Summary
여기는 Candida albicans 피부 주입 후 피부 샘플의 조직학 및 분자 분석을 허용 하는 프로토콜에 설명 합니다. 이 프로토콜 피부의 구조적 무결성을 유지 하 고 병원 체 분포 및 조직 상주 또는 새로 채용 면역 세포의 지역화에 대 한 수 있습니다.
Abstract
피부는 신체의 매우 확장 된 기관이 고,이 큰 표면 때문에 미생물을 지속적으로 노출 되. 피부 손상을 쉽게 혈 류로 병원 균의 보급에 차례 차례로 귀 착될 수 있다, 진 피에 감염 될 수 있습니다. 어떻게 면역 체계 싸움 감염 초기 단계와 어떻게 호스트 병원 체를 제거할 수 있습니다 이해 미래 치료 개입에 대 한 설정 하는 중요 한 단계입니다. 우리가 Candida albicans 감염 병원 체 면역 반응 elicited C. albicans에 의해로 서 상피 장벽을 통과 하는 때를 포함 하 여, 감염 동안 일찍 발생 하는 프로세스를 시각화 수 있는 모델을 설명 하는 여기 내 습. 우리는 피부 뿐 아니라 존재 및 병원 체의 지역화에 침투 하는 면역 세포를 표시 하는 조직학 분석을 수행 하기 위해이 감염 모델을 사용. 샘플 수집 후 감염 RNA 추출 처리 될 수 있습니다.
Introduction
인체는 미생물의 매우 높은 숫자를으로 덮여 있다. 피부 표면1평방 센티미터 당 거의 1 백만 박테리아의 서식 지입니다. 그러나,이 숫자 colonizes 피부 미생물의 전체 다양성을 반영 하지 않습니다. 박테리아, 뿐만 아니라 인간의 신체는 모두는 점 막과 피부 레벨2에서 살아남을 수 한 C. albicans를 포함 하 여 많은 곰 팡이 종에 의해 식민지 이다.
최근 몇 년 동안, 균 감염으로 진단 하는 사람의 비율이 엄청나게 증가 했다. 이것은 주로 immunocompromised 명, 즉, HIV 양성 환자와 환자 화학 요법 또는 면역 억제 약을 통해 이식3후 간 높은 수 있습니다. 미국에서 수행 하는 감시 연구, Wisplinghoff 그 외 여러분 병원내 혈 류 감염의 9.5 %Candida 종4에 의해 발생 했다 보여주었다. 증가 발생 곰 팡이 감염, 그리고 특히 칸디 다 종의 혈 류 감염 시 발견의 높은 비율 때문에, 때문에 매우은이 병원 체는 면역 시스템의 제어를 탈출 하는 어떻게 이해 중요 한.
C. albicans 동종이 형 균 류 효 모, blastospores, pseudohyphae,5환경 조건 따라 균 등 다른 형태학 형태로 성장 하는. Hyphal 형태의 C. albicans 높은 침해 용량을 보여줍니다 하 고 상피6을 관통 하는 기능이 있다.
C. albicans 감염 여러 가지 실험 방법을 사용 하 여 연구 되었습니다. 감염의 가장 일반적인 모델은 C. albicans 효 모7의 정 맥 주입. 그러나,이 모델 받지 않는다 고려 사항으로 모든 프로세스는 일이 혈 류로 확산 하는 곰 팡이 관리 하기 전에. 또 다른 모델은 상피를 침입 하는 C. albicans 의 기능을 활용 합니다. 이 방법, 일컬어 모래 종이 모델8, Gaspari 외. 19989에 의해 개발 되었다 그리고 C. albicans를 적용 하기 전에 따라서 지층 corneum 를 제거 피부를 침식을 모래 종이 사용 하 여 구성 됩니다. 이 절차에 따라서이 병원 체의 침입 능력의 분석을 사용 하는 상피 세포를 침투 하는 곰 팡이 수 있습니다. 마지막으로, 위장10 및 호흡기 책자11 를 위한 감염의 다른 모델 다른 연구에 사용 되었습니다.
(모래 종이 모델)로 상처의 형성 등 면역 세포 모집 활성화,12치유 과정 촉진 하기 위하여 여러 경로의 활성화를 하면 됩니다. 이 중 하나 변경 하거나 결과 혼동 하는 병원 체에 대해 특별히 elicited 면역 응답 마스크 수 있습니다.
여기 피부 감염을 초기 상처 형성을 방지 하는 방법 및 기저 선 동적인 환경 유도 설명 합니다. 그대로 상피 구조를 유지 하려면 우리는 직접 깊은 derma에 hyphal 형태로 C. albicans 주사. 염증의 금액 제한 및 제한 단일 주입 가벼운 염증 유도 수 있습니다, 비록 모래 종이 모델에서 열린 상처의 형성에 비해. 우리가 여기에 설명 하는 방법 곰 팡이 감염을 피하 면 서 기계적 손상으로 인 한 과도 하 고 기존의 염증 성 환경 확산 면역 반응의 연구를 수 있습니다.
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Protocol
모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에서 승인 되었고 어린이 동물 자원의 부의 감독 아래 운영 병원 (아치) 보스턴 아동 병원에서 또는 이탈리아에 의해 승인 되었다 보건 기관 동물 관리 위원회 밀라노-Bicocca의 대학에서 수행 하는 고.
1. C. albicans 준비
- 문화 C. albicans, 스트레인 CAF3-113, 25 ° c.에 uridine (50 mg/L) 보충 풍부한 매체 (효 모 추출 물 펩 포도 당 (YEPD), 1% (w/v) 효 모 추출 물, Bacto 펩, 포도 당 2% (w/v)의 2% (w/v))를 포함 하는 튜브에 이러한 조건에서 C. albicans 는 효 모로 자 랍니다.
참고: 다른 C. albicans 변종 사용할 수 있습니다, 같은 임상 분리 C. albicans 스트레인 SC531413. 이후 우리는 최근 궤 양성 과정은 타고 난 면역 계통14, 이론적으로 세포 벽 구성 요소와 구조를 유지 하는 모든 C. albicans 스트레인의 활성화에 의해 유도 된 증명 하고있다 뿐만 아니라 hyphal 계획을 시작 하는 기능을 사용할 수 있습니다. - 셀 카운터 분석기를 사용 하 여 세포 농도 계산 하 여 문화를 모니터링 합니다.
- 약 8 x 106 셀/mL의 농도 도달 하면 문화를 수확. 또는, OD600을 측정 하는 분 광 광도 계를 사용 합니다.
참고: 일반적으로, OD600 의 값 = 1 ml/3 x 107 세포, 효 모 농도에 해당 하지만 적정 권장. - HEPES (50 m m, pH 7.5)를 사용 하 여 버퍼 에이전트로 YEPD uridine 매체에 문화를 resuspend 하 고 균의 형성을 유발 하는 37 ° C에서 문화를 품 어. 100 배 확대에 현미경 hyphal 형성을 확인 하십시오. 37 ° C에서 배양 후 hyphal 형성은 보이는 5 h 그러나, 사용 하 여 셀을 16 h 37 ° C에 외피 후 hyphal 비율 총 문화의 거의 95%에 도달 하면.
- 더 풍요롭게 hyphal 농도에서 준비, 5 분을 위한 3300 x g에서 문화 원심 분리기 aliquots 삭제는 상쾌한 고을 1 x 108 균/mL의 농도에서 살 균 PBS에 펠 릿을 resuspend.
2. 깊은 피부 주입
- 24 시간 사전 감염 절차 케 타 민 (80-100 mg/kg) 및 xylazine (10 mg/kg)의 복 주사와 쥐를 anesthetize 하 고 전기 클리퍼를 사용 하 여 마우스의 측면을 면도.
참고: 후 마 취를 포함 하는 모든 프로시저를 놓습니다 난방 램프 아래 쥐 그들은 효율적으로 복구 될 때까지. - 24 h 쉐이 빙 과정 어떤 염증 방지를 위한 마우스를 놓습니다.
- 면도 수술 후 24 h anesthetize 케 타 민 (80-100 mg/kg) 및 xylazine (10 mg/kg)의 복 주사와 쥐.
- 쥐 취 깊이 되도록 발 반사를 확인 하십시오. 단단히 발을 곤란 하 게 하 여 발 반사를 평가 합니다. 마 취를 달성 하는 경우 동물 통증을 느끼지 않습니다 하 고 이동 하지 않습니다.
- C. albicans 균 50 µ L/주입, 해당 5 x 106 균/주입 하의 마지막 볼륨에 30 G x 8 m m 바늘으로 0.3 mL 인슐린 주사기를 사용 하 여 깊은 더 마에 주사.
- 면도 측면의 피부를 당겨 긴장 된 손가락 두 개를 사용 하 여 깊은 더 마에서 직접 볼륨을 주입 합니다. 향하도록 하는 바늘의 경사와 10-15 °의 각도와 바늘을 삽입 합니다.
- 이 각도와 약 300-500 µ m의 깊이와 병원 체를 주입 됩니다. 주사는 잘 수행 되도록 확인 주입 된 볼륨은 범프 형성 흡수 몇 분 주사 후.
참고: 범프 형성 후 주사 약 1 c m2의 있을 것입니다. 이것은 분자 또는 조직학 분석을 위해 지정 된 시간 지점에서 제거 될 것 이다 지역입니다. - 범프는 사출 형성 후 흡수, 몇 분 동안 지속 되 고 있기 때문에, 시간 점이 24 시간 보다는 더 적은 (권장)의 마커 펜으로 감염의 영역을 표시 합니다. 24 시간 이상의 시간 포인트, 위 궤 양 또는 낭종은 명확 하 게 볼 수 있기 때문에이 단계, 필요 하지 않습니다.
3. 샘플 수집 및 조직학 얼룩을 위한 준비
- 제도적 절차에 따라 마우스를 안락사
- 수술 용 집게를 사용 하 여 이전 마커 펜으로 표시 된 삽입 된 사이트의 테두리에서 피부를 당겨. 수술가 위를 사용 하 여 표시 된 라인을 따라 피부를 절단 하 여 감염 된 사이트를 삭제할.
참고: 라운드 팁이 위를 사용 하 여 복 막에서 피부를 분리 하는 주의 해야 합니다. - 일회용 기본 몰드 향하도록 피부의 내부 측면으로 최적의 절삭 온도 (10 월) 화합물, 가득한 피부에 젖어. 화합물 흰색 될 때까지 액체 질소에 샘플을 동결. 이 샘플을 손상 것으로 완전히 고정 하기 전에 샘플을 커버 하는 액체 질소 하 게 하지 마십시오 .
참고: 주의! 3.3 단계 동안 액체 질소에서 보호를 위해 얼굴 방패를 착용. - 샘플 슬라이드 준비를 위해 즉시 사용 하지 않는 경우 빠르게-80 ° c.에 저장
참고: 샘플을 저장할 수 있습니다-80 ° C에 무기한.
4입니다. 슬라이드의 준비
- 샘플 샘플의 센터에서 출발 하는 조직학에 대 한 슬라이스를 준비 하는 반으로 잘라.
- 잘라 5 µ m는 cryostat와 두꺼운 조각.
참고: 피부 샘플는 cryostat의 온도 하지 보다 클 수-25 ° c. 더 높은 온도 H-10 월의 부분적인 녹는 원인과 따라서 샘플 것 유지 되지 않을 올바른 위치에 절단 절차 동안. - 충전 된 현미경 슬라이드를 사용 하 여 슬라이스를 수집.
- 준비 후 곧 수집 된 분할 영역을 사용 하지 않는 경우-20 ° c.에서 그들을 저장합니다 이 시점에서, 조각은 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 무기한.
5. 되며 & 오신 얼룩
- 5 분 동안 수돗물을 실행에 슬라이드 4 분 세척에 대 한 길의 hematoxylin에 침수에 의해 슬라이드를 얼룩.
- 1 분에 오신 Y 솔루션에 집중 하 여 슬라이드 실행 5 분 린스에 대 한 수돗물 사용 하 여 슬라이드에 슬라이드 세척 얼룩 프로토콜을 계속 하기 전에 증류수.
- 순차적으로 에탄올 솔루션 (50%, 70%, 80%, 95%, 100%)의 농도 증가에 침수에 의해 탈수. 15에 대 한 슬라이드를 담가 각 에탄올 솔루션에서 s.
- 조직학 개간 에이전트에 침수에 의해 적어도 2 분 동안 슬라이드를 선택을 취소 합니다.
- 장착 매체와 커버 전표를 사용 하 여 슬라이드를 탑재 합니다.
- 40 X 확대 현미경 슬라이드 스캐너와 슬라이드의 이미지를 취득 합니다.
6. 정기 산 Schiff (PA) 얼룩
- 1 분 동안 수돗물을 실행에 슬라이드 1 분 세척에 대 한 실 온에서 ≥99.5% 아세톤과 슬라이드를 수정 합니다.
- 얼룩 슬라이드 주기 산 솔루션 (1 g/dL)에 침수에 의해 5 분 세척에 대 한 증류수 3 변경에서 슬라이드.
- 5 분 동안 수돗물을 실행에 슬라이드에 Schiff의 시 약 15 분 세척에 대 한 침수로 슬라이드를 얼룩.
- 5 분 씻어 30 수돗물 실행에 슬라이드에 슬라이드 길의 hematoxylin에 침수에 의해 얼룩 s.
- 100% 에탄올의 3 변화에 집중 하 여 슬라이드를 탈수. 15에 대 한 슬라이드를 담가 s 각 시간.
- 조직학 개간 에이전트에 침수에 의해 적어도 2 분 동안 슬라이드를 선택을 취소 합니다.
- 장착 매체와 커버 전표를 사용 하 여 슬라이드를 탑재 합니다.
- 현미경 슬라이드 스캐너와 슬라이드의 이미지를 취득 합니다.
7. 샘플 수집 및 RNA 추출에 대 한 준비
- 제도적 절차에 따라 마우스를 안락사 3.2 단계에서 피부 샘플을 제거 합니다.
- 산 guanidinium 안산 클로 페 놀 프롬-추출 시 약의 1 mL 2 mL 스냅 캡 튜브에 샘플을 담가.
참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기 하 고 샘플-80 ° c.에 저장 될 수 있다 - 약 0.2 c m2 외과 집게를 사용 하 여 조각으로 샘플을 잘라.
참고: 주의! RNA 분리 시 약의 대부분은 독성 및 돌연변이. 증기 두건에서 수행 되어야 7.3 및 7.4 단계 해야 합니다 . - 또는 20 분에 대 한 20 진동/s의 속도로 비드 밀와 함께 샘플을 부 술, 기계적 포터를 사용할 수 있습니다.
- 샘플의 효과적인 균질 피부 그대로의 존재를 찾아 확인 합니다. 샘플은 완전 하 게 균질 하지 경우이 단계를 반복 합니다.
- 원심에서 16000 x g 1 분 유지에 대 한 샘플 RNA 추출 supernatants 고 펠 릿을 삭제. 이 단계는 머리와 추출 열을 차단할 수 있는 파편을 제거 하기 위해 수행 됩니다.
- RNA 추출 RNA 정화 열14를 사용 하 여 계속 합니다.
- 분 광 광도 계를 사용 하 여 RNA 정화 및 농도 평가. RNA 추출 cDNA 준비를 위해 즉시 사용 하지 않는 경우-80 ° c.에 샘플 저장
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Representative Results
깊은 더 마에서 직접 병원 체의 주사를 통해 조직 구조 형태는 그대로 (그림 1A)를 남아 있습니다.
피부 구조 무결성의 유지 관리는 면역 세포의 탐지 및 감염의 사이트에 그들의 지 방화를 허용 한다. 그림 1B 에서 표시 하는 높은 배율이 보여준다 농 양 감염의 사이트에 그것의 감 금으로 병원 체의 확산을 포함 하는 polymorphonuclear 백혈구 (PMCs)의 주로 구성 되어있다. PMCs, 호 중구, 등 모집 조직14내 곰 팡이의 확산 따라서 피하 농 양 형성을 허용 한다. 높은 배율 (그림 1 c, D) 농 양의 주변 지역 또한 PMCs에 농축 방법을 보여줍니다.
구조적 무결성을 유지 하 여 감염 동안 병원 체의 지역화를 확인할 수 있습니다. C. albicans, 병원 체의 식별의 세포 벽 다 당 류의 높은 콘텐츠의 활용 수행 되었다 우선권 얼룩, 사용 하는 곰 팡이 게 보라색-마젠타 색상. 그림 2A같이 우선권 얼룩이 명확 하 게 병원 체 granulocytes14의 채용에 의해 형성 된 농 양 안에 국한 됩니다 보여 줍니다. C. albicans (그림 2B), 더 높은 확대에 명확 하 게 표시 되 고 괴 사 성 및 면역 세포에 의해 포위 될 것.
위에서 설명한 방법을 사용 하 여, 시간이 지남에 따른 염증과 감염 과정을 다음 수 있습니다. 매우 시작, 면역 세포에서 모집 (그림 1A 및 그림 3A)는 농 양 형성으로 이어집니다. 피부 조직의 분석까지 연장 했다 때 48-72 h, 피부 구조의 파괴, 흉터의 형성을 가시화 했다 (그림 3B, C). 이 구조 형성은 병원 체14의 퇴 학에 나오는 치유 단계 때문입니다.
궤 양 형성에 이르게 하는 프로세스는 감염 후 몇 일 동안 다음 수 있습니다. 그림 4A같이 야생-타입 마우스 C57BL/6 시간이 지남에 따라 증가 하는 궤 양성 프로세스를 표시 합니다. 약 70-80%는 쥐의 감염 후 궤 양이 72 h의 형성 표시. 실험적인 다양성으로 인해 적어도 8 쥐 모든 실험에 사용 되어야 한다. 통계 분석을 위해 다른 genotypes 또는 치료를 비교 하는 경우 각 궤 점수에 대 한 8-10 쥐의 최소 사용 하는 것이 좋습니다. 이 경우에 작은 차이 표시 되어야 합니다. 궤 양성 과정의 설명을 그림 그림 4B에 표시 됩니다. 특정 치료 또는 유전자 결함, 궤 양 형성 감소 될 수 있다/또는14폐지. 경우에 따라 궤 양, 대신 낭종 형성 된다, 그림 4C에서 볼 수 있듯이.
되며 & 오신 및 우선권 얼룩, 슬라이드 얼룩이 질 수 있다 어느 특정 세포 마커 또는 다른 immunohistochemical stainings 더 나은 시각화와: 콜라겐 섬유; cytokine/발산 위치 조직; 면역 세포 정체성 그리고 공간 배급입니다.
조직학 준비 뿐만 아니라 샘플 분자 분석에 대 한 또한 사용할 수 있습니다. 전체 주입 사이트 excised 조직학 준비에 관해서는 하 고 RNA 추출에 대 한 처리 수 있습니다. 조직에서 RNA 추출 연구 및 병원 체와 감염 하는 동안 그 유전자 upregulated의 식별 수 있습니다. 분자 분석에 대 한 샘플을 처리 하는 데 가능성은 조직학 분석을 하기 위해서는 더 나은는 중요 한 도구를 특성화 elicited 병원 체와 초기와 후반 단계 동안에 그것의 규칙에 대 한 면역 반응의 종류 후에 도전14.
그림 1: 피부 형태학 및 세포질 지 방화의 유지 보수. (A) 모든 레이어가 유지 됩니다. 상피, adipocytes, 및 근육 세포를 쉽게 인식할 수 있습니다. (화살표가 강조) (B) Polymorphonuclear 백혈구 농 양 내에서 확인할 수 있습니다. (C, D) 높은 배율 농 양 주변 지역에서 polymorphonuclear 백혈구 (화살표)의 존재를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
C. albicans의 그림 2: 식별. (A) C. albicans 파스 얼룩과 조직 내에서 검출 될 수 있다. 더 나은 자주색, 얼룩 곰 팡이 시각화 (B) 높은 확대 농 양 안에 국한. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 염증 과정의 후속. (A) C. albicans 주입 하 여 elicited 염증 과정의 처음에서 granulocytes 병원 체를 제한 하려면 농 양을 형성 하기 위하여 모집. (B, C) 궤 양이 형성은 곰 팡이의 퇴 학에 대 한 필요 합니다. 치유 조직 그리고 피부 구조 무결성에 변경 특징은 흉터의 형성으로 이어질 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 궤의 활동. (A) 궤 양성 과정 감염 후 첫 번째 일 동안 증가의 추세는 다음과 같습니다. 감염 후 72 h, 쥐의 70-80%는 감염의 사이트에 궤 양이 보여 줍니다. 16 C57BL/6 야생 타입 동물 사용 되었다. (B) 궤 양 감염 후 48 h 개발의 설명 사진. (C) 감염 후 낭종 형성의 설명 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기 우리는 C. albicans 감염 깊은 더 마에 곰 팡이 입구를 따라 시작 된 염증 과정을 공부 하는 방법을 설명 합니다.
피부 농 양 형성 C. albicans 감염15시 상대적으로 드문 경우 이지만, 직접 깊은 더 마에에서 곰 팡이의 주입 수 선 구동 농 양 형성의 연구 뿐만 아니라 특정 면역의 분석 곰 팡이 확산을 포함에 참여 하는 셀입니다. 여기에 설명 된 방법으로 그것은 기계적 손상이 나 상처에 어떤 선 동적인 응답을 피하 면 서 곰 팡이 확산을 제어 하는 중요 한 면역 세포의 채용 뿐 아니라 면역 세포, 사이 상호 작용을 공부 하 형성입니다. 실제로, 상피 구조를 그대로 유지 가능성은 마모와 같은 기계적 자극에 의해 발생 하는 염증 성 환경 개발을 피하기 위해 중요 하다. 199416폴 리 Matzinger에 의해 처음으로 이론로 손상 신호 수 있습니다, 그리고 사실, 면역 반응을 활성화 하 고, 따라서 potently elicited 병원 체에 의해 면역 반응에 영향을 미칠.
피해 관련 된 분자 패턴 (DAMPs) 죽은 세포에서 발생 한 수 있습니다 하지만 그들은 또한 스트레스 조건 하에서 발표 하실 수 있습니다. 조직 손상의 상황에서 이러한 신호를 생성할 수 있다, 이후 상처의 감염의 맥락도 전에 선 동적인 하이퍼 환경을 발생할 것 이다. 우리가 설명 하는 방법을 DAMPs의 릴리스를 제한 하 고 따라서 요소를 혼동의 존재를 감소 시킨다.
또한, 깊은 더 마에서 직접 병원 체의 주입은 곰 팡이 감염에 대 한 뿐만 아니라 세균도 전에 대 한 사용할 수 있는 방법입니다. 또 다른 병원 체의 피부 모두의 경우 높은 번호에 대 한 책임 그리고 혈 류 감염 포도 상 구 균4. 우리는 최근에 어떻게이 프로토콜은 또한 S. 구 균 감염14를 공부 하는 중요 한 도구입니다 나타났습니다. 특히, S. 구 균 신체17의 여러 지역 농 양 형성 하는 기능에 대 한 클리닉에서 알려져 있다. S. 구 균 주사 깊은 더 마에 농 양, S. 구 균 에 의해 구동 하는 매우 초기 이벤트의 연구는 치유 하는 면역 반응의 참여 뿐만 아니라 발생 하는 동시에 활성화의 형성에 이르게 단계입니다.
마지막으로, 여기에 설명 된 방법론의 또 다른 중요 한 특징은 상피 구조는 유지 면역 세포의 지역화 될 수 있는 다른 통로의 활성화에 조직학 분석을 가능성을 제공 합니다. 공간 들 에게만. 이러한 실험 조건 하에서 사실, 피부의 다른 해 부 구조는 변경 되지 않습니다 하 고 면역 세포와 염증 성 중재자는 정확한 위치에 구상 될 수 있다.
면역 세포의 공간 배급을 유지 하는이 메서드를 사용 하 여 따라서 곰 팡이 및 세균성 피부 감염 시 각 세포 유형의 역할 이해 하기 이상적입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
FG 라 검색 술 Cancro (IG 2016Id.18842) 당 예술 슈퍼컵, Cariplo 재단 (그랜트 2014-0655), 그리고 피코 가정과 라 검색 Biomedica (FRRB) 당에 의해 지원 됩니다.
어제는 NIH 그랜트 1R01AI121066-01A1, 1R01DK115217, HDDC P30 DK034854 그랜트, 하버드 의료 학교 밀 튼 발견 CCFA 수석 연구 상 (412708), 엘 레 노어, 마일 해안 지원 50 주년 친목 프로그램, 및 Cariplo 재단 ( 2014-0859).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| PBS | Euroclone | ECB4053L | warm in 37 °C bath before use |
| H-OCT compound | histo-line laboratories | R0030 | |
| Gill's Hematoxilyn | histo-line laboratories | 09-178-2 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | histo-line laboratories | 09-209-05 | |
| Ethanol absolute | scharlau | ET00232500 | |
| Citro-HISTOCLEAR | histo-line laboratories | R0050 | |
| Eukitt, mounting medium | bio-optica | ||
| Acetone | sigma-aldrich | 179124 | |
| PAS staining system | sigma-aldrich | 395B-1KT | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | |
| D(+)-Glucose anhydrous for molecular biology | Applichem PanReac | 50-99-7 | |
| Uridine | Merck Millipore | 8451 | |
| HEPES | Applichem PanReac | A1070,0500 | |
| Safe-Lock tubes 2 mL | eppendorf | 30121597 | |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596018 | Toxic, corrosive and mutagen. Use all precaution needed |
| Rneasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| liquid nitrogen | Wear eye protection | ||
| Instrument | |||
| Coulter Counter-Particle Count | Beckman Coulter | ||
| Centrifuge 5415 R | eppendorf | ||
| MC 3000 Microtome Cryostat | histo-line laboratories | ||
| TissueLiser | QIAGEN | ||
| Materials | |||
| 0.3 ml Insulin Syringe with a 30G x 8mm needle | BD | 324826 | |
| Surgical forceps | |||
| Surgical scissors | |||
| Base mould disposable | histo-line laboratories | 2781 | |
| Positively charged bio microscope slides | bio-optica | 09-2000 | |
| Cover slips 24 x 50 mm | thermo scientific | 11911998 |
References
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