Summary
Здесь мы представляем протокол для проверки вирулентности завод с завода возбудитель Magnaporthe мурены. Этот доклад будет способствовать крупномасштабные скрининга pathotypes грибов изолятов и служат отличной отправной точкой для понимания устойчивых механизмов растений во время молекулярной разведения.
Abstract
Растения обладают мощной системы, чтобы защитить себя от потенциальных угроз, патогенных грибов. Для аграрно важных растений однако, текущие меры по борьбе с такой патогенов оказались слишком консервативна и, таким образом, недостаточно эффективными и они могут создавать потенциально экологические риски. Таким образом это крайне необходимо для выявления факторов хост сопротивления для оказания помощи в контроля заболеваний растений естественно через выявление устойчивых зародышевой плазмы, изоляции и характеристика генов сопротивления и молекулярных разведения устойчивых сортов. В этой связи существует необходимость установить метод точного, быстрого и крупномасштабных прививка размножаться и развиваться завод гены сопротивления. Рис взрыв грибкового патогена Magnaporthe мурены причины тяжелой болезни симптомы и принести убытки. Недавно м. мурены стала модель организма для изучения механизмов взаимодействия растений грибкового патогена. Следовательно мы сообщают о разработке метода испытания вирулентности завод, который является специфичным для м. мурены. Этот метод обеспечивает для прививки спрей с конидиальная подвеска и ранив прививка с мицелием кубов или капельки конидиальная подвески. Ключевым шагом ранив метод прививки для отсоединенной рис листья, чтобы раны на листьях растений, который предотвращает любые помехи, вызванные сопротивление пенетрации хост. Этот спрей/ранив протокол способствует быстрой, точной и крупномасштабных скрининга pathotypes м. мурены изолятов. Это комплексное и систематические завод инфекции метод послужит отличной отправной точкой для получения широкой перспективы вопросов в фитопатологии.
Introduction
Райс Доменная, вызванные м. мурены, является одним из самых серьезных заболеваний для риса сорта во всем мире1,2. Этот процесс, по которому м. мурены заражает растений-хозяев включает в себя производство конидий и поверхности крепления, прорастание конидий и Аппрессории образование, формирование проникновения колышек и инфекционных ГИФА дифференциации, и распространением болезни 3. все эти этапы являются общими в многих других растений патогенных грибов, и, действительно, блокаду любой одноступенчатые предотвращает инфекции растений-хозяев. Благодаря его экономическое значение и отслеживаемости генетических м. мурены стала модель организма для изучения механизмов взаимодействия растений грибкового патогена1,4. Таким образом изучая молекулярные основы эти этапы развития в . м. мурены поможет прояснить молекулярных механизмов грибковых патогенности и идентификации генов-мишеней кандидата для проверки и проектирования Роман Фунгициды5.
Последние доклады, касающиеся м. мурены инфекции были сосредоточены на молекулярных механизмов до проникновения этапов, особенно conidiation, Аппрессории формирования, проникновения колышки и инфекционные роста3, 6. Таким образом, очень важно разработать подробный протокол для тестирования м. мурены инфекции. Здесь мы представляем подробный метод для инфекции тест, который использует спрей опосредованной инфекции анализов с конидиальная подвеска и прививка РАН с мицелиальных вилки м. мурены. В настоящем докладе протокол посвящен культуре штаммов, подготовка conidiation решения для распыления и мицелиальных вилка опосредованной Прививка растений с . м. мурены. Эти шаги описаны подробно ниже, и схема показаны весь процесс метода и типичные поражения приведены на рисунках 1 и 2, соответственно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. spray прививка с подвеской конидий мурены м.
-
Грибковые культуры для M.grisea
- Готовить овсянку томатный агар (OTA) питательной среды для штаммов микромицетов.
- Весят 30-50 г овсяных хлопьев, добавить в 800 мл дистиллированной деионизированной воды (ddH2O) и кипятить смесь на 30 мин в электрической кастрюле.
- Фильтр отварной овсянки сок в стакан через кусок Марли.
- 150 мл томатного сока и 20 г агара в фильтрат в стакан и добавить ddH2O до 1000 мл.
-
Подготовка экспериментальных материалов
- Замочите около 50 семена сорта риса (Oryza sativa) Lijiangxintuan-heigu (LTH) ddH2O для 3 d или понежьтесь около 50 семян ячменя (Hordeum vulgare cv золотой обещание) ddH2O для около 1 d.
- Оберните семена риса или ячменя в влажной марлей и прорастают их на влажные фильтровальную бумагу в около 30 чашек Петри с диаметром 10 см х 10 см на 28 ° C. Время прорастания семян риса-около 2-3 d, время прорастания семян ячменя около 2 d. Относительная влажность воздуха в теплицах составляет примерно 70%.
- Посадку саженцев риса или ячменя в горшках, используя газобетона заливки почвы и полив, а затем покрыть их с слой вермикулита.
- Поместите растения в подходящей Теплице или роста кабинета при 25 ° C около 1 ~ 2 недели.
- Вырезать 3 слоя фильтровальной бумаги в кругах с стерильные Ножницы хирургические (каждый круг должен иметь диаметр 8 см) и поместите их на 100 мм стерильных пластиковых пластин.
- Добавьте ddH2O в каждое блюдо, чтобы впитать фильтровальной бумаги.
- Убедитесь, что фильтр бумага полностью мокрые, но добавить без дополнительных воды.
- Удалите излишки воды с вакуумным насосом.
- 2 место стерильным зубочистки в культуре блюдо для поддержки ячмень рис листья; пространство зубочистки ~ 2-3 см друг от друга.
- Собирают листья рис 2 недели после посева семян или взять в листьях ячменя 7 d после посева семян.
- С помощью 4 - 6 листьев саженцев риса/ячменя, отрезать нижнюю часть ствола на ~ 5 см от верхней и собирать листья.
-
Спрей прививка протокол
- Культура грибковых нагрузку на OTA пластины в термостатический инкубатора (25 ° C) для ~ 4 d.
- Добавьте ~ 2 мл ddH2O, с помощью 0.5 - 5 мл пипетки на каждой пластине 4-дневного возраста.
- С прививкой петли скрип мицелия м. мурены одичал тип деформации и мутантный штамм в мицелия мусора.
- Сбор мусора мицелия и перевести его на новую пластину OTA. Возьмите мицелия мусора и сушить в чистой скамейке.
- Крышка с 3 слоями марля для обеспечения влажности, необходимых для роста конидий в Теплице при 25 ° C в течение дня (14 ч) и 23 ° C в ночь (10 h) за 24-48 ч.
- Добавить 2 мл ddH2O к каждому блюду и скрести конидий осторожно стерильные ватные тампоны, следуют фильтрации через 2 слоя бумаги объектива. Будьте осторожны, чтобы не поцарапать поверхность питательной среды.
- Перенесите конидий подвеска в новый Тюбик 50 мл с пипеткой 100-1000 мкл.
- Центрифуги для 5 минут как минимум 5000 x g при 25 ° C.
- Удалить супернатант и Ресуспензируйте Пелле дать конидий4 2 x 10 мл 0,025% (v/v) Tween-20 решения. Tween-20 решение обычно это около 10-20 мл.
- Налейте споро подвеска ручной опрыскиватель.
- Spay около 10 мл конидиальная подвески на рис листья 2-недели Старый рис саженцы или ячменя листьях проростков ячменя 7-дневных и инкубировать их в 25 ° C в темных, влажных камере для ~ 24 h. спрей управления растения с 0,025% (v/v) Tween-20 решения.
- Перенесите листья в другой влажной камере под флуоресцентный свет при 25 ° C для фотопериода 12 h.
- Запись симптомы болезни на 5 d после прививки. Изучите больной риса/ячмень лезвия ~ 6 см в длину. Стандарта оценки согласно системе скоринга взрыва сопротивления из Международный институт исследований риса (МНИИР). Сведения о системе скоринга взрыва сопротивления приведены в таблице 1.
- Фотография листья для оценки инфекции испытанных штаммов. Инфекция оценивали количество поражений за 3,6 см2.
2. ранив прививка с мицелием кубов или капельки конидиальная подвеска мурены м.
- С помощью анатомических иглы, скрести три 2-3 см длиной раны в основных вен отдельностоящий риса/ячмень листьев; Будьте осторожны, не проникает в листья.
- Положите листья царапины на зубочистки и спрей 0,02% (v/v) Tween-20 решения на листья образуют слой капель.
- Вырежьте 0,5 х 0,5 см мицелиальных плагин для каждого штамма м. мурены (штаммов одичал тип, мутант, дополнения, или другие штаммы тест) от пластины OTA.
- Положите мицелиальных вилки или 25 мкл капельки конидиальная подвески на раненых листья и инкубации листья при 25 ° C в влажной камере для 3-8 d.
- Изучите поражения на 5-7 d после прививки. Метод изучения такой же, как это было для метода прививка спрей (см. шаг 1.3.13).
- Изучить больной риса/ячмень лезвия ~ 6 см в длину и сфотографировать их оценить инфекции испытанных штаммов. Инфекция оценивали количество поражений за 3,6 см2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Весь рабочий процесс для техника показано на рисунке 1. Завод инфекции анализов проводились на 14-дневных восприимчивы риса саженцев (O. sativa cv CO-39) или листья восприимчивы 7-дневных ячменя (H. vulgare cv золотой обещание)7,8,9. Для проверки инфекции на рис листья, были подготовлены и затем распыляется на лист влагалищ 14-дневных восприимчивы конидиальная подвеска (1,0 x 10-5 споры/мл) м. мурены дикого штамма Р131 и удаления мутантный штамм Com1 CO-39 саженцев, которые затем хранились в влажной камере для 5 d10. Р131 прививку CO-39 оставляет отображаемых типичный надежного поражения Райс Доменная, но Com1-прививку листья показал очевидное инфекции дефекты и не может добиться полного инфекции (рисA). Штамм одичал типа Р131 является штамм полученные вы-Лян Пэн в 1988 году18. Значение null мутант MoKMT2H (ΔMoKMT2H) был получен Цао et al. в нашей лаборатории, с помощью целевого гена стратегия замены11. Com1 мутант был выделен Ян et al. в вы-Лян Пэн лаборатории10.
Чтобы проверить, является ли м. мурены ΔMoKMT2H могут заразить клетки хозяина через раны, скрепляемые листья дикого риса, что растения были привиты с мицелиальных вилки ΔMoKMT2H через метод спрей или ранение метод11. Листья, которые были привиты спрей с ΔMoKMT2H показали без явных дефектов в ΔMoKMT2H инфекции, по сравнению с Р131/одичал тип деформации; Однако очевидные дефекты были замечены за листья, привиты с ΔMoKMT2H через раны (рисA). Для дальнейшего тестирования завод инфекции с листьях ячменя, здоровым или раненых листья (cv золотой обещание) были привиты с конидиальная капель или мицелиальных вилки, соответственно, Com1, ΔMoKMT2Hили Р131. В 5 d после прививки типичный Райс Доменная поражения полностью разработал на листьях, привиты с ΔMoKMT2H или Р131 штамма, в то время как все меньше и меньше повреждений были найдены на листьях, привиты с Com1 мутант (рис. 2 B).
Рисунок 1 : Схема, иллюстрирующая завод инфекции. Были проросшие семена растений в почве в пластиковые горшки (50 мм2 x 50 мм в глубину, с дренажное отверстие), два семена на горшок, и саженцы выращивали в парнике. Культуры и прививки гриб взрыва м. мурены были выращены на тарелках OTA. Для конидий, прививка методом напыления подвеска конидий было приостановлено в 0,02% (v/v) Tween-20 решения и распыляется на рис/ячмень растений. Для метода почесал прививка листья растений царапины риса/ячмень были положить на пластиковые пластины и затем прививку мицелиальных вилкой или конидий подвеска. И тогда, все лечение растений листья были темно культивированный за 24 часа и искусственного света на 12 ч. Наконец был записан количество колоний в подразделениях 3,6 см2 . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Com1 и MoKMT2H , необходимые для формирования Конидия и патогенность на рис листья. (A) группа показывает прививка рис листьев через конидий спрей (слева) или мицелиальных вилка (справа) с конидий от м. мурены одичал типа Р131, мутант Com1или ΔMoKMT2H. Типичные листья были замечены 7 d после мицелиальных вилка опосредованной прививка, который был проведен на листьях прошлифовать риса. Типичные повреждения наблюдались 5 d после мицелиальных вилка опосредованной прививка. (B) ячменя, листья были привиты через конидий спрей (слева) или мицелиальных вилка (справа). Как элемент управления макет лечения такой же объем 0,025% (v/v) решение Tween-20 был распылен. Для прививки рану фигура Р131 был изменен по Цао и др. 11. MoKMT2H в грибов аскомицетов является функциональной гомолога Ash1, который причастен к H3K4 и H3K36 метилирование11. Бар = 1 см. Δcom1 мутанты были значительно снижены в вирулентности саженцев риса и ячменя10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Шкала | Описание |
| 1 | Малые коричневые пятна-точечные размера |
| 2 | Небольшие округлые, слегка удлиненные, некротические серые пятна, около 1-2 мм в диаметре, с запасом различных коричневый. Поражения в основном находятся на верхних листьях |
| 3 | Тип поражения то же самое, как в 2, но значительное количество поражения на листьях |
| 4 | Типичные восприимчивы взрыва поражений, 3 мм или более, заражая менее 4% от theleaf |
| 5 | Типичный восприимчивы взрыва поражений, 3 мм или больше, заражение меньше, чем 4-10% от площади листа |
| 6 | Типичный восприимчивы взрыва поражений, 3 мм или больше, заражение меньше, чем 11-25% от площади листа |
| 7 | Типичный восприимчивы взрыва поражений, 3 мм или больше, заражение меньше, чем 26-50% площади листа |
| 8 | Типичный восприимчивы взрыва поражений, 3 мм или больше, заражение меньше чем 51-75% площади листа, много мертвых листьев |
| 9 | Типичный восприимчивы взрыва поражений, 3 мм или более, заражение более 75% площади листа |
Таблица 1: система баллов для взрыва сопротивление. Таблица приводится от Международный институт исследований риса (МНИИР).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Гены сопротивления болезни растений играют важную роль в предотвращении инфекций патогенных микроорганизмов, в том числе грибковых патогенов1,12. Райс Доменная использовалась как модель понять природу структур населения возбудителя и выявить гены сопротивления завод4. Таким образом это необходимо для изучения болезни сопротивления генотип и генотипов avirulence основных сортов сельскохозяйственных растений на больших масштабах для выявления болезням растений, которые можно выращивать непрерывно. Кроме того преимущества генотипов avirulence возбудителей поля требуют рационального распределения различных устойчивых генотипов принимающей сортов12,13. Однако текущие методы модифицирования часто мешают скрининга для сопротивления и возбудителя идентификации14,,1516,17.
Здесь мы представляем быстрый и точный метод для проверки на завод инфекции. Этот метод инокуляции подходит для идентификации устойчивых растений во время размножения испытания и фенотип потомков населения во время клонирования генов сопротивления. Здесь мы создали метод для прививки раненых растений листья с . м. мурены. Потому что сопротивление хост играет важную роль в предотвращении распространения возбудителя, этот метод в пробирке , который произвел раны на проверенных рис листья и привиты риса взрыва на рану, удобен для создания инфекции непосредственно в листья без необходимости проникнуть эпидермиса листа и эпидермальный клеточной стенки. Кроме того этот метод прививки для листьев разных возрастов. Прививка результаты являются стабильными и точной. Метод ранив прививка может использоваться для прививки с мицелия для идентификации патогенности штаммов микромицетов, которые производят только небольшое количество конидий.
Этот протокол будет способствовать нашему пониманию патогенетических механизмов, которые сохраняются в грибов, а также возбудителя специфические факторы, которые позволяют грибок сопротивляться и подавить врожденного иммунитета ее принимающей13. Однако прививка раны не применяется при попытке определить скорость конидиальная вторжения и расширения мицелия. Но в естественном состоянии, метод инокуляции спрей может лучше отражать патогенности патогена. Метод инокуляции спрей прост в эксплуатации и помогает повысить эффективность работы. Взятые вместе, эти результаты, указывающее метод точные и стабильные прививки необходимы для скрининга растений гены сопротивления и установления патогенности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Специальным научно исследовательский проект Пекинского университета сельского хозяйства (YQ201603) и научный проект Пекине образовательного комитета (KM201610020005).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Filter paper | GE Healthcare brand(Sweden) | 10311387 | |
| 50-mL tube | CORNING(Amercia) | 430290 | |
| Centrifuge | Eppendorf(Amercia) | 5804R | |
| Culture dish | Thermofisher(Amercia) | 150326 | |
| 0.5-5 mL pipette | Eppendorf | 4920000105 | |
| 100-1000uL pipette | Eppendorf | 4920000083 | |
| Vacuum pump | Leybold | D25B | |
| Dissection needle | FST | 26000-35 | |
| Incubator | MEMMERT | PYX313 | |
| Inoculation ring | Greiner Bio One | 731175 |
References
- Li, W. T., et al. A natural allele of a transcription factor in rice confers broad-spectrum blast resistance. Cell. 170 (1), 114-126 (2017).
- Chi, M. H., Park, S. Y., Kim, S., Lee, Y. H. A novel pathogenicity gene is required in the rice blast fungus to suppress the basal defenses of the host. PLoS Pathogens. 5 (4), 1000401 (2009).
- Jia, Y., Valent, B., Lee, F. N. Determination of host responses to Magnaporthe grisea.on detached rice leaves using a spot inoculation method. Plant Disease. 87 (2), 129-133 (2003).
- Ebbole, D. J. Magnaporthe as a model for understanding host-pathogen interactions. Annual Review of Phytopathology. 45, 437-456 (2007).
- Hamer, J. E., Talbot, N. J. Infection-related development in the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Current Opinion in Microbiology. 1 (6), 693-697 (1998).
- Howard, R. J., Valent, B. Breaking and entering: host penetration by the fungal rice blast pathogen Magnaporthe grisea. Annual Review of Microbiology. 50, 491-512 (1996).
- Chen, X. L., et al. N-Glycosylation of Effector Proteins by an α-1,3- Mannosyltransferase Is Required for the Rice Blast Fungus to Evade Host Innate Immunity. The Plant Cell. 26 (3), 1360-1376 (2014).
- Zhang, Y., et al. M.ARG1, MoARG5,6 and MoARG7 involved in arginine biosynthesis are essential for growth, conidiogenesis, sexual reproduction, and pathogenicity in Magnaporthe oryzae. Microbiological Research. 180, 11-22 (2015).
- Du, Y. X., et al. A serine/threonine-protein phosphatase PP2A catalytic subunit is essential for asexual development and plant infection in Magnaporthe oryzae. Current Genetics. 59 (1-2), 33-41 (2013).
- Yang, J., et al. A novel protein com1 is required for normal conidium morphology and full virulence in Magnaporthe oryzae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 23 (1), 112-123 (2010).
- Cao, Z. J., et al. An ash1-like protein MoKMT2H null mutant is delayed for conidium germination and pathogenesis in Magnaporthe oryzae. BioMed Research International. 2016, 1575430 (2016).
- Bryan, G. T., et al. A single amino acid difference distinguishes resistant and susceptible alleles of the rice blast resistance gene Pi-ta. The Plant Cell. 12 (11), 2033-2045 (2000).
- Zhou, J. M. Plant pathology: a life and death struggle in rice blast disease. Current Biology. 26 (18), 843-845 (2016).
- Guo, M., et al. MoGrr1, a novel F-box protein, is involved in conidiogenesis and cell wall integrity and is critical for the full virulence of Magnaporthe oryzae. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (19), 8075-8088 (2015).
- Talbot, N. J. On the trail of a cereal killer: Exploring the biology of Magnaporthe grisea. Annual Review of Microbiology. 57, 177-202 (2009).
- Wilson, R. A., Talbot, N. J. Under pressure: investigating the biology of plant infection by Magnaporthe oryzae. Nature Reviews Microbiology. 7, 185-195 (2009).
- Jia, Y. L., Lee, F. N., McClung, A. Determination of Resistance Spectra of the Pi-ta and Pi-k Genes to U.S. Races of Magnaporthe oryzae Causing Rice Blast in a Recombinant Inbred Line Population. Plant Disease. 93, 639-644 (2009).
- Peng, Y. L., Shishiyama, J. Temporal sequence of cytological events in rice leaves infected with Pyricularia oryzae. Canadian Journal of Botany. 66 (4), 730-735 (1988).
