guarigione fase.
Infine, un'altra caratteristica importante della metodologia descritta qui è che il mantenimento di una struttura epiteliale intatta dà la possibilità di analizzare istologicamente la localizzazione delle cellule immuni e l'attivazione di vie distinte che possono essere nello spazio suddiviso in compartimenti. In queste condizioni sperimentali, infatti, le diverse strutture anatomiche della pelle non sono alterate e cellule del sistema immunitario e mediatori infiammatori possono essere visualizzati in una posizione precisa.
L'utilizzo di questo metodo che preserva la distribuzione spaziale delle cellule immuni è quindi ideale per comprendere meglio i ruoli di ogni tipo cellulare durante le infezioni fungine e batteriche della pelle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
FG è supportato da Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (IG 2016Id.18842), Fondazione Cariplo (Grant 2014-0655) e Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (FRRB).
IZ è supportato da NIH grant 1R01AI121066-01A1, 1R01DK115217, HDDC P30 DK034854 grant, Harvard Medical School Milton trovato, CCFA Senior Research Awards (412708), il Eleanor e il Miles Shore 50 ° anniversario Fellowship Program e la Fondazione Cariplo ( 2014-0859).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| PBS | Euroclone | ECB4053L | warm in 37 °C bath before use |
| H-OCT compound | histo-line laboratories | R0030 | |
| Gill's Hematoxilyn | histo-line laboratories | 09-178-2 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | histo-line laboratories | 09-209-05 | |
| Ethanol absolute | scharlau | ET00232500 | |
| Citro-HISTOCLEAR | histo-line laboratories | R0050 | |
| Eukitt, mounting medium | bio-optica | ||
| Acetone | sigma-aldrich | 179124 | |
| PAS staining system | sigma-aldrich | 395B-1KT | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | |
| D(+)-Glucose anhydrous for molecular biology | Applichem PanReac | 50-99-7 | |
| Uridine | Merck Millipore | 8451 | |
| HEPES | Applichem PanReac | A1070,0500 | |
| Safe-Lock tubes 2 mL | eppendorf | 30121597 | |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596018 | Toxic, corrosive and mutagen. Use all precaution needed |
| Rneasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| liquid nitrogen | Wear eye protection | ||
| Instrument | |||
| Coulter Counter-Particle Count | Beckman Coulter | ||
| Centrifuge 5415 R | eppendorf | ||
| MC 3000 Microtome Cryostat | histo-line laboratories | ||
| TissueLiser | QIAGEN | ||
| Materials | |||
| 0.3 ml Insulin Syringe with a 30G x 8mm needle | BD | 324826 | |
| Surgical forceps | |||
| Surgical scissors | |||
| Base mould disposable | histo-line laboratories | 2781 | |
| Positively charged bio microscope slides | bio-optica | 09-2000 | |
| Cover slips 24 x 50 mm | thermo scientific | 11911998 |
References
- Belkaid, Y., Segre, J. A. Dialogue between skin microbiota and immunity. Science. 346 (6212), 954-959 (2014).
- Kashem, S. W., Kaplan, D. H. Skin Immunity to Candida albicans. Trends Immunol. 37 (7), 440-450 (2016).
- Havlickova, B., Czaika, V. A., Friedrich, M.
- Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. P., Edmond, M. B. Nosocomial Bloodstream Infections in US Hospitals: Analysis of 24,179 Cases from a Prospective Nationwide Surveillance Study. Clin Infect Dis. 39 (3), 309-317 (2004).
- Romani, L. Immunity to fungal infections. Nat Rev Immunol. 4 (1), 11-24 (2004).
- Odds, F. C.
- MacCallum, D. M., Odds, F. C. Temporal events in the intravenous challenge model for experimental Candida albicans infections in female mice. Mycoses. 48 (3), 151-161 (2005).
- Dai, T., Kharkwal, G. B., Tanaka, M., Huang, Y. -Y., Bil de Arce, V. J., Hamblin, M. R. Animal models of external traumatic wound infections. Virulence. 2 (4), 296-315 (2018).
- Gaspari, A. A., Burns, R., Nasir, A., Ramirez, D., Barth, R. K., Haidaris, C. G. CD86 (B7-2), but not CD80 (B7-1), expression in the epidermis of transgenic mice enhances the immunogenicity of primary cutaneous Candida albicans infections. Infect Immun. 66 (9), 4440-4449 (1998).
- Koh, A. Y. Murine models of Candida gastrointestinal colonization and dissemination. Eukaryot Cell. 12 (11), 1416-1422 (2013).
- Mear, J. B., et al. Candida albicans Airway Exposure Primes the Lung Innate Immune Response against Pseudomonas aeruginosa Infection through Innate Lymphoid Cell Recruitment and Interleukin-22-Associated Mucosal Response. Infect Immun. 82 (1), 306-315 (2014).
- Leoni, G., Neumann, P. -A., Sumagin, R., Denning, T. L., Nusrat, A. Wound repair: role of immune-epithelial interactions. Mucosal Immunol. 8 (5), 959-968 (2015).
- Fonzi, W. A., Irwin, M. Y. Isogenic strain construction and gene mapping in Candida albicans. Genetics. 134 (3), 717-728 (1993).
- Santus, W., et al. Skin infections are eliminated by cooperation of the fibrinolytic and innate immune systems. Sci Immunol. 2 (15), (2017).
- Florescu, D. F., Brostrom, S. E., Dumitru, I., Kalil, A. C. Candida albicans Skin Abscess in a Heart Transplant Recipient. Infect Dis Clin Pract. 18 (4), 243-246 (2010).
- Pradeu, T., Cooper, E. L. The danger theory: 20 years later. Front Immunol. 3, 287 (2012).
- Cheng, A. G., DeDent, A. C., Schneewind, O., Missiakas, D. A play in four acts: Staphylococcus aureus abscess formation. Trends Microbiol. 19 (5), 225-232 (2011).
