Summary
Qui, presentiamo un protocollo per testare la virulenza della pianta con la pianta patogeno Magnaporthe grisea. Questa relazione contribuirà alla proiezione su grande scala di patotipi di funghi isolati e servire come un ottimo punto di partenza per la comprensione dei meccanismi resistenti delle piante durante l'allevamento molecolare.
Abstract
Piante possiedono un potente sistema per difendersi contro le minacce potenziali dei funghi patogeni. Per piante sul piano agricolo importanti, tuttavia, attuali misure di lotta contro tali agenti patogeni hanno dimostrato troppo conservatore e, quindi, non sufficientemente efficaci e possono potenzialmente rappresentare rischi ambientali. Pertanto, è estremamente necessario identificare i fattori di resistenza ospite per assistere nel controllo malattie delle piante naturalmente attraverso l'identificazione di germoplasma resistente, l'isolamento e caratterizzazione di geni di resistenza e l'allevamento molecolare di cultivar resistenti. A questo proposito, c'è bisogno di stabilire un metodo di inoculazione accurata, rapida e su larga scala per allevare e sviluppare i geni di resistenza della pianta. Il riso blast agente patogeno fungoso Magnaporthe grisea cause sintomi di grave malattia e le perdite di rendimento. Recentemente, M. grisea è emerso come organismo modello per lo studio dei meccanismi delle interazioni pianta-fungo patogeno. Quindi, segnaliamo lo sviluppo di un metodo di test di virulenza di pianta che è specifico per M. grisea. Questo metodo fornisce per inoculazione di spruzzo con una sospensione conidial e ferendo inoculazione con cubetti di micelio o goccioline di conidial sospensione. Il passaggio chiave del metodo ferentesi inoculazione per foglie di riso indipendente è di rendere le ferite sulle foglie delle piante, che evita qualsiasi interferenza causata da resistenza di penetrazione ospite. Questo spray/ferendo protocollo contribuisce per lo screening rapido, accurato e su larga scala di patotipi degli isolati di M. grisea . Questo integrato e metodo di infezione sistematica impianto servirà come punto di partenza eccellente per ottenere una prospettiva ampia di problemi in patologia vegetale.
Introduction
Esplosione di riso, causata da M. grisea, è una delle malattie più gravi per riso varietà in tutto il mondo1,2. Il processo mediante il quale M. grisea infetta piante ospiti comprende una produzione di conidi e collegamento di superficie, una germinazione di conidi e appressorium formazione, una formazione del peg di penetrazione e differenziazione di IFA infettiva, e una malattia diffusa 3. tutte queste fasi sono comuni in molti altri funghi patogeni vegetali e, infatti, un blocco di ogni singola fase previene l'infezione delle piante ospiti. Grazie alla sua importanza economica e trattabilità genetica, M. grisea è emerso come organismo modello per lo studio dei meccanismi delle interazioni pianta-fungo patogeno1,4. Pertanto, studiare la base molecolare di questi stadi di sviluppo in M. grisea contribuirà a delucidare i meccanismi molecolari sottostanti fungine patogenicità e l'identificazione di geni bersaglio candidato per lo screening e il romanzo di progettazione fungicidi5.
Recenti rapporti riguardo M. grisea infezione si sono concentrati sui meccanismi molecolari delle fasi pre-penetrazione, soprattutto il conidiation, la formazione di appressorium, i pioli di penetrazione e la crescita infettive3, 6. Pertanto, è essenziale per sviluppare un protocollo dettagliato per eseguire il test M. grisea infezione. Qui, presentiamo un metodo dettagliato per un test di infezione che utilizza l'analisi di un'infezione dello spruzzo-mediata con una sospensione conidial e l'inoculazione delle ferite con spine miceliale di M. grisea. In questo rapporto, il protocollo si concentra sulla cultura dei ceppi, la preparazione della soluzione conidiation per la spruzzatura e l'inoculazione micelio spina-mediata delle piante con M. grisea. Questi passaggi vengono descritti in dettaglio qui di seguito e una vista schematica che mostra l'intero flusso di lavoro del metodo e una lesione tipica sono riportati nelle figure 1 e 2, rispettivamente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. spray inoculazione con una sospensione di M. grisea conidi
-
Coltura fungosa per M.grisea
- Preparare il terreno di coltura agar (OTA) pomodoro fiocchi d'avena per ceppi fungini.
- Pesare 30-50 g di farina d'avena, aggiungere questo a 800 mL di acqua distillata/deionizzata (ddH2O) e far bollire per 30 min in pentola elettrica.
- Filtrare il succo bollito farina d'avena nel becher attraverso un pezzo di garza.
- Aggiungere 150 mL di succo di pomodoro e 20 g di agar per il filtrato nel becher e aggiungere ddH2O fino a 1.000 mL.
-
Preparazione di materiali sperimentali
- Mettere a bagno circa 50 semi di cultivar di riso (Oryza sativa) Lijiangxintuan-heigu (LTH), ddH2O per 3 d o immergere circa 50 semi di orzo (Hordeum vulgare cv Golden Promise) ddH2O per circa 1 d.
- Avvolgono i semi di riso o di orzo in garza umida e li germinare su carta umida filtro in circa 30 capsule di Petri con un diametro di 10 cm x 10 cm a 28 ° C. Il tempo di germinazione del seme di riso è circa 2-3 d, il tempo di germinazione del seme di orzo è circa 2 d. L'umidità relativa nella serra è circa il 70%.
- Piantare le piantine di riso o di orzo in vaso utilizzando il terreno di impregnazione in autoclave e irrigazione e poi coprirli con uno strato di vermiculite.
- Collocare le piante in una serra adatto o crescita armadio a 25 ° C per circa 1 ~ 2 settimane.
- Tagliare 3 strati di carta da filtro nei circoli con forbici chirurgiche sterili (ogni cerchio dovrebbe avere un diametro di 8 cm) e metterli su piatti di plastica sterile di 100 mm.
- Aggiungere ddH2O ad ogni piatto in ammollo la carta da filtro.
- Assicurarsi che la carta da filtro è completamente bagnata, ma non aggiungere acqua supplementare.
- Rimuovere l'acqua in eccesso con una pompa a vuoto.
- Foglie di Place 2 stuzzicadenti sterili nella piastra di coltura per supportare il riso e orzo; spazio gli stuzzicadenti ~ 2-3 cm di distanza.
- Raccogliere le foglie del riso 2 settimane dopo la semina i semi o prendere le foglie dell'orzo 7D dopo la semina i semi.
- Utilizzando 4 - 6 foglia piantine di riso e orzo, tagliare la parte inferiore del gambo a ~ 5 cm dall'alto e raccogliere le foglie.
-
Protocollo di inoculazione di spruzzo
- Il ceppo fungo sulle piastre di OTA in un Incubatore termostatico (25 ° C) per ~ 4 d della coltura.
- Aggiungere mL ~ 2 di ddH2O utilizzando un 0,5 - pipetta da 5 mL per ogni piatto 4-giorno-vecchio.
- Con un ciclo di inoculazione, raschiare il micelio del ceppo di selvaggio-tipo di M. grisea e il ceppo mutante in detriti dei miceli.
- Raccogliere i detriti di Miceli e trasferirlo in una nuova piastra OTA. Prendere i detriti di Miceli e colpo secco nel banco pulito.
- Coprire la piastra con 3 strati di garza per assicurare l'umidità necessaria per la crescita di conidi in una serra a 25 ° C nel corso della giornata (14 h) e 23 ° C nella notte (10 h) per 24-48 h.
- Aggiungere 2 mL di ddH2O ad ogni piatto e raschiare delicatamente i conidi con tamponi di cotone sterile, seguiti da una filtrazione attraverso 2 strati di carta per lenti. Fare attenzione a non graffiare la superficie del terreno di coltura.
- Trasferire la sospensione di conidi in una nuova provetta da 50 mL con una pipetta di 100-1.000 µ l.
- Centrifugare per 5 minuti, a un minimo di 5.000 x g e a 25 ° C.
- Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet per dare 2 x 104 conidi / mL in un 0.025% soluzione di Tween-20 (v/v). La soluzione di Tween-20 è di solito circa 10-20 mL.
- Versare la sospensione di spore in uno spruzzatore portatile.
- Spay circa 10 mL della sospensione conidial sulle foglie delle piantine di riso 2-settimana-vecchio o orzo riso foglie delle piantine d'orzo 7-giorno-vecchio e li Incubare a 25 ° C in una camera buia, umida per ~ 24 h. Spray le piante di controllo con 0.025% soluzione di Tween-20 (v/v).
- Trasferire le foglie in un'altra camera umida sotto una luce fluorescente a 25 ° C per un fotoperiodo di 12 h.
- Registrare i sintomi di malattia a 5 d dopo l'inoculazione. Esaminare le lame di riso e orzo malato di ~ 6 cm di lunghezza. La valutazione standard è secondo il sistema di punteggio per resistenza all'esplosione dell'International Rice Research Institute (IRRI). I dettagli del sistema di punteggio per resistenza all'esplosione sono riportati nella tabella 1.
- Fotografare le foglie per valutare l'infezione dei ceppi testati. L'infezione è stata valutata dal numero di lesioni per 3,6 cm2.
2. ferendo l'inoculazione con cubetti di micelio o goccioline di Conidial sospensione di M. grisea
- Utilizzando un ago anatomico, raschiare tre ferite lunghe 2-3 cm in vene principali di fogli staccati riso e orzo; fare attenzione a non per penetrare le foglie.
- Mettere le foglie raschiate su stuzzicadenti e spruzzare un 0,02% Tween-20 soluzione sulle foglie per formare uno strato di goccioline (v/v).
- Tagliare una spina miceliari 0,5 x 0,5 cm per ogni ceppo di M. grisea (ceppi wild-type e mutanti, complemento, o altri ceppi di prova) da una piastra OTA.
- Mettere i tappi miceliari o 25 µ l gocce di sospensione conidial sui feriti lascia e incubare le foglie a 25 ° C in una camera umida per 3-8 d.
- Esaminare le lesioni al post-inoculazione d 5-7. Il metodo di esame è lo stesso come è stato per il metodo di inoculazione di spray (Vedi punto 1.3.13).
- Esaminare le lame di riso e orzo malato di ~ 6 cm di lunghezza e fotografarli per valutare l'infezione dei ceppi testati. L'infezione è stata valutata dal numero di lesioni per 3,6 cm2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
L'intero flusso di lavoro per la tecnica è illustrata nella Figura 1. I dosaggi di infezione della pianta sono stati effettuati su semenzali del riso suscettibili 14-giorno-vecchio (o. sativa cv CO-39) o suscettibile 7-giorno-vecchio orzo lascia (H. vulgare cv Golden Promise)7,8,9. Per verificare un'infezione sulle foglie di riso, una sospensione conidial (1.0 x 105 spore/mL) del ceppo di selvaggio-tipo di M. grisea P131 e il ceppo mutante di delezione di Com1 sono stati preparati e poi spruzzato le guaine fogliari del 14-giorno-vecchio suscettibile Piantine di CO-39, che allora erano tenute in una camera umida per 5 d10. La CO-39 P131-inoculato lascia visualizzato le lesioni tipiche robuste scoppio del riso, ma le foglie inoculate Com1 ha mostrato i difetti evidenti di infezione e non potevano suscitare un'infezione completa (Figura 2A). Il ceppo di selvaggio-tipo P131 è un ceppo ottenuto da si-Liang Peng nel 198818. Il mutante null MoKMT2H (ΔMoKMT2H) è stato ottenuto da Cao et nel nostro laboratorio utilizzando un obiettivo gene sostituzione strategia11. Il mutante di Com1 è stato isolato da Yang et al. in lab10 di si-Liang Peng.
Per verificare se la M. grisea ΔMoKMT2H potrebbero infettare le cellule dell'ospite attraverso ferite, abrasa foglie di riso selvaggio-tipo piante sono stati inoculati con spine miceliale del ΔMoKMT2H tramite il metodo spray o ferimento metodo11. Le foglie che sono state inoculate mediante spray con ΔMoKMT2H ha rivelato nessun difetto evidente nell'infezione ΔMoKMT2H confrontato con il ceppo P131/selvaggio-tipo; Tuttavia, sono stati osservati difetti evidenti per foglie inoculate con ΔMoKMT2H tramite ferite (Figura 2A). Per testare ulteriormente l'infezione di pianta con foglie di orzo, sani o foglie feriti (cv Golden Promise) sono stati inoculati con goccioline conidial o spine miceliale, rispettivamente, di Com1, ΔMoKMT2Ho P131. post-All'inoculazione 5D, lesioni di scoppio di riso tipici erano pienamente sviluppato sulle foglie inoculate con il ΔMoKMT2H o il ceppo P131, mentre le lesioni più piccole e meno sono state trovate sulle foglie inoculate con il mutante di Com1 (Figura 2 B).
Figura 1 : Uno schema che illustra la pianta infezione. Semi di piante furono fatti germinare nel suolo in vasi di plastica (50 mm2 x 50 mm di profondità, con un foro di drenaggio), due semi per vaso, e le piantine sono state coltivate in una serra. La cultura e le vaccinazioni del fungo blast M. grisea si sono sviluppate sulle piastre di OTA. Per i conidi metodo di inoculazione di spruzzatura, la sospensione di conidi era sospeso in un 0,02% (v/v) soluzione di Tween-20 e spruzzata le piante di riso e orzo. Per il metodo di inoculazione graffiato, le foglie delle piante raschiata riso e orzo erano messo su piatti di plastica e poi inoculate da una spina micelia o la sospensione di conidi. E poi, tutte le foglie vegetali trattati erano buio-coltivati per 24 h e luce-coltivati per 12 h. Infine, è stato registrato il numero di colonie all'interno delle unità di 3,6 cm2 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Com1 e MoKMT2H sono necessari per una formazione conidium e patogenicità su foglie di riso. (A) questo pannello mostra l'inoculazione di riso lascia via conidi spray (a sinistra) o spina micelio (a destra) con conidi dal P131 di selvaggio-tipo di M. grisea , mutante Com1o ΔMoKMT2H. Tipiche foglie sono stati osservati 7 d dopo l'inoculazione micelio spina-mediata, che è stato condotto su foglie di riso abrase. Le lesioni tipiche sono state osservate 5 d dopo l'inoculazione micelio spina-mediata. Orzo (B) foglie sono stati inoculati tramite conidi spray (a sinistra) o micelio spina (a destra). Come un controllo di trattamento fittizio, è stato spruzzato lo stesso volume di una soluzione di Tween-20 (v/v) di 0.025%. Per l'inoculazione di ferita, la figura di P131 è stata modificata da Cao et al. 11. il MoKMT2H nei funghi ascomiceti è un omologo funzionale della Ash1, che è implicato nella metilazione H3K4 e H3K3611. Il bar = 1 cm. I mutanti di Δcom1 sono stati ridotti significativamente nella virulenza sul riso e orzo semenzali10. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Scala | Descrizione |
| 1 | Piccole macchiette marroni di dimensione del punto di perno |
| 2 | Piccole macchie grigie tondeggiante leggermente allungata, necrotico, circa 1-2 mm di diametro, con un margine distinto marrone. Le lesioni si trovano principalmente sulle foglie superiori |
| 3 | Tipo di lesione è lo stesso come in 2, ma un numero significativo di lesione sono sulle foglie di sopralzo |
| 4 | Tipica suscettibile di scoppio lesioni, 3 mm o più lunghe, infettare inferiore al 4% dell'area di theleaf |
| 5 | Tipico scoppio suscettibili lesioni, 3 mm o più a lungo, d'infezione meno di 4-10% della superficie foglia |
| 6 | Lesioni tipico scoppio suscettibili, 3 mm o più lungo, che infettano meno di 11-25% della zona di foglia |
| 7 | Lesioni tipica esplosione suscettibili, 3 mm o più lungo, che infettano meno di 26-50% della zona di foglia |
| 8 | Lesioni tipico scoppio suscettibili, 3 mm o più lungo, che infettano meno di 51-75% della zona di foglia, molti morti di foglie |
| 9 | Lesioni tipico scoppio suscettibili, 3 mm o più a lungo, infettare più di 75% della superficie della foglia |
Tabella 1: un sistema di scoring per resistenza all'esplosione. La tabella è citata da International Rice Research Institute (IRRI).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Geni di resistenza di malattia pianta svolgono un ruolo essenziale nella prevenzione delle infezioni da agenti patogeni, tra cui funghi patogeni1,12. Esplosione di riso è stato utilizzato come modello per comprendere la natura delle strutture di popolazione dell'agente patogeno e per identificare geni della pianta resistenza4. Pertanto, è necessario esaminare il genotipo di resistenza di malattia e genotipi di avirulenza delle principali varietà di piante agricole su larga scala per identificare piante resistenti alle malattie che possono essere coltivate continuamente. Inoltre, i vantaggi di genotipi di avirulenza degli agenti patogeni di campo richiedono la distribuzione razionale dei diversi genotipi resistenti di host varietà12,13. Tuttavia, gli attuali metodi di inoculazione comunemente interferiscano con la proiezione per resistenza e patogeno identificazione14,15,16,17.
Qui, presentiamo un metodo rapido e preciso per testare per l'infezione di pianta. Questo metodo di inoculazione è adatto per l'identificazione delle piante resistenti durante prove di allevamento e del fenotipo di una popolazione di progenie durante la clonazione dei geni di resistenza. Qui, abbiamo stabilito un metodo per l'inoculazione dei feriti pianta lascia con M. grisea. Perché la resistenza dell'ospite svolge un ruolo importante nell'impedire la diffusione di un agente patogeno, questo metodo in vitro , che ha prodotto le ferite sul riso testata lascia e inoculato l'esplosione di riso sulla ferita, è conveniente per la creazione di un'infezione direttamente nel le foglie senza penetrare l'epidermide foglia e la parete delle cellule epidermica. Inoltre, questo metodo di inoculazione è adatto per le foglie di diverse età. I risultati di inoculazione sono stabile e preciso. Il metodo di inoculazione di ferire utilizzabile per inoculazione con Miceli per identificare la patogenicità di ceppi fungini che producono solo gli importi bassi di conidi.
Questo protocollo contribuirà ulteriormente alla nostra comprensione dei meccanismi patogenetici che sono conservate in funghi, come pure i fattori patogeni specifici che consentono un fungo per resistere e sopprimere l'immunità innata del suo ospite13. Tuttavia, l'inoculazione di ferita non è applicabile quando si tenta di determinare il tasso di un conidial invasione e l'espansione dei miceli. Ma allo stato naturale, il metodo di inoculazione di spray può riflettere meglio la patogenicità di un agente patogeno. Il metodo di inoculazione spray è facile da usare e consente di migliorare l'efficienza del lavoro. Presi insieme, questi risultati che indica un metodo di inoculazione preciso e stabile sono necessarie per lo screening pianta di geni per la resistenza e la determinazione di patogenicità.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto il progetto speciale di ricerca scientifica dell'Università di agricoltura di Pechino (YQ201603) e il progetto scientifico del Comitato educativo di Pechino (KM201610020005).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Filter paper | GE Healthcare brand(Sweden) | 10311387 | |
| 50-mL tube | CORNING(Amercia) | 430290 | |
| Centrifuge | Eppendorf(Amercia) | 5804R | |
| Culture dish | Thermofisher(Amercia) | 150326 | |
| 0.5-5 mL pipette | Eppendorf | 4920000105 | |
| 100-1000uL pipette | Eppendorf | 4920000083 | |
| Vacuum pump | Leybold | D25B | |
| Dissection needle | FST | 26000-35 | |
| Incubator | MEMMERT | PYX313 | |
| Inoculation ring | Greiner Bio One | 731175 |
References
- Li, W. T., et al. A natural allele of a transcription factor in rice confers broad-spectrum blast resistance. Cell. 170 (1), 114-126 (2017).
- Chi, M. H., Park, S. Y., Kim, S., Lee, Y. H. A novel pathogenicity gene is required in the rice blast fungus to suppress the basal defenses of the host. PLoS Pathogens. 5 (4), 1000401 (2009).
- Jia, Y., Valent, B., Lee, F. N. Determination of host responses to Magnaporthe grisea.on detached rice leaves using a spot inoculation method. Plant Disease. 87 (2), 129-133 (2003).
- Ebbole, D. J. Magnaporthe as a model for understanding host-pathogen interactions. Annual Review of Phytopathology. 45, 437-456 (2007).
- Hamer, J. E., Talbot, N. J. Infection-related development in the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Current Opinion in Microbiology. 1 (6), 693-697 (1998).
- Howard, R. J., Valent, B. Breaking and entering: host penetration by the fungal rice blast pathogen Magnaporthe grisea. Annual Review of Microbiology. 50, 491-512 (1996).
- Chen, X. L., et al. N-Glycosylation of Effector Proteins by an α-1,3- Mannosyltransferase Is Required for the Rice Blast Fungus to Evade Host Innate Immunity. The Plant Cell. 26 (3), 1360-1376 (2014).
- Zhang, Y., et al. M.ARG1, MoARG5,6 and MoARG7 involved in arginine biosynthesis are essential for growth, conidiogenesis, sexual reproduction, and pathogenicity in Magnaporthe oryzae. Microbiological Research. 180, 11-22 (2015).
- Du, Y. X., et al. A serine/threonine-protein phosphatase PP2A catalytic subunit is essential for asexual development and plant infection in Magnaporthe oryzae. Current Genetics. 59 (1-2), 33-41 (2013).
- Yang, J., et al. A novel protein com1 is required for normal conidium morphology and full virulence in Magnaporthe oryzae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 23 (1), 112-123 (2010).
- Cao, Z. J., et al. An ash1-like protein MoKMT2H null mutant is delayed for conidium germination and pathogenesis in Magnaporthe oryzae. BioMed Research International. 2016, 1575430 (2016).
- Bryan, G. T., et al. A single amino acid difference distinguishes resistant and susceptible alleles of the rice blast resistance gene Pi-ta. The Plant Cell. 12 (11), 2033-2045 (2000).
- Zhou, J. M. Plant pathology: a life and death struggle in rice blast disease. Current Biology. 26 (18), 843-845 (2016).
- Guo, M., et al. MoGrr1, a novel F-box protein, is involved in conidiogenesis and cell wall integrity and is critical for the full virulence of Magnaporthe oryzae. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (19), 8075-8088 (2015).
- Talbot, N. J. On the trail of a cereal killer: Exploring the biology of Magnaporthe grisea. Annual Review of Microbiology. 57, 177-202 (2009).
- Wilson, R. A., Talbot, N. J. Under pressure: investigating the biology of plant infection by Magnaporthe oryzae. Nature Reviews Microbiology. 7, 185-195 (2009).
- Jia, Y. L., Lee, F. N., McClung, A. Determination of Resistance Spectra of the Pi-ta and Pi-k Genes to U.S. Races of Magnaporthe oryzae Causing Rice Blast in a Recombinant Inbred Line Population. Plant Disease. 93, 639-644 (2009).
- Peng, Y. L., Shishiyama, J. Temporal sequence of cytological events in rice leaves infected with Pyricularia oryzae. Canadian Journal of Botany. 66 (4), 730-735 (1988).
