Summary
Aqui descrevemos um protocolo que permite a análise histológica e molecular de amostras de pele após injeção intradérmica de Candida albicans . Esse protocolo mantém a integridade estrutural da pele e permite a localização do tecido-residente ou recém recrutadas células do sistema imunológico, bem como a distribuição do patógeno.
Abstract
A pele é um órgão extremamente estendido do corpo e, devido a esta grande superfície, é continuamente exposto a microorganismos. Danos de pele podem facilmente levar a infecções na derme, que por sua vez, pode, resultar na disseminação de patógenos para a corrente sanguínea. Compreender como o sistema imunológico combate infecções na fase inicial e como o host pode eliminar os patógenos, é um passo importante para definir a base para futuras intervenções terapêuticas. Aqui descrevemos um modelo de infecção por Candida albicans que pode visualizar os processos que ocorrem durante uma infecção, incluindo quando o patógeno já passou a barreira epitelial, bem como a resposta imune provocada pela de c. albicans invasão. Usamos este modelo de infecção para realizar análises histológicas que mostram as células imunitárias que se infiltrar a pele, bem como a presença e a localização do patógeno. As amostras coletadas após a infecção pode ser processada para extração de RNA.
Introduction
O corpo humano é coberto com um número extremamente elevado de microorganismos. A superfície da pele é o habitat de quase 1 milhão de bactérias por centímetro quadrado1. Este número, no entanto, não reflete a completa variedade de microorganismos que coloniza a pele. Além de bactérias, o corpo humano é colonizado por muitas espécies de fungos, incluindo c. albicans, que é capaz de sobreviver tanto as mucosas e a pele de nível2.
Nos últimos anos, a percentagem de pessoas diagnosticadas com infecções fúngicas aumentou enormemente. Isto é principalmente devido ao maior número de pessoas imunodeprimidas, ou seja, pacientes HIV-positivos e pacientes que passaram por quimioterapia ou drogas imunossupressoras após transplante3. Em um estudo de vigilância realizado nos Estados Unidos, Wisplinghoff et al mostrou que 9,5% das infecções nosocomiais corrente sanguínea foram causadas por espécies de Candida 4. Devido à maior ocorrência de infecções fúngicas e especialmente devido à elevada percentagem de Candida espécies encontradas durante infecções na corrente sanguínea, compreender como este patógeno escapa do controle do sistema imunológico é extremamente importante.
C. albicans é um fungo dimórfico que cresce em diferentes formas morfológicas tais como levedura, vermiforme, pseudo-hifas e hifas consoante as condições ambientais5. Na sua forma hifal, c. albicans mostra sua mais alta capacidade de invasividade e tem a capacidade de penetrar o epitélio6.
C. albicans infecções têm sido estudadas usando várias abordagens experimentais. O modelo mais comum de infecção é a injeção intravenosa de c. albicans levedura7. No entanto, este modelo não leva em consideração todos os processos que acontecer antes que o fungo consegue espalhar-se para a corrente sanguínea. Outro modelo aproveita a capacidade de c. albicans para invadir o epitélio. Este método, também conhecido como, o papel da areia modelo8, foi desenvolvido por Gaspari et al . em 1998,9e consiste no uso de papel da areia para friccionar a pele, eliminando assim o estrato córneo antes de aplicar a c. albicans. Este procedimento permite que o fungo penetrar o epitélio, possibilitando assim a análise das habilidades invasivas deste patógeno. Finalmente, outros modelos de infecções para o gastrointestinal10 e respiratórias11 têm sido utilizados em diferentes estudos.
A formação de uma ferida (como no modelo de papel da areia) provoca a ativação de várias vias, incluindo o recrutamento de células imunes e ativação, a fim de promover a cura do processo12. Isto pode alterar ou mascarar a resposta imune suscitou especificamente contra o patógeno, conduzindo assim a confundir os resultados.
Aqui nós descrevemos um método de infecção da pele que evita a formação de ferida inicial e a indução de um ambiente inflamatório basal. Para manter a estrutura epitelial intacta, injetamos diretamente c. albicans em sua forma hifas no derma profunda. Mesmo que uma única injeção pode provocar inflamação suave, a quantidade de inflamação é limitada e restrito em comparação com a formação de uma ferida aberta, como no modelo de papel da areia. A abordagem que descrevemos aqui permite o estudo da resposta imune à infecção fúngica e disseminação, evitando o ambiente inflamatório pré-existente e excessivo causado por danos mecânicos.
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Protocol
Todos os procedimentos foram aprovados sob o cuidado de Animal institucional e uso Comité (IACUC) e operados sob a supervisão do departamento de recursos animais às crianças do Hospital (ARCH) no Hospital infantil de Boston, ou foram aprovados pelo italiano Ministério da saúde e executada sob o Animal conta Comissão institucional da Universidade de Milano-Bicocca.
1. preparação de c. albicans
- Cultura C. albicans, estirpe CAF3-113, em tubos contendo meio rico (dextrose de peptona de extrato de levedura (YEPD), extrato de levedura 1% (p/v), 2% (p/v) de Bacto peptona, 2% (p/v) glicose) suplementado com uridina (50 mg/L) a 25 ° C. Nestas condições, c. albicans cresce como um fermento.
Nota: Outras cepas de c. albicans podem ser usadas, tais como o clínico isolar c. albicans estirpe SC531413. Desde que nós recentemente demonstramos que o processo ulcerosa é induzido pela ativação do sistema imune inato14, teoricamente cada cepa de c. albicans que mantém seus componentes da parede celular e a estrutura, bem como a capacidade de origem hifas projeções, poderia ser usado. - Monitore a cultura contando a concentração celular usando um analisador de contador de célula.
- Colha a cultura quando atinge uma concentração de cerca de 8 x 106 células/mL. Como alternativa, use um espectrofotômetro para medir o OD600.
Nota: Normalmente, um valor de OD600 = 1 corresponde a uma concentração de levedura de 3 x 107 células/mL, mas recomenda-se titulação. - Resuspenda a cultura em meio YEPD-uridina, usando o como agente tampão HEPES (50 mM, pH 7,5) e incubar a cultura a 37 ° C, para induzir a formação de hifas. Verifica a formação de hifas sob um microscópio com ampliação de 100 X. Formação das hifas é visível 5h após cultivo a 37 ° C; no entanto, use as células 16 h após incubação a 37 ° C, quando a porcentagem das hifas atinge quase 95% da cultura total.
- Para enriquecer ainda mais a preparação na concentração das hifas, alíquotas de centrífuga da cultura a 3.300 x g, durante 5 min. descartar o sobrenadante e resuspenda o pellet em PBS estéril na concentração de 1 x 108 hifas/mL.
2. fundo dérmica injeção
- 24 h antes o processo de infecção, anestesiar os ratos com uma injeção intraperitoneal de cetamina (80-100 mg/kg) e xilazina (10mg/kg) e em seguida raspar o flanco dos ratos usando uma tosquiadeira elétrica.
Nota: Após qualquer procedimento envolvendo anestesia, coloque os ratos sob uma lâmpada de aquecimento até que eles recuperaram eficientemente. - Descanse os ratos por 24 h evitar qualquer inflamação devido ao processo de barbear.
- 24 h após o procedimento de corte, anestesiar os ratos com uma injeção intraperitoneal de cetamina (80-100 mg/kg) e xilazina (10mg/kg).
- Verifica o reflexo de pata para garantir que os ratos são anestesiados profundamente. Avalie o reflexo da pata por beliscar-se firmemente a pata. Se a anestesia é alcançada, o animal não sente dor e não se move.
- Injete hifas de c. albicans no derma profunda utilizando uma seringa de insulina de 0,3 mL com agulha 30 x 8 mm em um volume final de 50 µ l/injeção, correspondente a 5 x 106 hifas/injeção.
- Puxe a pele do flanco raspada esticada usando dois dedos para injetar o volume diretamente no derma profunda. Introduza a agulha com um ângulo de 10-15° com o bisel da agulha voltado para cima.
- Com este ângulo, o patógeno será injetado com uma profundidade de aproximadamente 300-500 µm. Para garantir que a injeção é bem executada, verifique que o volume injetado forma um galo que é absorvido alguns min após a injeção.
Nota: O galo formada após a injeção será de aproximadamente 1 cm2. Esta é a área que será removida em ponto de tempo designado, para análise histológica ou molecular. - Para pontos de tempo de menos de 24 h (recomendado) marca a área da infecção com uma caneta, uma vez que a colisão que formou com a injeção persiste por alguns minutos, após o qual é absorvido. Para pontos de tempo de 24 h ou mais, esta etapa não é necessária, porque uma úlcera ou um cisto será claramente visível.
3. recolha e preparação para a coloração histológica da amostra
- Eutanásia nos ratos, de acordo com os procedimentos institucionais.
- Usando pinças cirúrgicas, puxe a pele na fronteira do local injetado, previamente marcada com a caneta marcador. Usando uma tesoura cirúrgica, impostos especiais de consumo do site infectado pelo corte da pele seguindo a linha marcada.
Nota: Tenha cuidado para separar a pele do peritônio usando uma tesoura de ponta redonda. - Mergulhe a pele em um molde base descartável cheio de temperatura de corte ideal (OCT) composta, com o lado interno da pele virada para cima. Congele a amostra em nitrogênio líquido até que o composto torna-se branco. Não deixe que o nitrogênio líquido cobrir a amostra antes de que é completamente congelado como isso iria danificar a amostra.
Nota: cuidado! Durante a etapa de 3.3, use um protetor facial para proteção de nitrogênio líquido. - Se as amostras não forem utilizadas imediatamente para a preparação de slide, armazená-los rapidamente a-80 ° C.
Nota: As amostras podem ser armazenadas a-80 ° C indefinidamente.
4. preparação de Slides
- Corte a amostra ao meio para preparar as fatias para histologia a partir do centro da amostra.
- Corte fatias grossas de 5 µm com um criostato.
Nota: Para amostras de pele, a temperatura do criostato não deve ser superior a-25 ° C. Uma temperatura mais alta poderia causar uma fusão parcial de H-OCT e, portanto, as amostras não serão mantidas na posição correcta durante o procedimento de corte. - Use corrediças do microscópio carregados positivamente para coletar as fatias.
- Se as fatias coletadas não forem utilizadas logo após o preparo, armazene-os em-20 ° C. Neste ponto, as fatias podem ser armazenadas a-20 ° C indefinidamente.
5. hematoxilina & eosina coloração
- Mancha os slides por imersão em hematoxilina de Gill para 4 min. lavar as lâminas em água corrente por 5 min.
- Mancha que os slides por imersão em solução de eosina Y para 1 min. lavagem as lâminas em água corrente por 5 min. enxágue os slides usando água destilada antes de continuar o protocolo.
- Desidrata-se por imersão em serialmente, aumentando as concentrações das soluções de etanol (50%, 70%, 80%, 95%, 100%). Mergulhe os slides por 15 s em cada solução de etanol.
- Limpe os slides pelo menos 2 min por imersão em um despachante histológica.
- Monte as lâminas usando o meio de montagem e lamínulas.
- Adquirir imagens dos slides com um scanner de slides do microscópio com uma ampliação de 40 X.
6. ácido periódico-Schiff (PAS) coloração
- Fixe as lâminas com 99.5% de acetona em temperatura ambiente por 1 min. lavar as lâminas em água corrente por 1 min.
- Mancha os slides por imersão em solução de ácido periódico (1 g/dL) por 5 min. Lave os slides em 3 mudanças de água destilada.
- Mancha os slides por imersão em do reagente de Schiff durante 15 min. lavar as lâminas em água corrente por 5 min.
- Mancha os slides por imersão em hematoxilina de Gill, por 5 min. Lave as lâminas em água corrente por 30 s.
- Desidrate os slides por imersão em 3 alterações de 100% de etanol. Mergulhe os slides por 15 s de cada vez.
- Limpe os slides pelo menos 2 min por imersão em um despachante histológica.
- Monte as lâminas usando o meio de montagem e lamínulas.
- Adquirir imagens dos slides com um scanner de slides do microscópio.
7. recolha e preparação para a extração do RNA da amostra
- Eutanásia nos ratos, de acordo com os procedimentos institucionais. Remova as amostras de pele, como no passo 3.2.
- Mergulhe as amostras em um tubo de snap-cap 2 mL com 1 mL do reagente para a extração de ácido guanidínio tiocianato-fenol-clorofórmio.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui e as amostras podem ser armazenadas a-80 ° C. - Corte a amostra em pedaços de aproximadamente 0,2 cm2 usando pinça cirúrgica.
Nota: cuidado! A maioria dos reagentes para isolamento de RNA são tóxicos e mutagênicos. Passos, 7.3 e 7.4 deve ser feito sob uma coifa. - Esmagar a amostra com uma fresa de grânulo a uma velocidade de 20 oscilações/s para 20 min. como alternativa, um oleiro mecânico pode ser usado.
- Verificar a homogeneização eficaz das amostras, procurando a presença de pedaços intactos da pele. Repita este passo se as amostras não são completamente homogeneizadas.
- Centrifugar as amostras a 16.000 x g por 1 min. Mantenha os sobrenadantes para extração do RNA e descartar a pelota. Esta etapa é realizada para eliminar o cabelo e detritos que possam obstruir as colunas de extração.
- Prosseguir com a extração do RNA usando o RNA purificação colunas14.
- Use um espectrofotômetro para avaliar a concentração e purificação de RNA. Se extratos de RNA não são usados imediatamente para a preparação do cDNA, armazenar as amostras a-80 ° C.
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Representative Results
Através da injecção de patógeno diretamente no derma profunda, a morfologia estrutural do tecido permanece intacta (figura 1A).
A manutenção da integridade estrutural da pele permite a detecção de células do sistema imunológico e sua localização no local da infecção. A maior ampliação mostrada na figura 1B revela que o abscesso é composto principalmente de leucócitos polimorfonucleares (PMCs) que contêm a disseminação do patógeno pelo seu confinamento para o local da infecção. Recrutamento de EPM, como neutrófilos, permite a formação do abscesso, evitando assim a propagação do fungo dentro do tecido14. Ampliações (Figura 1, D) mostram como as áreas circundantes do abscesso também são enriquecidas em EPM.
Mantendo a integridade estrutural, a localização do patógeno durante a infecção pode ser determinada. Aproveitando o elevado teor de polissacarídeos na parede celular de c. albicans, a identificação do patógeno foi realizada usando a coloração PAS, que dá uma cor púrpura-magenta para o fungo. Como mostrado na Figura 2A, coloração PAS mostra claramente que o patógeno é confinado dentro do abscesso, formado pelo recrutamento de granulócitos14. C. albicans é claramente visível na maior ampliação (Figura 2B), e parece estar rodeado por células imunes e necróticas.
Usando o método acima descrito, o processo de infecção e a consequente inflamação podem ser seguidos ao longo do tempo. No início, imune célula recrutamento leva à formação de um abcesso (figura 1A e Figura 3A). Quando a análise do tecido da pele foi prolongada até 48-72 h, a ruptura das estruturas da pele e a formação de uma cicatriz foi visualizada (Figura 3B, C). A formação dessa estrutura é devido a fase de cura que segue à expulsão do patógeno14.
O processo que leva à formação de uma úlcera pode ser seguido por vários dias após a infecção. Como indicado na Figura 4A, rato do selvagem-tipo C57BL/6 exibir um processo ulcerosa que aumenta ao longo do tempo. Cerca de 70-80% dos ratos mostram formação de uma úlcera de 72 h após a infecção. Devido à variabilidade experimental, pelo menos 8 ratos devem ser usados em todas as experiências. Para análise estatística, é aconselhável usar um mínimo de 8-10 ratos para cada Pontuação de ulceração se comparando diferentes genótipos ou tratamentos. Neste caso, mesmo pequenas diferenças devem ser visíveis. Fotos ilustrativas do processo ulcerosa são mostradas na Figura 4B. Sobre tratamentos específicos ou deficiências genéticas, a formação de úlcera pode ser reduzida e/ou revogada14. Em alguns casos, em vez da úlcera, um cisto é formado, como ilustrado na Figura 4.
Além de hematoxilina & eosina e coloração de PAS, os slides podem ser manchados ou marcadores celulares específicos ou com outras colorações imuno-histoquímica para visualizar melhor: fibras de colágeno; Localização de citocinas/quimiocinas dentro do tecido; e a identidade da célula imune e distribuição espacial.
Além de preparação histológica, amostras podem ser usadas também para análises moleculares. O local de injeção inteiro pode ser extirpado, quanto a preparações histológicas e processado para extração de RNA. Extração do RNA do tecido permite o estudo e a identificação desses genes upregulated durante a infecção com o patógeno. A possibilidade de processar as amostras para análises moleculares é uma ferramenta importante, juntamente com a análise histológica, a fim de melhor caracterizar o tipo de resposta imune suscitou contra o patógeno e sua regulação durante os estágios iniciais e finais após o desafio14.
Figura 1: manutenção da localização celular e morfologia pele. (A) todas as camadas são preservadas. Epitélio, adipócitos e células musculares são facilmente reconhecíveis. (B) de leucócitos polimorfonucleares (realçados com setas) podem ser identificados dentro do abscesso. (C, D) Ampliações mostram a presença de leucócitos polimorfonucleares (setas) na zona em redor do abscesso. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Identificação de c. albicans. (A) c. albicans pode ser detectado dentro do tecido com coloração PAS. (B) maior ampliação para visualizar melhor o fungo, corado em roxo, confinado dentro do abscesso. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: acompanhamento de processo inflamatório. (A) no início do processo inflamatório, provocado pela injeção de c. albicans , granulócitos são recrutados para formar um abscesso para confinar o patógeno. (B, C) A formação de uma úlcera é necessária para a expulsão do fungo. O tecido de cicatrização é caracterizado por uma alteração na integridade estrutural da pele e pode levar à formação de uma cicatriz. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: cinética da ulceração. (A), o processo ulcerativa segue uma tendência de aumento durante os primeiros dias após a infecção. 72 h após a infecção, 70-80% dos ratos mostra uma úlcera no local da infecção. 16 C57BL/6 tipo selvagem animais foram usados. (B) Fotos ilustrativas de úlceras que desenvolveu a 48 h após a infecção. (C) Fotos ilustrativas de formação do cisto após a infecção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui nós descrevemos um método de infecção de c. albicans para estudar o processo inflamatório que é iniciado após a entrada de fungosa no derma profunda.
Mesmo que a formação de abscesso da pele é um evento relativamente raro em cima de infecção de c. albicans 15, injeção do fungo diretamente no derma profunda permite não só o estudo da formação de abscesso orientada por fungos, mas também a análise de imune específica células que participam para conter a propagação de fungosa. Com o método descrito aqui, é possível estudar a interação entre as células imunes, bem como o recrutamento das células imunes que são importantes para controlar a propagação de fungosa, evitando qualquer resposta inflamatória ao dano mecânico ou ferida formação. Com efeito, a possibilidade de manter a estrutura epitelial intacta é importante para evitar o desenvolvimento de um ambiente inflamatório causado por um estímulo mecânico, como uma abrasão. Como teorizado pela primeira vez por Polly Matzinger em 199416, sinais de danos podem, na verdade, ativar uma resposta imune e, consequentemente, potente influenciam a resposta imunológica provocada pelo agente patogénico.
Dano associado padrões moleculares (represas) podem originar-se de células mortas, mas eles também podem ser liberados sob condições de estresse. Uma vez que estes sinais podem ser produzidos em situações de danos nos tecidos, a formação de uma ferida causaria um ambiente hiperinflamatório antes mesmo do contexto de uma infecção. O método descrevemos limita a liberação de represas e, portanto, reduz a presença de elementos de confusão.
Além disso, a injeção de um agente patogénico diretamente no derma profunda é uma metodologia que pode ser usada não só para infecções fúngicas, mas também para desafios bacterianos. Outro agente patogénico responsável por um elevado número de casos de ambos cutânea e infecções na corrente sanguínea é Staphylococcus aureus4. Recentemente mostramos como este protocolo é também uma importante ferramenta para o estudo de S. aureus infecção14. Em particular, S. aureus é conhecido na clínica por sua habilidade de forma abscessos em vários distritos do corpo17. Injeção de S. aureus no derma profunda leva à formação de abscessos, permitindo assim ao mesmo tempo o estudo dos eventos muito cedo conduzido por S. aureus encontro bem como o envolvimento das respostas imunes que levam para a cura fase.
Finalmente, outra característica importante da metodologia descrita aqui é que a manutenção de uma estrutura epitelial intacta dá a possibilidade de analisar histologicamente a localização das células do sistema imunológico e a ativação de caminhos distintos que podem ser espacialmente compartimentadas. Sob estas condições experimentais, de fato, as diferentes estruturas anatômicas da pele não sejam alteradas e tanto as células imunes e mediadores inflamatórios podem ser visualizados em um local preciso.
O uso desse método que preserva a distribuição espacial das células do sistema imunológico, portanto, é ideal para entender melhor as funções de cada tipo celular durante infecções fúngicas e bacterianas da pele.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
FG é suportado pela Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (IG 2016Id.18842), Fundação Cariplo (Grant 2014-0655) e Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (FRRB).
IZ é suportado pelo NIH grant 1R01AI121066-01A1, 1R01DK115217, HDDC P30 DK034854 grant, Harvard Medical escola Milton encontrou, CCFA Senior Research Awards (412708), a Eleanor e Miles Shore 50º aniversário Fellowship Program e a Fundação Cariplo ( 2014-0859).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| PBS | Euroclone | ECB4053L | warm in 37 °C bath before use |
| H-OCT compound | histo-line laboratories | R0030 | |
| Gill's Hematoxilyn | histo-line laboratories | 09-178-2 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | histo-line laboratories | 09-209-05 | |
| Ethanol absolute | scharlau | ET00232500 | |
| Citro-HISTOCLEAR | histo-line laboratories | R0050 | |
| Eukitt, mounting medium | bio-optica | ||
| Acetone | sigma-aldrich | 179124 | |
| PAS staining system | sigma-aldrich | 395B-1KT | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | |
| D(+)-Glucose anhydrous for molecular biology | Applichem PanReac | 50-99-7 | |
| Uridine | Merck Millipore | 8451 | |
| HEPES | Applichem PanReac | A1070,0500 | |
| Safe-Lock tubes 2 mL | eppendorf | 30121597 | |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596018 | Toxic, corrosive and mutagen. Use all precaution needed |
| Rneasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| liquid nitrogen | Wear eye protection | ||
| Instrument | |||
| Coulter Counter-Particle Count | Beckman Coulter | ||
| Centrifuge 5415 R | eppendorf | ||
| MC 3000 Microtome Cryostat | histo-line laboratories | ||
| TissueLiser | QIAGEN | ||
| Materials | |||
| 0.3 ml Insulin Syringe with a 30G x 8mm needle | BD | 324826 | |
| Surgical forceps | |||
| Surgical scissors | |||
| Base mould disposable | histo-line laboratories | 2781 | |
| Positively charged bio microscope slides | bio-optica | 09-2000 | |
| Cover slips 24 x 50 mm | thermo scientific | 11911998 |
References
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