Summary
פרוטוקול זה מציג שיטה פשוטה ויעילה כדי לבודד, לזהות ולכמת תאים חיסוניים המתגוררים במהלך מצב יציב או דלקת שריר הלב של עכברים. הפרוטוקול משלב עיכול אנזימטי ועל מכניים לדור של השעיה תא בודד מסוגל לנתח עוד יותר על ידי cytometry זרימה.
Abstract
המערכת החיסונית היא מרכיב חיוני של לב בריא. שריר הלב הוא ביתם של אוכלוסיה עשירה של תאים חיסוניים שונים תת-ערכות עם תפקודי מידור במהלך מצב יציב ובמהלך צורות שונות של דלקת. עד לאחרונה, המחקר של תאים חיסוניים בלב הצריכו השימוש במיקרוסקופ או פרוטוקולים עיכול לקוי מפותחת, אשר סיפקה מספיק רגישות בזמן דלקת חמורה אבל לא היו מסוגלים בביטחון לזהות קטן — אבל מפתח – אוכלוסיות של תאים במהלך מצב יציב. כאן נדון שילוב של שיטה פשוטה אנזימטי (collagenase, hyaluronidase ו- DNAse) ועיכול מכני מאתר לבבות ולפניהם קרישה תוך-כלית מינהל מתויג fluorescently נוגדנים להבדיל קטן אבל בלתי נמנע קרישה תוך-כלית תא מזהמים. שיטה זו יוצרת השעיה של מבודד התאים קיימא שניתן נותחו על ידי cytometry זרימה עבור phenotyping וכימות, או מטוהרים נוסף עם תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון או הפרדה מגנטית חרוז לימודי ניתוח או במבחנה תעתיק. אנו כוללים דוגמה של ניתוח cytometric זרימה צעד אחר צעד כדי להבדיל בין מקרופאג מפתח אוכלוסיות תאים דנדריטים של הלב. עבור ניסוי בגודל בינוני (10 לבבות) השלמת ההליך מחייב h 2-3.
Introduction
צורות שונות של מתח שריר הלב או פציעה, כולל איסכמי (פגיעה reperfusion איסכמיה או אוטם שריר הלב) ואיסכמי (יתר לחץ דם או דלקת שריר הלב), לקדם הגיוס של תאים דלקתיים עם תיקוני ומגונן, אבל גם מאפייני פתוגניים. מוקדם ככל 1891, רומברג תיאר לראשונה את הנוכחות של תסנין התאית בשריר של חולים שנדבקו עם טיפוס ועוד השנית1. עם זאת, המחקר מפורט של תאים חיסוניים לב נדרש הפיתוח של טכניקות מתקדמות יותר immunophenotyping. כתוצאה מכך, רק לאחרונה התחלנו להבין כי אוכלוסיה מגוונת של תאים חיסוניים עם תחזוקה חיוני תפקידים במהלך מצב יציב שוכן בתוך שריר הלב.
היסטולוגיה היה, והוא עדיין, השיטה הנפוצה ביותר כדי לאפיין את תאי מערכת החיסון לב בעת דלקת. עם זאת, בעוד היסטולוגיה מייצג כלי אבחוני חשוב, השימוש במחקר של תאי מערכת החיסון לב יש מגבלות חשוב. תאים חיסוניים המתגוררים שריר הלב מייצג חלק קטן מאוד של התאים הכולל ומופצים פחות או יותר באופן שווה בחלל העצום באופן פרופורציונלי. באופן דומה, כמה צורות של דלקת לב, כגון נגיפי דלקת שריר הלב, להציג דפוסים מוקד של דלקת. משמעות הדבר היא כי ניתוח מדויק של המערכת החיסונית של הלב דורשים לעיתים קרובות גבוהה יותר מעלות של דגימה היסטולוגית, הגדלת העלות לצמצם הטיה. יתר על כן, היסטולוגיה מספק כמות מוגבלת מאוד של מידע שימושי בזיהוי תא (למשל מספר פרמטרים). עם מספר גדל והולך של תת-ערכות תא מחייבות השימוש של מספר סמני ביטוי (כולל סמני פני השטח, גורמי שעתוק או על ידי מולקולות), cytometry זרימה ביססה את עצמה בתור הכלי החזק ביותר עבור immunophenotyping, בשל בעלות נמוכה, תפוקה גבוהה.
השימוש בטכניקות immunophenotyping תלויה בשיתוף פעולה הדוק לפיתוח פרוטוקולים לעיכול יעיל המותר עבור ניתוח חד-תאים של מספר גדול של תאים. הפיתוח של הפרוטוקולים ממצה של מיצוי תא נפתח חלון חדש של הזדמנויות במחקר של הלב אימונולוגיה. באמצעות השילוב של מערכת העיכול, cytometry זרימה transcriptomics, האוכלוסיות הגדולות של מקרופאגים, תאים דנדריטים ששוכן בלב היה מאופיין2,3. האוכלוסייה הנפוץ ביותר של תאים חיסוניים הלב במהלך מצב יציב הן CD64+MerTK+ מקרופאגים, אשר ניתן לחלק נוספת המבוססת על הבעת רגשותיהם CCR2 או CD11c2. CCR2+ מקרופאגים שמקורם במח העצם למבוגרים hematopoiesis, בעוד הרוב המכריע של CCR2– מקרופאגים, אשר יכולים לבטא רמות גבוה או נמוך של MHC-II, הם בעיקר ממוצא טרום לידתי. מקרופאגים לבצע פונקציות מפתח כגון תיקון4 ופינוי פסולת5 במהלך פציעה או תמיכה קישוריות חשמלי6 במצב יציב. במהלך צורות שונות של דלקת זרם חשוב של Ly6Cשלום MHC-IIהלאו CD64int ומונוציטים להתרחש, אשר מאוחר יותר להבדיל לתוך Ly6Cשלום CCR2+ מקרופאגים2,7 . אוכלוסיה קטנה יותר באופן משמעותי, אבל חשוב, של תאים המתגוררים שריר הלב של אנשים בריאים מורכב של תאים דנדריטים8,9. שני תת-קבוצות העיקריים של הלב בקרי קבוצת מחשבים קונבנציונלי (cDCs) אפיינו היה לאחרונה: cDC1 (CD103+ DCs), cDC2 (CD11b+ בקרי קבוצת מחשבים). DCs לשחק תפקידים חשובים בהגנה נגד זיהום8 , אך יכול גם לקדם פגיעה עצמית בעת דלקת, במיוחד במהלך אוטם שריר הלב9.
כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה עבור בידוד של קיימא תאים חיסוניים הלב מן העכבר שריר הלב. השיטה משלבת עיכול אנזימטי ועל מכניים עם סינון תא-מסננת כדי לקבל השעיה תא בודד שניתן לנתח, או עוד יותר טהור, על ידי מיון cytometry זרימה או חרוז מגנטי העשרה. מדידות מדויקות של תאי שריר הלב extravascular דורשות זלוף הלב כדי להסרת לכלוך אפשרי מזרם הדם של microvasculature הלב. בנוסף, אנו מציגים שלב אופציונלי של קרישה תוך-כלית תיוג של תאים חיסוניים יכול לשמש כדי נוספות להבדיל תאי שריר הלב מזהמים קרישה תוך-כלית, המבוסס על פרוטוקול et al. Galkina10. לבסוף, אנו מציגים ניתוח cytometry זרימה בסיסיים כדי לזהות את subpopulations הגדולות מקרופאג ו- cDC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
אתיקה במשפט: פרוטוקול זה עבר בדיקה וזכה אושרה על ידי הוועדה אכפת לי חיה אוניברסיטת בריאות ברשת (טורונטו, קנדה), עומדת בדרישות המועצה הקנדית על טיפול בעלי חיים.
1. מאגר הכנה
- להכין מאגר HBB (מאוזנת מלח פתרון (HBSS של האנק), סרום שור חום 2% לא פעיל, 0.2% שור אלבומין). להוסיף 10 מ של חום להשבית סרום שור ו- 1g של אלבומין שור עד 500 מ"ל של HBSS. מסנן לחטא דרך מסנן 0.2 µm ולאחסן ב 4 º C.
- הכנת מאגר FACS (buffered פוספט תמיסת מלח (PBS), 2% חום להשבית סרום שור, 1 מ Ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA, pH 8.0)). להוסיף 10 מ ל חום להשבית סרום שור, 1 מ"ל של 0.5 M EDTA עד 500 מ"ל ל- PBS. מסנן לחטא דרך מסנן 0.2 µm ולאחסן ב 4 º C.
הערה: פתרונות שניתן לאחסן ב 4 ° C עד כחודש.
2. תוויות של מחזורי לויקוציטים
- גילוח ורחיצה כירורגית להכין אנטי-עכבר הזרקת CD45 עם 1 µg של נוגדן מעורבבת עם פוספט סטרילי buffered תמיסת מלח (PBS) עבור אמצעי אחסון הזרקת הסופי של µL 200/עכבר. לטעון אמצעי אחסון לתוך מזרק אינסולין 28.5G ולשמור מן האור.
הערה: השתמש שני נוגדנים שונים מתויג fluorochrome אנטי-CD45 על מנת להבדיל את קרישה תוך-כלית (מוכתמים דרך העירוי המינהל) ההכתמה intracardiac (מוכתמים לאחר עיכול; ראה שלב 4). -
לחמם עכברים (בת 8-12 שבועות) על ידי חשיפת הזנב למנורה לחום האדום במשך 5 דקות.
התראה: לא לחמם יותר מדי את החיה. לשמור את המנורה במרחק בטוח (> 30 ס מ).- לרסן את החיה במצב בחזה ובצלעות באמצעות התקן המתאים. לחשוף ולייצב את הזנב עם היד הלא דומיננטית על ידי שיתק בבסיס הזנב עם והאמה ובאזור אמצע-הדיסטלי של הזנב כאשר האגודל הקמיצה.
התראה: אין להחיל יותר מדי כוח בקצה הזנב כמו העור יכול להיות הסיר. הכנס את המחט עם שפוע פונה כלפי מעלה המזרק. שמרו את המחט במקביל לוריד בכל עת קל לנקב את הווריד.
הערה: דם הזנת את המזרק עלולה להתרחש, סימן של זריקה טובה. כיפוף המחט לזווית 90 מעלות יכול להקל על הניהול עירוי. אשר עם משרדך בטיחות כמו מחטים כיפוף עשוי לייצג סיכון. - מזריקים לווריד 200 µL לווריד הזנב. הנוזל צריך לזרום בקלות ונקה באופן זמני את הווריד.
התראה: אל תדחף בכוח נוזלים אם ההתנגדות. זהו סימן מוזרים של המחט. - לאפשר נוגדן לזרום למשך 5 דקות לפני בצורה הומאנית המתות חסד העכבר.
- לרסן את החיה במצב בחזה ובצלעות באמצעות התקן המתאים. לחשוף ולייצב את הזנב עם היד הלא דומיננטית על ידי שיתק בבסיס הזנב עם והאמה ובאזור אמצע-הדיסטלי של הזנב כאשר האגודל הקמיצה.
3. הלב בידוד ועיכול
-
המתת חסד עכברים באמצעות CO2 או על ידי אחרים הליך מקובל כמוסד המתת חסד.
- עבור CO2 המתת חסד, מקם את העכבר בתא2 CO ולהגדיר את קצב מילוי 20% נפח החדר לדקה (קרי, אם החדר הוא L 10, מילוי ב- 2 ל'/דקה). לפעול במשך 2 דקות וצג העכבר עד להפסקת נשימה.
- . כבה את ה-CO2 ולא להשאיר את העכבר דק 1-2 נוספים ודא נשימה שחדל לפני פתיחת התא ולבצע קמצוץ הבוהן כדי לאשר שהעכבר מת לפני שתמשיך כדי לעבד את העכבר.
- לרסס את העכבר עם 70% אתנול. הרם את העור בבטן, לנתח את העכבר על ידי גזירה לאורך תחילת קו האמצע הגחון ברמה של הירכיים עד עצם החזה. לפתוח את הבטן ולהעביר את הכבד כדי לחשוף את הסרעפת.
-
חותכים את הסרעפת, אז הצלעות משני צידי הקו האמצעי, להיות נזהר שלא ניקב את הריאות והלב.
- חושפים הלב על ידי פילינג בחזרה את הצלעות, ואז לחתוך קודם אטריה שמאל ואחריו אטריה נכון.
התראה: שימוש באזהרה בעת חיתוך אטריה, המבטיח שאין עורקים או ורידים נפצעים, כמו זה יכול להפחית את היעילות של שטיפה הדם הכלול האברים. - Perfuse את הלב עם 15-20 מ"ל של PBS קר באמצעות מזרק 60 מ ל מצויד עם מחט 21 G, PBS קר. בעדינות לתפוס את הבסיס של הלב עם מלקחיים והכנס את המחט לתוך החדר השמאלי ליד השיא. חזור על הפעולות של החדר הימני. זריקה נכונה גורמת לבן הריאות והכבד חיוור.
הערה: זלוף צריכה להתבצע בתוך 5 דקות לאחר המתת חסד כדי למנוע קרישת דם, אשר יכול לזהם את האיברים של עניין עם מחזורי תאים.
- חושפים הלב על ידי פילינג בחזרה את הצלעות, ואז לחתוך קודם אטריה שמאל ואחריו אטריה נכון.
-
להחזיק את הבסיס של הלב עם מלקחיים, בעדינות תמשוך את הלב ולאחר מכן לנתק את הלב על ידי חיתוך ועורק הריאה ראשי ואת הוורידים, העורקים השק סביב הלב.
- לנקות את הלב על-ידי בעדינות החזקת את הלב בין האגודל לבין האצבע במגבת נייר נקייה נטולת ומשוך את אטריה, שרידים של העורקים הראשיים, ורידים, כל מזהמים אחרים עם מלקחיים.
הערה: ודא מכלול של אטריה מוסר אין רקמות אחרות, כגון הריאות או כלי דם, קיימים כמו רקמות אלו יש תאים חיסוניים תושב משלהם. הריאה בפרט יש אוכלוסיה תאים חיסוניים גדולים זה יכול להסוות את אוכלוסיות קטנות יותר של אלה בתוך שריר הלב.
- לנקות את הלב על-ידי בעדינות החזקת את הלב בין האגודל לבין האצבע במגבת נייר נקייה נטולת ומשוך את אטריה, שרידים של העורקים הראשיים, ורידים, כל מזהמים אחרים עם מלקחיים.
-
מקום בלב בצלחת פלסטיק 5 ס מ עם µL 50 ל- PBS קר.
- מינצ הלב באמצעות מספריים ויבתר מעוקל עד אין כלים גלוי, יש עקביות חלקה.
הערה: לנסות לשמור על הלב באזור כלולות של המנה במהלך קוצץ כדי למזער את איבוד רקמות. - העברת רקמות thetrituratedheart באמצעות מלקחיים מעוקל לתוך צינור microcentrifuge 2 מ עם 800 µL קר Dulbecco של שינוי נשר בינוני (DMEM).
- מינצ הלב באמצעות מספריים ויבתר מעוקל עד אין כלים גלוי, יש עקביות חלקה.
-
להוסיף ofcollagenase U/mL 450 אני 60 U/mL של hyaluronidase סוג אני-S, 60 U/mL של DNase-את כל דגימה.
- דגירה בדגימות ב- 37 מעלות צלזיוס על מטרף נדנדה ב-50 סל ד למשך 45-60 דקות.
-
לאחר עיכול, בקצרה דוגמאות מערבולת (20 s) ומניחים מיד על קרח כדי לשמור דגימות על 4 מעלות צלזיוס.
- באמצעות pipettor של 1 מ"ל, פיפטה דגימות למעלה ולמטה עד דגימות רקמה הומוגנית, לא לסתום את הטיפ פיפטה.
הערה: הגדרת מספר מסוים של פעמים על פיפטה עשוי להגביר הפארמצבטית. אם הלבבות לא מתעכל בצורה אופטימלית, חתיכות של שריר הלב עלול להכשיל את פיפטה. טחינת בעדינות את הטיפ פיפטה נגד הצינור microcentrifuge יעזור homogenize גדול יותר חתיכות רקמה.
- באמצעות pipettor של 1 מ"ל, פיפטה דגימות למעלה ולמטה עד דגימות רקמה הומוגנית, לא לסתום את הטיפ פיפטה.
-
טרום רטוב מסננת תא 40 µm המוטלות על צינור חרוטי 50 מ עם 1 מ"ל של HBB קר.
- הוסף מדגם הומוגני את המסנן ' לשטוף דרך מאת לאט למזוג 12 – 14 מ ל HBB קר.
- העברת דגימות מסוננים צינור חרוטי שכותרתה 15 מ"ל ולשמור על 4 מעלות צלזיוס.
-
צנטריפוגה דגימות ב x 400 g למשך 5 דקות ב 4 º C. תשאף את תגובת שיקוע.
- Lyse כדוריות דם אדומות על-ידי הוספת 1 מ"ל אמוניום כלוריד-אשלגן (ACK) פירוק מאגר כל דגימה. Resuspend דגימות מאת vortexing, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
- לאחר פירוק השלימה, להוסיף 5-8 מ"ל מאוזנת מלח פתרון (HBSS של האנק קר) להפסיק המוליזה.
- צנטריפוגה דגימות-gfor 400 x דקות 5-4 מעלות צלזיוס. תשאף את תגובת שיקוע.
- להוסיף 1 מ"ל FACS מאגר כל דגימה של העברת צינור microcentrifuge mL 1.5 עם תוויות ברורות.
הערה: הפרוטוקול ניתן להשהות כאן עבור עד 2 שעות עם דגימות המאוחסנים ב 4 º C.
4. לזרום Cytometry מכתים וניתוח
-
צנטריפוגה דגימות ב x 400 g למשך 5 דקות ב 4 º C.
- להפחתת נוגדנים שאינם ספציפיים מחייב, לדלל מטריים anti-CD16/CD32, מונוציט חוסם הפריטים המוקפצים (1:20) חשבונאות (ראה טבלה של חומרים) עבור 50 FACS µL עבור דגימה. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
- להכין את הנהלת דילול (1:250 עבור כל נוגדן) נוגדנים עבור 50 µL של FACS לדגימה.
הערה: צבע הכדאיות יכולות להיכלל הנוגדן קוקטייל כדי לא לכלול תאים מתים. לחלופין, גודל קטן מהכלל על-ידי ניתוח תזרים יכול להיות משומש (איור 1C ו- D). - בלי כביסה, להוסיף 50 µL של מיקס מאסטר נוגדן אחד לטעום ולערבב.
- דגירה בדגימות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בחושך.
- להוסיף 600 µL FACS כל מדגם לשטוף את צנטריפוגה דגימות ב x 400 g למשך 5 דקות ב 4 º C.
- וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend צנפה ב- 300 µL FACS. לשמור דגימות ב 4 ° C בחושך.
הערה: צבעי הכדאיות מסוימים, כגון דאפי, לדרוש מכתים בתוך 10 דקות לפני הפעלת cytometry זרימה. - לנתח ידי cytometry זרימה (ראה דמויות 1 ו- 2) בתוך ה 3 הבא. אם זמן רב יותר הוא נדרש, קצר טווח קיבוע באמצעות paraformaldehyde של ריכוז נמוך (0.5-1% ב- PBS) מומלץ לשמר מכתים.
הערה: מומלץ לסנן דגימות דרך מסננת תא 40 µm לפני ניתוח cytometry זרימה אתחול כדי למנוע שיבוש פלואידיקה של cytometer הזרימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
נכון להיום, אין שיטה טובה תוכנן כדי לבודד תאים חיסוניים אחרים מרכיבי התא הלב, כגון cardiomyocytes. לפיכך, ניתוח של התליה תא בודד הלב מאת cytometry זרימה דורש מראש-gating עם CD45 כדי לזהות את אוכלוסיות תאים חיסוניים, ואחריו תא בודד, גודל קטן אי-הכללה של חסימה (איור 1א'). לחלופין, את הכדאיות צביעת ניתן לבצע כדי לא לכלול תאים מתים. אי-הכללה של גודל קטן, הכדאיות צבע צביעת מייצגים שתי שיטות כדי לא לכלול תאים מתים (איור 1ב' וד' 1). מומלץ מאוד להמשיך עם הנוגדן מכתים זמן קצר לאחר ההליך עיכול ולשמור תמיד התליה תא ב 4 ° C, כמו הכדאיות של התאים ייתכן ריקבון. הליך זה מניב בדרך כלל כ- 80-90% של תאים חיסוניים קיימא.
שריר הלב בתי מושבה מגוונות של תאים חיסוניים, רבים מהם הם עדיין ממתינים זיהוי ואפיון. מקרופאגים, זוהה CD64+ תאים, הם האוכלוסיה מחוסנת הגדולות של הלב, המייצג 60-70% של כל תאי המערכת החיסונית (איור 1C, למעלה). העיכול של הלב מאתר למבוגרים התשואות על 3-5 x 104 מקרופאגים, תלוי בגודל של הלב. מקרופאגים הלב יכול בהמשך יחולק בהתאם לביטוי של CD11c או CCR2 שלהם רמות של MHC-II2.
השני לב המערכת החיסונית subpopulation שאפיין היה טוב הם תאים דנדריטים קונבנציונלי. DCs קונבנציונליים הם CD64– תאים ביניים מפורשת כי רמות גבוהות של MHC-II, רמות גבוהות של CD11c (איור 1 C, התחתון). תאים אלה ניתן לחלק נוספת בהתאם לביטוי של8,או CD103 או CD11b9. DCs מייצגים הרבה יותר קטן הלב subpopulation בהשוואה מקרופאגים. העיכול של הלב מאתר למבוגרים התשואות בין 150 ל- 500 DCs של משנה.
זלוף של הלב עם PBS קר חיוני בשעת זיהוי אוכלוסיות תאים חיסוניים בתוך שריר הלב. עם זאת, זלוף לא מושלם עשוי להגדיל את הכמויות של מזהמים קרישה תוך-כלית הדגימות, שמוביל הטיה חשוב זה יכול להיות מבוסס על היקפי שינויים (דם) ולא לשינויים תסנין הלב. במקרים אלה, קרישה תוך-כלית מנהלה של נוגדנים אנטי-CD45 שאותה ניתן להתאים פלורסנט, מדבקות כל התאים החיסוניים המופצות באמצעות מאקרו - microvasculature (איור 2א), יכול לעזור להבדיל תאי שריר הלב מ קרישה תוך-כלית מזהמים. איור 2 B מראה דוגמה הלב מושלם perfused שבה 20% של תאים חיסוניים הם מזהמים קרישה תוך-כלית. חשוב, רמה זו של זיהום יש השפעה קטנה על מקרופאג וניתוח DC, מאז תאים אלה נמצאים לעתים נדירות בדם (איור 2D).
השימוש של cytometry זרימה של השעיה תא בודד של שריר הלב מאפשר חקר subpopulations קטן של הלב. לדוגמה, מחסור של הגורם שעתוק BATF3 הוכח כדי למנוע ההתפתחות של בוגרת CD103+ DCs רקמות מספר11. כדי ללמוד אם הדבר נכון גם במקרה של שריר הלב, תא בודד השעיות של תאי לב 8 – שבוע בת 15 BATF3 לקויה או הארנבונים מאותה שליטה (ברקע C57BL/6) נותחו באמצעות cytometry זרימה. עקב גודל האוכלוסייה קטן מספר סמנים צריך להבדיל בין תת-קבוצות DC, היסטולוגיה יכול לא סיפק מספיק חשמל עבור ניתוח להגיע תשובה סופית. עם זאת, באמצעות ניתוח cytometry זרימה כדי להשוות את התאים החיסוניים של שריר הלב של פראי-סוג לעומת Batf3- / - עכברים, חוסר CD103+ DCs אפשר לאמת את האחרון (איור 3A ו- B). בנוסף, הבחנו כי מחסור BATF3 לא משמעותי לשנות את ההרכב של אוכלוסיות הלב אחרים (איור 3C ו- D). תוצאות אלו להדגים את מידת הרגישות אשר יכולה להיות מושגת באמצעות שיטה משולבת זו של עיכול אנזימטי ועל מכניים להשגת השעיה תא בודד.
איור 1 : Gating אסטרטגיה עבור מקרופאגים לב ו- DCs- לבבות בודדים מ- C57BL/6 עכברים היו מתעכל כמתואר, תא בודד ההשעיה נותחה על ידי cytometry זרימה. (א) Gating של CD45 + תאי לב גופיה בשידור חי. כדי לזהות את התאים החיסוניים מ homogenate הלב תא בודד, אשר כוללת רמות גבוהות מאוד של תאים שאינם-החיסון (קרי, cardiomyocytes, תאי אנדותל ו fibroblasts) לצפות בקבצים יש להשתמש בתוכנת עריכה התומכת בפורמט CD45 תיוג. אל תכלול doublets על-ידי השוואת האס-H vs האס-A ואחריו FSC-H vs FSC-א הערה: כל השוואה אחרת בין האס-A, האס-H, האס-W או FSC-A, FSC-H ו- FSC-W שימושיים באופן דומה. מבחר של תאים חיים יכול להתבצע על ידי למעט תאים קטנים מאוד (שער vs FSC-H האס-H). (B) השוואה בין תא מת הדרה באמצעות גודל לעומת הכדאיות מכתים (דאפי). (ג) Gating אסטרטגיה עבור זיהוי של מקרופאגים לב (CD11b+ CD64+ תאים) ו- DCs (CD64– MHC-IIשלום CD11c+). מקרופאגים לב יכולים להיות עוד יותר מסווגים בהתבסס על הבעת רגשותיהם MHC-II ו- CD11c-DCs הלב יכול יחולק בהתאם לביטוי של CD103 או CD11b. מגרשים (D) נציג של דאפי + תאים מתים בתוך macrophage, DC תאים לאחר ניכוי גודל קטן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : תוויות של קרישה תוך-כלית תאים מזהמים. (א) השוואה של CD45 קרישה תוך-כלית labelling של דם נויטרופילים ומונוציטים Ly6Cשלום בנוגדן anti-CD45 מטופלים (אדום) או שאינם מטופלים עכברים (כחול). (B) זיהוי של מזהמים קרישה תוך-כלית בהכנה הלב על ידי תוויות CD45 קרישה תוך-כלית. זרימה נציג (C) חלקות של תאי שריר הלב ו קרישה תוך-כלית. (ד) נציג חלקות של תאים עם תוויות ברורות בתוך macrophage, DC תאים לאחר העירוי אנטי-CD45. שימו לב כי מקרופאגים ו- DCs בלעדית extravascular. קרישה תוך-כלית מזהמים הם בדרך כלל לימפוציטים ומונוציטים, נויטרופילים2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : כימות של מקרופאגים לב ו- DCs בעכברים לקויה BATF3. (א) זרימה נציג חלקות לב בקרי תחום Batf3+ + בעכברים- / - Batf3. (B) כימות של בקרי תחום לב Batf3+ + בעכברים- / - Batf3. שים לב להיעדר CD103+ DCs בעכברים- / - Batf3. (C ו- D) כימות של הלב מקרופאגים (MF) ב- Batf3+ + בעכברים- / - Batf3. קווי שגיאה מייצגים סמלים ב- SEM אדום לייצג חיות בודדות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
דלקת שריר הלב, או דלקת שריר הלב, היא תכונה של מחלות לב וכלי דם ביותר. עם זאת, שריר הלב אינו נטול משלו רכיבי מערכת החיסון במצבים שאינם מחלת. במהלך מצב יציב, תאים חיסוניים רבים שוכנים בשריר, לגלם את התפקידים החיוניים של תחזוקה והגנה. אפיון אלה אוכלוסיות מגוונות של תאים לא היה אפשרי ללא שיטות כמו האחד הוצג פרוטוקול זה.
שילוב של עיכול מכני, אנזימטי של שריר הלב מאפשרת את ניתוקה של השעיה תא בודד יכול לשמש בשילוב עם שיטות אחרות של ניתוח, כגון לזרום cytometry או immunomagnetic חרוז בידוד. מספר שיקולים בנוגע לשיטת נוכח חייב להילקח בחשבון. ראשית, כל הבדיקות שלנו מתייחסים האוכלוסיות בתוך שריר הלב; אנו מסירים את אטריה מניתוח שלנו כמו אלו רקמות מיוחדות עם שגעונות משלה. שנית, הכמויות של אנזימים בשימוש מבוטא פעילות יחידות כדי לסייע בקביעת של digestions באמצעות אנזימים ממקורות אחרים. עם זאת, אמפירי אופטימיזציה של הריכוז הסופי של אנזימים ואת הזמן של מערכת העיכול היא מאד מומלצת, כמו הגבלת האנזים להפחית באופן משמעותי את התשואה תא מדי לעיכול באופן דרסטי יכול להשפיע על יכולת הקיום. שלישית, שלב אופציונלי מעורבים קרישה תוך-כלית מינהל נוגדנים שכותרתה מומלצת במיוחד כשלמדתי אוכלוסיות נדיר שריר הלב רגיל (כמו לימפוציטים, ומונוציטים או נויטרופילים)2 או בנסיבות כאשר מספרים של אוכלוסיות בדם עשוי להשתנות (monocytosis, granulocytosis או ריבוי לימפוציטים) אשר עשוי לתת רושם מוטעה של שינויים בתוך שריר הלב זה צריך לאשר שימוש בשיטה זו או, לחלופין, מיקרוסקופ. עם זאת, השלב זה של השירות מוגבל בעת ניתוח מקרופאגים או DCs בוגר, כמו תאים אלה נמצאים לעתים רחוקות בכמויות משמעותיות בדם (איור 2D). זה חשוב למטב את כמות נוגדנים מנוהל ולאפשר זמן הדגירה לפני להקריב את העכבר, כמו לטווח ארוך הדגירה יכולה קצת דיפוזיה נוגדן לתוך הלב, במיוחד שריר הלב מודלק. לבסוף, חשוב מאוד להיות מוקפד בבידוד של הלב, סילוק שאריות של העורקים הראשיים, ורידים, או כל רקמות אחרות, כגון הריאות. רקמות אלה מזהם יש מאוד מספרים גבוהות של תאים חיסוניים כי יכול בקלות להסתיר את אוכלוסיית ילידים שריר הלב.
זה חשוב מאוד לבצע אי-הכללה של תאים מתים, אם באמצעות צבעי הכדאיות או דרך החרגה גודל קטן במהלך ניתוח cytometry זרימה, מערכת העיכול (או נזק לרקמות במודלים של המחלה) יכול לגרום כמות יחסית גדולה של תאים מתים. אנחנו משווים את היעילות של תאים מתים הדרה על ידי גודל באמצעות תווית הכדאיות (איור 1B ו- D), הוכחת שקילות ליד שלהם. חשוב, גודל הדרה לא יכול לשמש לאחר קיבוע permeabilization הליך זה מפחית באופן משמעותי את גודל התא.
למרות autofluorescence היא לעתים רחוקות בעיה לזהות מקרופאגים הלב באמצעות cytometry זרימה, זה מייצג בעיה חשוב יותר כאשר מנסים לאפיין את הביטוי של כמה סמנים, במיוחד עם fluorochromes נרגש (אנרגיה גבוהה ) אור באורכי גל קצרים יותר (350-500 ננומטר). בניסויים אלה, מומלץ להשתמש בפקדי isotype, להימנע לייזרים כחול וסגול (fluorescein isothiocyanate, phycoerythrin, השקט כחול/מבריק ויולט 421) ולהשתמש fluorochromes עם פליטת מעל 600 nm, כגון allophycocyanin.
השימוש של פרוטוקולים האחד שהוצגו במסמך זה הם הופכים חשובים יותר כמו כמות הולכת וגדלה של הספרות היא לזהות את התפקיד של עוצמת וסוג דלקת הערכת ואפיון התוצאה של מחלות לב וכלי דם. שיטה זו מאפשרת רמות גבוהות יותר של איפיון תאים מאשר היסטולוגיה. למשל, השימוש עקיבה שושלת היוחסין מותרת לצורך זיהוי קבוצות משנה שונים ontogenically של מקרופאגים עם פונקציות שונות מתוכנת שלהם2. באופן דומה, שיטה זו שניתן להשתמש ללמוד תא T תגובות בעת דלקת שריר הלב ו בשילוב עם גירוי שמחוץ ללמוד תא T קיטוב8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי קנדי מוסדות של בריאות המחקר (148808 ו- 148792), SE נתמכה על ידי הלב ושבץ קרן, פרס אנשי משרד מחוזי אונטריו, המשפחה, טד רוג'רס מרכז הלב ומחקר של מונק פיטר מרכז הלב. XCC מחזיקה מלגת בנטינג CIHR. LA מחזיקה של הלב & קו/ריצ'רד Lewar Studentship פרס.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | Wisent | 311-010-CL | 1x PBS |
| 21 G x 1 1/2 (0.8 mm x 40 mm) PrecisionGlide Needle | BD | 305167 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Wisent | 311-511-CL | 1x HBSS |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503-50G | |
| Bovine serum | Sigma | B9433 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid | BioShop | EDT111 | |
| Vacuum filter , 0.2 µm Filtropur V50 | Sarstedt | 83.1823.001 | |
| 28 G 1/2 1 cc insulin syringe | BD | 329424 | |
| 60 mL syringe | BD | 309653 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Wisent | 319-005-CL | 1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | from Clostridium histolyticum |
| Hyaluronidase type I-S | Sigma | H3506 | |
| DNase-I | Sigma | D4513 | from bovine pancreas |
| Cell strainer, 40 µm Nylon | Falcon | 352340 | |
| Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer | Lonza | 10-546E | |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b | Biolegend | 101222 | 1:250 dilution |
| APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c | Biolegend | 128025 | 1:250 dilution |
| APC anti-mouse CD103 | Biolegend | 121414 | 1:250 dilution |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c | Biolegend | 117334 | 1:250 dilution |
| PE anti-mouse Ly-6G | Biolegend | 127607 | 1:250 dilution |
| Pacific Blue anti-mouse I-Ab | Biolegend | 116422 | 1:250 dilution |
| FITC anti-mouse CD64 (FcgRI) | Biolegend | 139315 | 1:250 dilution |
| PE/Cy7 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103113 | 1:250 dilution |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103132 | 1:40 dilution |
| TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| True-Stain Monocyte Blocker | Biolegend | 426101 | 1:20 dilution |
| FlowJo V10 | TreeStar Inc | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
| Mouse: Batf3-/- | The Jackson Laboratory | JAX: 013755 |
References
- Marboe, C. C., Fenoglio, J. J. Pathology and natural history of human myocarditis. Pathology and Immunopathology Research. 7 (4), 226-239 (1988).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Pinto, A. R., et al. An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile. PLoS One. 7 (5), 36814 (2012).
- Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).
- Fujiu, K., Wang, J., Nagai, R. Cardioprotective function of cardiac macrophages. Cardiovascular Research. 102 (2), 232-239 (2014).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).
- Clemente-Casares, X., et al. A CD103(+) Conventional Dendritic Cell Surveillance System Prevents Development of Overt Heart Failure during Subclinical Viral Myocarditis. Immunity. 47 (5), 974-989 (2017).
- Van der Borght, K., et al. Myocardial Infarction Primes Autoreactive T Cells through Activation of Dendritic Cells. Cell Reports. 18 (12), 3005-3017 (2017).
- Galkina, E., et al. Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung. Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3473-3483 (2005).
- Edelson, B. T., et al. Peripheral CD103+ dendritic cells form a unified subset developmentally related to CD8alpha+ conventional dendritic cells. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 823-836 (2010).
