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Developmental Biology

티 미 딘 아날로그 듀와 선 충 C. 생식에 세포 주기 분석

Published: October 22, 2018 doi: 10.3791/58339
Automatic Translation
1,2, 2, 1, 2
1Department of Developmental Biology, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri, 2Department of Genetics, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri

Summary

이미징 기반 메서드를 설명 하는 S 단계를 식별 하 고 사용 하는 티 미 딘 C. 선 충 자웅 동체 생식 세포 주기 역학을 분석 하는 데 사용할 수 있는 아날로그 듀. 이 메서드와 필요 없는 transgenes immunofluorescent 얼룩과 호환 됩니다.

Abstract

진핵생물의 세포 주기 분석 염색체 형태, 식 및 세포 주기의 다양 한 단계 또는 nucleoside 아날로그의 설립에 필요한 유전자 제품의 지역화에 자주 활용 합니다. S 단계, DNA polymerases 분석에 대 한 셀을 표시 하는 염색체 DNA에 듀 등 BrdU 티 미 딘 아날로그를 통합 합니다. C. 선 충는 nucleoside 아날로그 듀 일반 문화 중 벌레는 먹이 및 immunofluorescent 기술을와 호환 됩니다. C. 선 충 의 생식은 신호 경로, 줄기 세포, 감수 분열, 세포 주기 때문에 투명 하 고, 유전으로 손쉬운 meiotic 의향 및 세포 분화/gametogenesis 발생의 연구에 대 한 강력한 모델 시스템을 선형 어셈블리 같은 패션. 이러한 기능에 듀 mitotically 자전거 세포 및 생식 개발의 동적 측면을 연구 하는 훌륭한 도구를 확인 합니다. 이 프로토콜 성공적으로 듀 박테리아를 준비, 야생-타입에 피드 하는 방법에 설명 합니다 선 충 C. 광고에 나온 것, 자웅 동체 생식 해 부, DNA에 듀 설립 얼룩 얼룩 다양 한 세포 주기를 검출 하기 위하여 항 체와 고 발달 마커, 생식을 이미지 하 고 결과 분석. 프로토콜은 메서드 및 S 단계 인덱스, M-인덱스, g 2 기간, 세포 주기 기간, meiotic 항목의 위상과 meiotic 의향 진행의 속도의 측정에 대 한 분석에 있는 변이 설명합니다. 이 방법은 세포 주기 또는 다른 조직, 단계, 유전적 배경, 생리 적 조건에 셀 역사 연구에 적응 될 수 있다.

Introduction

동물 개발에 수백, 수천, 수백만, 수십억, 또는 심지어 수조 세포 분열의 성인 유기 체를 형성 하기 위하여 필요 합니다. 세포 주기 G1 세포 이벤트 집합 구성 (gap), S (합성), G2 (gap), M (유사 분열) 정의 일련의 이벤트 실행 각 세포 분열. 세포 주기는 역동적이 고 실시간으로 기술적으로 어려울 수 있는 최고의 평가입니다. 이 프로토콜에 기술 단계 측정 및 스틸 이미지에서 세포 주기의 타이밍을 만드는 수 있습니다.

꼬마 선 충 (C. 선 충) 성인에서 세포 주기 역학의 연구에 S 단계를 식별 하는 금 본 위 제는 nucleoside 아날로그 deoxyuridine (듀)-5-ethynyl-2' 등 deoxyuridine (BrdU)-5-브로 모-2'로 자웅 동체 생식1,2,3,,45. 로 그들은 어떤 유전자 구조에 의존 하지 않는 거의 모든 유전적 배경에 듀와 BrdU 사용할 수 있습니다. BrdU 시각화 안티 BrdU 항 체 얼룩이 지기은 종종 다른 세포 마커 추가 항 체와 공동 얼룩에 의해 시각의 평가와 호환에 대 한 항 원 노출에 가혹한 화학 치료를 필요 합니다. 대조적으로, 듀 시각화 클릭 화학 가벼운 조건에 의해 발생 하 고 따라서 공동6,7을 얼룩이 지는 항 체와 호환 됩니다.

라벨의 특이성은 분명, 이후 핵만 포함 티 미 딘 (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) 유사 체 DNA로 S 단계. 시각화는 고정된 조직에서 일어난다. 듀 라벨 보이지 않으면 저절로 아 지 드를 포함 하는 염료까지 또는 fluorophore 클릭 구리 촉매 화학8듀에 alkyne covalently 반응. 듀 라벨에 핵은 S-위상, 라벨의 짧은 펄스를 사용 하 여 즉각적인 정보를 제공할 수 있습니다. 듀도 정보를 제공할 수 동적, 펄스-체이스 또는 연속 라벨;를 사용 하 여 예를 들어 펄스-체이스 실험 레이블이 각 세포 분열에서 희석 또는 개발을 통해 서 nondividing 세포 진행을 전파.

C. 선 충 자웅 동체 생식 통로, 줄기 세포, 감수 분열, 세포 주기 신호의 연구에 대 한 강력한 모델 시스템입니다. 성인 생식 줄기 세포 항목 및 meiotic 의향, 더 proximally gametogenesis 단계 조정 (그림 1)를 통해 진행 하는 원심 끝에 편광된 조립 라인입니다. 근 위 끝에 oocytes 성숙, ovulated는 수정 고 자 궁9,,1011에 embryogenesis 시작. Meiotic 의향에 mitotically 자전거 생식 줄기, 뿌리 세포와 meiotic S 단계 세포 하지만 되지 셀을 포함 하는 원심 끝 셀 근처 ~ 20 셀-직경 긴 지역 이라고 조상 영역2,4 , 9 , 12. 세포 막 원심 생식에서 핵 사이 불완전 한 분리를 제공 하지만 조상 영역 셀 mitotic 세포 주로 독립적으로 자전거를 받 다. 젊은 성인 광고에 나온 것에 생식 조상 영역 셀의 메디아 mitotic 세포 주기 기간은 ~6.5 h; G 1 단계는 간단한 결 석, 또는 정지1,,213관찰 하지는. 생식 줄기 세포 분화 본질적으로 직접 차별화를 통해 발생 하 고 따라서 부족 교통 증폭 사단4. Pachytene 단계에서 차별화, 동안 약 4 5 점 만점 핵 oocytes를 형성 하지 않습니다 하지만 대신 apoptosis, 세포질 내용을 개발 oocyte12,14 에 기부 하 여 간호사 셀 역할을 받 다 , 15.

Nucleoside 아날로그와 S 단계에서 레이블 셀, 뿐만 아니라 하나의 유사 분열, 감수 분열이 항 체는 얼룩이 지를 사용 하 여 셀을 식별할 수 있습니다. 유사 분열에서 핵은 안티-인-히스톤 H3를 immunoreactive (Ser10) 항 체 (pH3 라고)7,16. 감수 분열에서 핵은 안티-그-3 항 체 (meiotic 염색체 축 단백질)17에 immunoreactive. 조상 영역에서 핵 그-3, nucleoplasmic REC-818의 존재 나 WAPL-119의 존재에 의해 확인할 수 있습니다. WAPL-1 강도 이며 조상 영역에서 높은 체세포 생식에 높은 낮은 초기 meiotic prophases19동안. 여러 가지 세포 주기 측정 프로토콜에 몇 가지 변형 가능 하다: 나) S 단계에서 핵을 식별 하 고 측정 하는 S 단계 인덱스; II) M 단계에서 핵을 식별 하 고 측정 M 단계 인덱스; III) 핵 mitotic 또는 meiotic S 단계;에 있던 여부를 결정합니다 4) g 2;의 기간을 측정 V) 측정 g 2 + M + G1 단계; duartion VI) meiotic 항목;의 속도 측정 VII) meiotic 진행의 속도 추정 합니다.

하나는 몇 가지 유형의 젖은 실험실 실험에서 여러 세포 주기 측정을 만들 수 있습니다. 프로토콜 아래 듀 박테리아와 공동 레이블 M 단계 셀 이라고 표시 된 안티-pH3 항 체와 조상 영역 셀 안티-WAPL-1 항 체와 얼룩에 의해 얼룩이와 선 충 C. 성인 광고에 나온 것을 먹이로 라벨 30 분 펄스에 설명 합니다. 듀 피드 (2.5 단계), 항 체의 종류 기간에 유일한 변화 고용 (5 단계), 그리고 분석 (단계 8.3) 추가 측정을 위해 필요 합니다.

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Protocol

1입니다. 듀 라는 박테리아의 준비

  1. MG1693의 시 동기 문화를 성장. 대장균 (대장균) MG1693 thyA에 돌연변이 수행합니다.
    1. 조는 120mm lysogeny 국물 (파운드) 한 천 배양 접시에 냉동된 글리세롤 재고에서 흔 대장균 MG1693 개 37 ° C 하룻밤에 문화입니다.
    2. 두 개의 개별 대장균 에서 접종 2로 MG1693 식민지 중복 ~ 16 h에 대 한 37 ° C에 액체 파운드 문화의 4 mL 튜브.
      참고: MG1693 파운드에 좋은 티 미 딘 thymine와 보충 없이 성장 합니다.
  2. 대장균 MG1693 듀 보충 최소 매체에 성장.
    1. 500 mL 원뿔 플라스 크 압력솥입니다.
    2. 무 균 기술을 사용 하 여 추가 20% 포도 당의 5 mL, 10 mg/mL의 티 아민, 티 미 딘 5 m m의 120 μ, 1 M MgSO4, 10 mM 듀, M9 버퍼의 100 mL 및 문화의 갓 재배 하룻밤 MG1693 4 mL 200 μ의 100 μ의 50 μ.
      참고: 듀의 최종 농도 20 μ M이 문화1,7. 이 농도 문화20에 포유류 세포에 직접 적용 하는 경우 DNA 손상 및 세포 주기 검거에 지도 한다. 그러나,이 듀의 일부 분 일 뿐인 따라서 C. 선 충수와 대장균 에 통합 됩니다. 젊은 성인 광고에 나온 것의 듀 치료 후 세포 주기 검거의 증거와 조상 영역 또는 M-단계 인덱스의 크기에서 변화입니다.
    3. 하룻밤 사이, 하지만 200 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 24 시간 보다 더 이상 문화.
  3. 듀 라는 대장균 을 집중 하 고 M9 한 천 배양 접시에 적용.
    1. 4 ° c 탁상 원심 분리기를 미리 냉각
    2. 메 마른 기술을 사용 하 여 2-4 살 균 50 mL 원뿔 튜브로 문화를 전송.
    3. 듀 라는 대장균작은 30 분 4 ° C에서 3000 x g 에서 문화 원심
      참고: 로컬 및 기관 지침에 따라 상쾌한 듀를 포함 하는 삭제 합니다.
    4. 신선한 M9 4 mL와 펠 릿 resuspend 사용 하 여 살 균 1 mL 피펫으로 팁 또는 살 균 5 mL 혈 청 학적인 피펫으로. Resuspending 알 약 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다.
    5. 동일한 피펫으로 적용 및 확산 resuspended 듀 표시 된 대장균 의 ~ 8 방울을 사용 하 여 실내 온도 60 mm M9 한 천 배양 접시의 센터 MG1693. 하나의 일괄 처리 ~ 16 요리를 생성합니다.
    6. 몇 시간 동안 건조 또는 실 온에서 하룻밤 후 인감 실험실 필름 스트립 각 접시 요리를 하실 수 있습니다. 와 ~ 2 개월에 4 ° C에서 15 ° C ~ 2 주 동안에 요리를 저장할 수 있습니다. 듀 요리의 동일한 일괄 처리를 사용 하 여 실험의 각 세트에 대 한.

2. C. 선 충 에 듀 먹이

  1. 콜레스테롤, S 매체에 해칭 또는21의 적절 한 단계 선택 하 여 다음 초과 달걀 누워, 알칼리 성 차 아 염소 산 처리에 의해 인구를 동기화 합니다. 원하는 단계 (여기, 24 h 포스트-L4) 20 ° c.에 대장균 OP50와 시드 선 충 류 성장 매체에 동물 성장
    참고: 준비 실험 당 50-100 동물 일부, 해 부 하지 않을 수 있습니다 그리고 다른 사람 세척 하 고 전송 과정에서 손실 됩니다.
  2. 20 ° C (또는 실험에 필요한 온도) 따뜻한 듀 요리를 하실 수 있습니다.
  3. 1.5 mL 튜브에 M9 또는 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)를 사용 하 여 NGM 요리에서 동물을 씻어. 중력 또는 간단한 스핀은 microcentrifuge에 의해 짧게 정착을 동물 허용.
  4. 상쾌한을 제거 하 고 세척 시간 1-2와 M9 또는 PBS의 ~ 1 mL 동물. 제거는 상쾌한.
  5. 유리 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 전송 듀 잔디밭의 센터에 M9 또는 PBS의 작은 방울에 동물. 액체를 흡수, 그때 (역사 S 위상의 측정)를 20 ° C (직접 S 위상 측정)에 대 일 분 이상에서 품 어에 대 일 분, 필요에 따라.
    참고: 듀 신호는1수 유 듀의 15 분 만큼 적게 후 생식 핵에서 감지.
  6. 요리를 해 부하는 유리에 M9 또는 PBS의 ~ 2 mL와 듀 접시에 벌레 씻어.

3. 해 부 및 선 충 C. 생식의 고정

주: 해 부, 고정, 및 C. 선 충 자웅 동체 생식의 얼룩이 지는 항 체에 대 한이 프로토콜 사용 하는 제외 하 고는 속도 1 mL 유리 튜브를 centrifuged 수 (2016)22, 댁과 Arur에 의해 출판 세척 단계 및 그려진 아웃 유리 파스퇴르 피 펫 1 mL 유리 튜브에서 액체를 효과적으로 제거를 사용할 수 있습니다.

  1. 워시와 C. 선 충 germlines 해 부.
    1. 해 접시, 센터에서 동물을 수집 하는 소용돌이의 바닥에 침전 하는 동물을 허용 하 고 긴 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 PBS를 제거. 1-2 시간 ~ 2 mL PBS로 세척.
    2. PBS의 2 mL와 4 μ 동물 무력화를 100 mM levamisole의 추가 합니다. 접시를 접시의 중앙에 동물을 수집를 다시 소용돌이 친다.
      참고: 동원 정지 사이 몇 초, 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다. 완전 한 동원 정지 성공 해 부에 대 한 필요 하지 않습니다. 어떤 사람들은 더 나은 성공을 때 동물을 움직일 불완전 해 부.
    3. (약 2 인 두 전구) 사이 절단 하 여 25G 5/8"바늘의 한 쌍으로 동물을 해 부 또는 꼬리. 알아서 하지는 생식의 루프를 잘라. 장과 생식 "밖으로" 내부 압력, 신체 구멍의 팝업 해야 하지만 연결 된 남아 있다. 이 프로토콜은 이전에 게시 댁 및 Arur 비슷합니다 (2016)22.
      참고:-~ 5 분 해 부 시간 유지, 확실히 더 이상 15 분 이상 해 부 시간 항 체 얼룩 신호 (Sudhir 월, 개인 통신)의 손실이 발생할 수 없습니다 하 고 PBS에 기아 동물의 생리학에 영향을 미칠 수 없습니다. 신속 하 고 정확 하 게 해 부를 학습 하는 것은 연습이 걸릴 수 있습니다.
    4. 필요한 경우, 소용돌이, 센터에서 해 부 동물을 수집 하 고 긴 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 가능한 많은 PBS를 제거.
  2. 수정 하 고 조직을 탈수합니다
    1. PBS 솔루션에서 3 %paraformaldehyde (PFA)의 2 개 mL를 추가 합니다. 실험 영화와 저장소 또는 10 분 서랍 벤치에 느슨하게 접시 커버.
      참고: 해 동 37 ° C에서 PFA 솔루션 목욕 물 및 다음 germlines를 해 부 하기 전에 실내 온도에 냉각.
      주의: PFA 솔루션은 알맞게 독성 발암 가능성이 있고 기형 발생 물질. Paraformaldehyde 솔루션에서 방출 증기는 가연성. 니트 릴 장갑 착용. 화학 증기 두건에서 3%에서 16 %PFA 희석. 증기 두건 밖에 서 작업 하는 경우 모든 컨테이너 덮여 유지.
    2. 깨끗 한 5 mL 유리 원심 분리기 튜브에는 생식 기를 신중 하 게 전송.
    3. PBSTw ~ 3 mL를 추가 (0.1 %PBS 트윈-20) 나머지 생식 선 검색 고 PFA 솔루션을 희석 하는 생식 기를 포함 하는 접시.
    4. ~ 1 분 젊은 대 870 x g 에서 임상 분리기에 아래로 회전 또는 작은 동물 이전 또는 큰 동물 보다 더 긴 회전 시간을 필요합니다.
    5. 긴 유리 피 펫을 사용 하 여, 화학 후드에 원치 않는 소재 병에서 최종 폐기에 대 한 원치 않는 소재 비 커는 상쾌한 전송.
    6. -20 ° c.에 미리 냉장 고급 메탄올의 2 개 mL를 추가 원심 분리기 튜브 실험실 영화와 긴밀 하 게 커버.
      참고: 신선한 고급 "골드 라벨" 메탄올의 사용은 특정 항 체와 적절 한 형태에 대 한 필수적입니다.
      주의: 메탄올 가연성 액체 이며 독성 증기, 삼 킨 경우, 흡입 또는 피부에 연결할 수 있습니다. 장갑 및 적절 한 개인 보호 장비를 착용 하십시오. 냉장고가 작은 볼륨에 대 한 적절 한 사용 합니다.
    7. -20 ° C 1 시간, 심지어 하룻밤 냉장고에서 저장소 또는 심지어 몇 개월.
      참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.

4. rehydrate Germlines

  1. 메탄올을 희석 하는 생식 기를 rehydrate PBSTw로 가기로 유리 원심 분리기 튜브를 채우십시오. ~ 1 분 동안 870 x g 에서 임상 원심 분리기에 아래로 회전 합니다.
  2. Using 긴 유리 파스퇴르 피 펫, 화학 후드에 원치 않는 소재 병에서 최종 폐기에 대 한 원치 않는 소재 비 커는 상쾌한 전송.
  3. 3 번 ~ 5 mL ~ 1 분 동안 870 x g 에서 임상 원심 분리기에서 각 시간 아래로 회전 하는 PBSTw 사용 하 여 생식 기를 씻어. 제거는 상쾌한.
  4. 작은 1 mL 붕 규 산 유리 관 및 긴 유리 PBSTw와 파스퇴르 피펫으로 린스.
  5. PBSTw의 ~ 700 μ를 추가 하 고 긴 유리 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 작은 튜브에는 생식 기를 전송. PBSTw의 몇 가지 추가 상품을 사용 하 여 모든 생식 선 전송 됩니다 확인.
  6. ~ 1 분 그려진 아웃 긴 유리 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여에 대 한 870 x g 에서 임상 원심 분리기에 스핀 다운,는 생식 기를 방해 하지 않고 최대한 많은 액체를 제거. 더 이상 50 μ를 남겨 주세요.
    참고: 항 체 검출, 필요 하지 않은 경우 단계 6으로 건너뜁니다.

5. 항 체와 항 원 검출

  1. PBS에서 30% 세럼에 주 항 체 희석. 현재 예제에서는 안티-WAPL-1 항 체 희석된 1:2,000 이며 안티-pH3 항 체는 희석된 1: 500. 갓 해 동된 혈 청에는 미 립 자 제거 하 4 ° C에서 20000 x g microfuge에서 10 분 원심 4 ° C에 며칠 동안 저장 될 수 있는 상쾌한을 사용 합니다. 적절 한 혈 청을 사용 하 여 일치 하는 2 차 항 체 (혈 청 염소는 여기)의 호스트 유기 체. 단계를 차단 하는 선택적 기본 항 체의 추가 하기 전에 추가할 수 있습니다.
  2. 각 작은 유리 튜브에 희석된 주 항 체의 100 μ를 적용 됩니다. 4 h에 대 한 실 온에서 품 어.
    참고: 항 체에 의해 부 화 시간은 다릅니다. 일부 항 체에 대 한 실 온에서 2 h은 충분 합니다. 더 이상 외피 (예., 하룻밤) 가능 하지만 배경 증가 시킬 수 있습니다.
  3. PBSTw 위로 아래로 ~ 1 분 동안 870 x g 에서 임상 원심 분리기에서 회전 하는 튜브를 입력 합니다.
  4. 3 번 사용 하 여 PBSTw 품 ~ 1 mL 세척 당 ~ 5 분에 대 한 세척으로 확산 초과 1 차 항 체는 생식 기를 씻어. 그려진 아웃을 사용 하 여 긴 유리 파스퇴르 피 펫는 생식 기를 방해 하지 않고 최대한 많은 액체를 제거 합니다. 더 이상 50 μ를 남겨 주세요.
  5. PBS에서 30% 염소 혈 청에서 2 차 항 체 희석. 현재 예제에서는 염소-안티-토끼-594와 염소-안티-마우스-647는 각각 희석 1:400에서.
    참고: 보조 항 체 염료는 염료에 듀 키트에서 다는 것을 확인 하는 신중 하 게 선택 합니다. 현재 예제에 듀 키트 포함 488 nm 여기 염료.
  6. 각 작은 유리 튜브에 희석된 이차 항 체의 100 μ를 적용 됩니다. 실내 온도 2 h에 어둠 속에서 품 어.
    참고: 항 체에 의해 부 화 시간은 다릅니다. 일부 2 차 항 체에 대 한 실 온에서 1 h은 충분 합니다. 더 이상 외피 (예., 하룻밤) 가능 하지만 배경 증가 시킬 수 있습니다.
  7. 3 번 사용 하 여 PBSTw 품 ~ 1 mL 세척 당 ~ 5 분에 대 한 세척으로 확산 초과 이차 항 체는 생식 기를 씻어. 그려진 아웃을 사용 하 여 긴 유리 파스퇴르 피 펫는 생식 기를 방해 하지 않고 최대한 많은 액체를 제거 합니다. 더 이상 50 μ를 남겨 주세요.
    참고: 생식 선 저장할 수 있습니다 PBS의 100 μ에이 단계 이후에 필요한 경우, 비록이 신호를 줄일 수 있습니다. 진행 하기 전에 PBS를 제거 합니다.

6. 수행 감지 듀에 듀 클릭 반응

참고: 수행에 듀 (수행 전에 5 단계 6 단계) 단계를 얼룩이 지는 항 체 전에 클릭 반응 항 체 사용7에 따라 가능 하다. 그러나, 클릭 시 약 특정 항 원을 방해할 수 있습니다 (예., REC-8 항 체는 고정와 permeabilization). 여기에 제시 된 순서 대로 REC-8, 얼룩 밝은 항 체 생성 WAPL-1, 그 3, pH3, 깃발, 및 CYE-1 항 체 사용, 다른 사람의 사이에서.

  1. 깨끗 한 1.5 mL 튜브에 다음을 추가 하 여 클릭 듀 칵테일8 신선한를 준비 합니다. 추가의 순서는 중요 하다. 빛에서 보호 하 고 유지 하는 얼음에 모든 시 약. 이 제조 법 생성 충분 한 샘플 (100 μ); 필요에 따라 제조 법을 곱하면 됩니다.
    1. 누적 버퍼를 초순의 2 개 mL를 추가 합니다. 이것은 버퍼 첨가제, 1 x 희석 해야 합니다 x 10을 즉시 사용 하기 전에 합니다.
    2. 초순의 76.5 μ에 10 x 버퍼의 8.5 μ를 추가 합니다. 잘 믹스.
    3. 100mm CuSO4 (부품 E로 분류 될 수 있습니다)의 4 μ를 추가 합니다. 잘 믹스.
    4. 488 nm 염료 아 지 드의 0.25 μ를 추가 합니다. 그것은 4 ° c.에서 고체의 용 매, 디 메 틸 sulfoxide로 실내 온도에, 해빙 해야 합니다. 잘 혼합 하 고 빛 으로부터 보호.
    5. 초순의 믹스 9 μ와 버퍼 튜브의 캡에 첨가제의 1 μ 피펫으로 나머지 칵테일에 추가 하 여 아래로 pipetting으로 잘 혼합 모자에서.
  2. 에 듀 클릭 반응을 수행 합니다.
    1. 작은 튜브에 생식 기를 클릭 듀 칵테일의 ~ 100 μ를 추가 합니다. 실험 영화와 함께 커버 하 고 실 온에서 30-60 분 동안 품 어.
    2. 한 번 씻어 반응 린스 버퍼의 100 μ.
    3. 4 번 사용 하 여 PBSTw 품 ~ 1 mL 당 세척 ~ 15 분 초과 듀 칵테일 구성 요소 세척으로 확산 하는 생식 기를 씻어. 그려진 아웃을 사용 하 여 긴 유리 파스퇴르 피 펫는 생식 기를 방해 하지 않고 최대한 많은 액체를 제거 합니다. 더 이상 50 μ를 남겨 주세요.

7. DNA 얼룩 및 슬라이드 준비

  1. 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, DNA를 시각화 하는 데 사용)와 antifade 장착 매체의 1 방울 (~ 25 μ)는 생식 기를 추가 합니다. 정착 하는 생식 기 혼합 수 있습니다 몇 분 정도 기다립니다.
    참고: 또는, 1:1,000 희석 (0.1 mg/mL 재고)에서 PBS에 DAPI 적용할 수 있습니다 20 μ 1, 4-diazabicyclo [2.2.2] 옥 탄 (DABCO) 90% 글리세롤, 또는 다른 antifade 장착 매체의 다음 5 분 동안.
  2. 큰 2.5 %agarose 패드 표준 유리 현미경 활 주에 준비 합니다.
  3. 새로운 깨끗 한 먼지-무료 사용 긴 유리 agarose 패드는 생식 선 전송 파스퇴르 피 펫. 모든 액체와 생식 기 생식 기의 손실을 최소화 하기 위해 피 펫의 좁은 바닥에서 계속.
    참고: 생식 선 작은 유리 튜브에 붙어 또는 긴 유리에 파스퇴르 피 펫 구출 될 수 있다"" PBSTw와 rinsing, 해 접시에 액체를 수집 하 고 속눈썹과 슬라이드에 개별 동물 따기 여.
  4. 속눈썹을 사용 (또는 얇은 머리의 루프) agarose 패드는 생식 기를 배포 하 고 먼지 입자를 제거 하는 이쑤시개에 붙어.
  5. 직사각형 유리 coverslip을 적용 됩니다. 공기 방울을 피하기 위해 한쪽에서 천천히 낮은. 티슈를 사용 하 여 자유롭게 이동에서 방지는 coverslip 초과 솔루션을 제거 하려면.
    참고: 사용 될 것 이다 현미경에 일치 하는 coverslips를 선택 합니다. # 1과 #1.5 coverslips 잘 작동합니다.
  6. 정착 하 고 실내 온도 또는 4 ° C에서 약간 하룻밤 건조 슬라이드를 허용 이 생식 기를 약간 평평 하 게 도움이 됩니다. 4 ° c.에 슬라이드를 저장 한다
  7. 선택 사항: 매니큐어, 또는 다른 슬라이드 마감재와 슬라이드의 가장자리를 밀봉 하십시오. 씰링 모서리를 먼저, 다음 측면, 이동에서 coverslip을 방지 합니다.

8. confocal 영상 및 분석

  1. 이미지 회전 디스크 공초점 형광 현미경 원심 생식 높은 에너지 광원, 계획 apochromatic 목표 및 고효율 현미경 카메라를 갖추고 있습니다. 1 μ m 또는 엄격한 간격 z 스택 이미지를 캡처하십시오. 모든 채널에 대 한 레이저 전원, 감도 및 노출 시간을 기록해 둡니다.
    1. 다음을 사용 하 여: 405 nm 레이저 라인 485 nm (W60) 방출 필터 DAPI에 대 한, 여기 488 nm 레이저 라인 여기 527 nm (W55) 방출 필터와 듀, WAPL-1, 615 nm (W70) 방출 필터와 640 nm 레이저 라인 excita 561 nm 레이저 라인 여기에 대 한 705 nm (W90) 방출 필터 pH3에 대 한 기.
      참고: 신호 강도와 배경 강도 달라 집니다. 마찬가지로, 필요한 노출 시간 달라 집니다 가능성을 10 배.
  2. 피지24,25 에서23 셀 카운터 플러그인 사용 하 여 수동으로 각 핵 계산. 존재와 부재 pH3, 듀와 WAPL-1의 각 개별 핵 레이블. 표 1 과 그림 2에서 설명 하는 핵의 클래스를 사용 하 여로이 모두 아래에 설명 된 계산을 촉진 한다.
    참고: 숙련 된 experimentalists 정확 하 게 믿을 수 3D 이미지에 있는 모든 핵 이중 계산 또는 어떤 핵을 누락 없이. 또는, 하나 모든 z-평면에서 모든 핵을 계산 수 있습니다 그리고 마크 셀 R 스크립트3 곱하기 계산 핵 제거를 사용할 수 있습니다.
  3. 세포 수와 세포 주기 측정 필요의 유형에 따라 위의 계산에서 주파수를 계산 합니다. 핵의 종류는 표 1과 그림 2에 정의 됩니다. 계산 표 2에 요약 되어 있습니다.
    1. (변화 나) S 단계에서 핵을 식별 하려면 30 분 듀 동물 먹이. 어떤 핵 듀 레이블 표시는 S 단계 핵입니다. 를 계산 하려면 sum A와 C 핵을가지고 표 1 과 그림 2를 참조 하십시오.
      참고: 30 분 야생-타입 성인 광고에 나온 것에 듀 펄스, 핵 표시 모든 듀 공동 조상 영역 마커1레이블이 있습니다.
    2. 조상 영역을 측정 하는 REC-8 또는 WAPL-1 항 체와 같은 조상 영역 표시와 함께 얼룩. 조상 영역 정의 모든 nucleoplasmic REC-818 또는 WAPL-1 immunoreactive 생식 핵 여기. 를 계산 하려면 합계 모든 WAPL-1 immunoreactive 핵 (A + B + C + D, 표 1 및 그림 2참조).
      참고: DTC 및 체세포 생식 핵 계산 서는 안 될 WAPL-1는 또한 라벨. 체세포 핵은 매우 강렬한 WAPL-1 신호, 생식, 그리고 핵의 "튀긴 달걀" 형태 밖에 약간 위치에 의해 식별 하기 쉽습니다.
    3. S 단계 인덱스를 측정 30 분 듀 실험을 수행 하 고 REC-8 또는 WAPL-1 항 체 공동 레이블. S 단계 인덱스 S 단계에 있는 조상 영역의 비율으로 정의 됩니다. 계산 하려면, 모든 S 상 핵, 계산 하 고 다음 조상 영역 핵의 총 수로 나누면 (A + C / A + B + C + D, 표 1 및 그림 2참조).
    4. (변형 II) 핵 M-단계에서를 식별 하려면 pH3 항 체와 얼룩. 어떤 pH3 immunoreactive 핵 M-단계 핵 있습니다. 이 피드 듀의 기간에 관계 없이 작동 합니다. 받아 A의 합계를 계산 하려면 B 핵, 표 1 과 그림 2를 참조 하십시오.
      참고: DTC 및 체세포 생식 핵 계산 서는 안 될 WAPL-1는 또한 라벨. 체세포 핵은 매우 강렬한 WAPL-1 신호, 생식, 그리고 핵의 "튀긴 달걀" 형태 밖에 약간 위치에 의해 식별 하기 쉽습니다.
    5. M 단계 인덱스를 측정 하기 위해 공동 pH3와 REC-8 또는 WAPL-1 항 체와 레이블을 지정 합니다. M 단계 인덱스 M 단계에 있는 조상 영역의 비율으로 정의 됩니다. 계산 하려면, 모든 M-단계 핵, 계산 하 고 다음 조상 영역 핵의 총 수로 나누면 (A + B / A + B + C + D, 표 1 및 그림 2참조).
    6. (변형 III) 핵 mitotic meiotic S 단계에서 둘 다 듀와 레이블을 지정합니다. 떨어져 두 개의 인구에 게, S 상 감수 분열 또는 유사 분열에 의해 선행 되었다 여부를 결정 합니다. 있는지 여부를 확인 핵 mitotic 또는 meiotic S 단계, 4 h 및 공동 레이블인 pH3 듀 피드 (M 단계 마커)와 항 체 얼룩이 지기에 의해 그-3 (meiotic 염색체 축 단백질). 듀와 pH3 핵 기록 (A를 입력, 표 1 및 그림 2참조) 단계로 mitotic S-핵 듀 그 3를 모두 표시 하는 동안 (e, 표 1 및 그림 2참조) meiotic S 단계로.
    7. (변형 IV) G 2 단계 기간을 계산 합니다.
      참고: G2 단계 M 단계에서 S 단계를 분리합니다. 비록 아무 표식 라벨 g 2에 선 충 C. 생식 보고 되었습니다, 하나 M-위상 (해 부 시) 및 S (시작 하기 전에 h 여러 레이블을 여러 실험에서 데이터를 결합 하 여 g 2 단계 기간을 계산할 수 있습니다. 해 부)입니다. M 단계 및 S 상 마커 표시 하는 셀 실험 과정 중 g 2 단계를 완료. M 단계 마커만 및 하지 S 상 마커 표시 하는 셀 실험 기간 동안 S 단계에서 되지 않았습니다.
      1. G 2 단계 기간을 계산 하려면 듀 2 h 및 pH3 항 체와 공동 레이블에 대 한 피드. 듀 (이들은 S 단계에서 절 개 전에 2 h 듀 레이블 중)의 존재에 대 한 (이 M-단계 해 부의 시간에 있는) 하는 pH3 레이블 유일한 핵을 검사 합니다. G 2 단계를 완료 하는 M 단계 핵의 분수를 계산 (A / A + B, 표 1 및 그림 2참조).
      2. 3 h 듀 라벨와 함께 다시 4 h 듀 레이블 (및 선택적으로 5 h 듀 라벨)이이 실험을 반복 합니다. 그림 3A와 같이 긍정적인 y에 듀는 pH3 긍정적인 핵의 %와 x 축에 듀 라벨의 기간을 플롯 합니다.
      3. 그래프에서 점을 연결 그림 3A와 같이 라인 50%를 교차 하는 곳을 확인 하 여 g 2 단계의 중간 기간을 계산 합니다.
      4. 그래프에서 점을 연결 그림 3A와 같이 선 99%를 교차 하는 곳을 확인 하 여 g 2 단계의 최대 기간을 계산 합니다.
    8. (변형 V) G 1 g 2 + M +의 duraion를 계산 합니다.
      참고: 선 충 C. 생식에 g 1 단계는 비정상적으로 짧은. 아무 표식 C. 선 충 의 생식에 g 1을 보고 되었습니다, 비록 하나 G2, M, 및 g 1 단계 합 기간을 추정 하 고 위에서 설명한 G2 단계 시간을이 시간을 비교할 수 있습니다. G 1 g 2 + M +의 최대 기간 듀 라벨 몇 시간 동안 후 듀 네거티브 (S 단계를 받아야 하지 않았다)에 남아 있는 모든 조상 영역 핵 (WAPL-1 immunoreactive)의 비율에서 추정 된다.
      1. G 2 + M + g 1의 기간을 계산 하려면 듀 2 h와 REC-8 또는 WAPL-1 항 체와 공동 레이블에 대 한 피드. 이 시간 동안에 S 단계를 겪었다 뿌리 영역의 일부분 결정 (A + C / A + B + C + D, 표 1 및 그림 2참조).
      2. 3 h 듀 라벨와 함께 다시 4 h 듀 레이블 (및 선택적으로 5 h 듀 라벨)이이 실험을 반복 합니다. 그림 3B와 같이 REC-8 또는 긍정적인 y에 듀는 WAPL-1 긍정적인 핵의 %와 x 축에 듀 라벨의 기간을 플롯 합니다.
      3. 그래프에 포인트를 연결 하 고 선 99%를 교차 하는 곳을 찾는 그림 3B와 같이 g 1 g 2 + M +의 최대 기간을 계산 합니다.
        참고: 마우스-안티-pH3와 토끼-안티-WAPL-1 항 체와 라벨 공동 실험 2, 3, 4, 단일 집합으로 g 2와 g 2 + M + g 1의 기간을 결정 하 고 5 h 듀 실험 수행 가능 하다.
    9. (변형 VI) 조상 영역에서 복제 핵을 식별 하지만 입력된 감수 분열 이후, REC-8 또는 WAPL-1 항 체 10 h와 공동 레이블 듀 동물 먹이. 어떤 핵 듀 레이블 표시 그 10 h 동안 S 단계에 있었다. Nucleoplasmic REC-8 또는 WAPL-1 얼룩을 표시 하지 않는 어떤 핵 감수 분열에 있었다. 단순히 계산 조상 영역 표시로 표시 되지 않는 듀 라벨와 핵 (E, 표 1참조).
      참고: 반대로, 생식 선은 안티-그-3 항 체와 meiotic 의향 마커 그-3 대 한 스테인드, 수 핵을 라벨에 듀와 함께 수 있다면 또한 그-3에 대 한 긍정적인.
    10. Meiotic 항목의 비율을 계산 하려면 듀 5 h, 10 h, 및 15 h 레이블이 위의 실험을 수행 합니다. 그림 3C와 같이 y 축과 x 축에 듀 라벨의 기간에 감수 분열을 입력 하는 핵의 수를 플롯 합니다. 다음 사용 하 여 단순 선형 회귀 기울기 (h 당 입력 핵 감수 분열)을 계산 하에서 y = mx + b.
      참고:를 사용 하 여 선형 회귀 계산 meiotic 항목의 긴요 하다. 그것은 단순히 y-절편 0이 아닌 때문에 듀 라벨의 기간으로 감수 분열을 입력 하는 핵의 수를 분할 하는 것 잘못 될 것 이다.
    11. (변형 7 세) Meiotic 진행의 속도 측정 합니다.
      참고: 듀 covalently DNA에 통합 되어, 이후 그것은 사용할 수 있습니다 추적 차별화를 통해 세포의 인구를. 그들은 감수 분열, 감수 분열, 진행에 입력 하 고 받을 oogenesis 조상 영역에서 S 상 받았다 셀 듀 레이블을 유지 합니다. 듀와 펄스-체이스 실험 meiotic 진행의 속도 측정 하기 위해 사용할 수 있습니다.
      1. 4 h ("맥 박")에 대 한 동물에 듀 라는 박테리아를 피드. 48 h ("체이스")에 대 한 레이블이 OP50 박테리아 동물 전송 다음 해 부 및 원하는 경우 REC-8 또는 WAPL 1 등 조상 영역 마커 (또는 meiotic 의향 마커 그-3 등)와 함께 공동 레이블.
      2. 이미징, 가장 근 듀 표시 된 핵의 위치를 찾습니다. Meiotic 진행의 속도 거리 (原 영역의 끝에서 셀 직경) 48 h 체이스 중 핵 표시 가장 인접 듀에 의해 여행.

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Representative Results

때문에 DNA 종합에 듀 통합 하는 데 필요한, 하나 듀 라는 핵 듀 라벨 시간 창 동안 S 단계 수술을 가정할 수 있습니다. 하나는 핵 해 부의 때에 S 단계에서 핵으로 박테리아를 분류 하는 듀와 수 유 30 분에 라벨을 해석할 수 있습니다. 핵 실험을 먹이 더 이상 연속 듀에 레이블을 지정 하는 시간 창에 왼쪽된 S 단계부터 초기 레이블을 수 또는 듀 시간대의 후반 부분에 레이블을 수 있습니다. 듀 신호 공동 DAPI 신호와 localizes. 일부 핵에 듀 신호 다른 핵에 듀에서 신호 localizes 1-2 밝은 puncta (그림 4)를 하는 동안 모든 염색체를 다루고 있습니다. 이 puncta은 S 상13에 늦게 복제를 x 염색체.

동물 들이 여기,에 듀와 함께 지속적으로 30 분 동안 고 해 부, 위 및 그림 5에 설명 된 대로. 성공적인 듀 얼룩 젊은 성인 동물 및 실패 듀 얼룩 이전 성인 동물 (아래 참조)에 한 예에의 한 예는 그림 4에 나와 있습니다. 30 분 라벨에서 듀 신호 (WAPL-1 항 체 라벨 하지만 DAPI 형태학26,,2728에 의해 접근에 의해 정의 된) 조상 영역에서 핵의 약 절반 localizes. S 단계 인덱스, 조상 영역을 듀 긍정적인, 이전 57 ± 5 %에서 보고 하 고 젊은 성인1,,23에서 70%로 높은 비율. M 단계 인덱스 약 2-31,29이다. 연속 4 h 먹이 이상에 듀와 조상 영역 레이블 모든 핵 그리고 조상 영역에 표시 된 일부 핵 이후 입력 했습니다 meiotic 의향1.

기술은 야생-타입 젊은 성인 동물에 일관 되 게 동안, 성관계 5 일 오래 된 광고에 나온 것 (심지어 그 정자를 포함)의 중요 한 일부분 듀 펄스 (그림 4E) 30 분에 레이블을 지정 하지 못했습니다. 그러나 4 h 듀, 거의 모든이 동물을 먹이로, 레이블. 듀의 짧은 펄스와 유전 여성 동물에 레이블을 산발적 오류 보고30되었습니다. 라벨에 산발적 실패 귀착되는 다른 상황을 있을 수 있습니다.

하나는 여러 듀 라벨 실험 pH3 각 라벨을 수행 하 여 세포 주기 기간을 계산할 수 있습니다. G 2의 기간 듀 시간 과정 (그림 6) 긍정적인 했다 핵 M-단계 (pH3 immunoreactive)의 비율을 분석 하 여 추정 되었다. 이 방법은 중간 및 g 2의 최대 기간 제공 (그림 3A). 중간에 젊은 성인 광고에 나온 것에 2.5 h의 대략적인 g 2 기간을 보여주는 보간됩니다 이었다. G 1 g 2 + M + 기간 듀 긍정적인 (그림 6)은 모든 조상 영역 핵 (WAPL-1 immunoreactive)의 비율에서 추정 되었다. G 2 + M + G1 메서드는 결합된 단계 (그림 3B)에 대 한 최대 기간 측정을 제공합니다. 젊은 성인 광고에 나온 것에 3.4 h의 대략적인 g 2 + M + g 1 기간을 보여주는 99th 백분위 수 시간이 보간됩니다 했다. 같은 실험에서 데이터 meiotic 항목 (h 당 핵)의 속도 계산 하기 위해 사용 되었다. 속도 핵 감수 분열 (듀 긍정, WAPL-1 부정 또는 그 3 긍정적인) 듀 레이블 (그림 3C)의 기간 동안 입력 한 수의 선형 회귀의 비탈길 이다. 야생-타입 1 일 이전 성인 광고에 나온 것에 대 한 값은 표 2에 나와 있습니다.

Figure 1
그림 1: 도표 C. 선 충 생식 및 세포 주기. (A)에서 젊은 성인 자웅 동체 생식 생식 세포의 세포 주기. 숫자는 각 세포 주기 단계에서 소요 된 시간의 대략적인 비율을 나타냅니다. (B) 선 충 C. 광고에 나온 것가지고 두 U 모양 germlines (빨간색과 파란색). spermatheca 노란색으로 표시 되 고 개발 배아 자 궁 어두운 회색으로 표시 됩니다. 주황색 점선에서 germlines 돌출을 동물 해 부는 어디 것을 나타냅니다. (C) 다이어그램 펼친된 C. 선 충 의 생식. DAPI (파란색)은 핵의 형태를 강조 하는 DNA 염료 이다. (WAPL-1 항 체 얼룩이 지기에 따라 빨간색으로 강조 표시) 원심 原 영역 포함 mitotically 자전거 줄기 세포, 조상 셀 및 셀 meiotic S 상 (WAPL-1는 또한 체세포 생식 핵 레이블). 셀 mitotic meiotic S 단계에 30 분 듀 펄스 레이블 하 고 녹색으로 표시 됩니다. M 단계에서 두 개의 셀 pH3 항 체로 분류 하 고 블랙에 표시 됩니다. 원심 끝 셀 (DTC)이이 세포의 줄기 세포 운명을 유지 하 GLP-1/노치 리간드를 제공 합니다. 로 셀 DTC에서 마이그레이션, 그들은 조상 영역을 종료 하 고 meiotic 의향을 입력 합니다. 노란색 셀 정자는 spermatheca에 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 핵의 클래스의 벤 다이어그램. 핵 존재 3 개의 마커의 부재에 의해 그룹화 됩니다: WAPL-1 조상 영역 셀 (레드), 듀 나타냅니다 S 단계 세포 (녹색), 나타내고 pH3 M 단계 셀 (파란색)을 나타냅니다. 종류 A-G로 식별 됩니다. 야생-타입 젊은 성인 광고에 나온 것에서 F 형식의 셀은 찾을 수 없습니다, 그리고 셀 듀와 (WAPL-1 긍정적인) 조상 외부 pH3 공동 레이블을 하지 않습니다 참고 영역. 원심 생식 다이어그램 아래와 G 핵의 한 예를 나타냅니다. 대 한 자세한 내용은 표 1 을 참조 하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 세포 주기 기간 및 meiotic 항목 실험 데이터의 그래픽 프레 젠 테이 션. (A) 기간 g 2 단계 pH3에서 보간 및 듀 공동 레이블 다음 다양 한 기간 듀 펄스 회색 선 50 및 99th 백분위 평균 및 최대 g 2 기간, 화살표로 표시 된 보간에 사용을 나타냅니다. G2, M 또는 g 1 단계 (B) A 셀 팬 들은 EdU의 정보를 통합 하지 않습니다. 따라서, g 2 + M + g 1 단계의 최대 기간 듀 부정적인 세포를 생성 하는 듀 라벨의 최대 기간을 측정 하 여 추정 될 수 있습니다. G 2 + M + g 1 단계 기간은 듀와 REC-8 공동 변화 기간 듀 펄스 다음 라벨에서 보간됩니다. 회색 선 99th 백분위 화살표에 의해 표시 된 최대 g 2 + M + G1 기간 삽입에 사용 된 나타냅니다. 메디아 g 2 + M + G1 기간 보간 불가능 합니다. (C) meiotic 항목의 비율 (h-당 핵에 표 2참조)는 회귀선의 기울기 로부터 계산 됩니다. Note y 절편 절편 0이 아닌 때문 회귀 meiotic 항목 (C)의 속도의 정확한 계산을 위해 필요 하다. . 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 그림 수정 및 폭스 외 에서 허가로 증 쇄 20111. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 성공과 실패 30 분 듀 얼룩의 예. 1 일 이전 (A-D)와 5 일 오래 된 (E-H) 자웅 동체 생식 (안 정액 고갈)의 confocal 현미경 이미지 30 분 듀 라벨 실험 후. 흰색 파선 조상 영역의 끝을 표시 한다. 별표는 원심 끝의 위치를 표시합니다. 녹색 표시 하 여 시각 듀 얼룩 화학 (A)를 클릭 합니다. 낮은 수준의 배경 없는 밝은 듀 + 핵 (E) 하지만 얼룩 결과 실패 듀 라벨. 붉은 자국 WAPL 1 년 면역 형광 (B, F) 노란색은 중복 (C, G)를 나타냅니다. 블루 마크 DAPI dna (D, H) 얼룩. 단일 화살촉 듀는 chromatin 걸쳐 얼룩과 핵을 나타냅니다. 이중 화살촉만 한 쌍의 염색체에 듀 puncta와 핵을 나타냅니다. 이미지는 63 X 목적으로 획득 했다. 눈금 막대 = 10 µ m (D, H). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: 실험 워크플로. 요약 (A) 성장 실험 프로토콜의 듀 레이블 (B), (C)를 해 부, 항 체 얼룩 (D), 수행 듀 (E)에 염료를 첨부, 얼룩 DNA (F), germlines (G), 이미지 클릭 반응 및 계량 표시 듀와 스테인드 핵 (H) 항 체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6: 성공적인 4 h 듀 얼룩의 예. 4 h 듀 라벨 실험 후 1 일 오래 된 성인 자웅 동체 생식의 confocal 현미경 이미지. 흰색 파선 조상 영역의 끝을 표시 한다. 별표는 원심 끝의 위치를 표시합니다. 마젠타는 pH3 면역 형광 검사 (A, C)을 표시합니다. 녹색 표시 하 여 시각 듀 얼룩 화학 (B, C)를 클릭 합니다. 붉은 자국 WAPL 1 년 면역 형광 (D) 노란색 듀와 WAPL-1 (E)의 중복을 나타냅니다. 블루 마크 DAPI DNA (F)에 대 한 얼룩. 단일 화살촉 핵 공동 듀와 pH3 표시를 나타냅니다. 이중 화살촉 pH3 + 듀-핵-드문 4 h 듀 라벨에 표시합니다. 화살표 듀 + WAPL-1-핵 감수 분열 입력을 표시 합니다. 이미지는 63 X 목적으로 획득 했다. 10 µ m 눈금 막대 (F) 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

마커: pH3 듀 * WAPL-1 또는 REC-8 그-3
해석: 유사 분열 S-단계 * 조상 영역 감수 분열
클래스: 결합된 해석:
A Symbol 1 Symbol 1 Symbol 1 Symbol 2 M 단계에서는 조상 영역에서 했다 mitotic S 단계에 듀 레이블 (완료 된 G2) 중
B Symbol 1 Symbol 2 Symbol 1 Symbol 2 M 단계에서는 조상 영역에서 없었다 S 단계에 듀 레이블 중
C Symbol 2 Symbol 1 Symbol 1 Symbol 2 Interphase, 조상 영역에서 했다 S 단계에 듀 라벨 중
D Symbol 2 Symbol 2 Symbol 1 Symbol 2 Interphase, 조상 영역에서 되지 않은 S 단계에 듀 라벨 중
E Symbol 2 Symbol 1 Symbol 2 Symbol 1 감수 분열, 했다 meiotic S 단계에 듀 레이블 (meiotic 항목 핵) 중
F Symbol 1 Symbol 2 Symbol 2 Symbol 2 유사 분열 (일부 돌연변이 발견) 또는 meiotic 사단 (spermatogenesis)에 돌아가기
G Symbol 2 Symbol 2 Symbol 2 Symbol 1 감수 분열은 S-단계에 듀 라벨 중
합계 총 pH3 긍정적인; M 단계에 있는 모든 셀 합계 총 듀 긍정적인; S 단계에 있는 모든 셀 합계 총 WAPL-1 긍정적인;  조상 영역에 있는 모든 셀 합계 총 그 3 긍정적인; meiotic 의향에 있는 모든 셀

표 1: 핵의 클래스. * Note 30 분 및 4 h 듀 실험 해석에서 다. 더에서 듀 실험, 세포 S 단계를 넘어 진행 가능성이 있다. 듀 관련 실험에 대 한 라벨의 기간에 대 한 소개 및 8 단계를 참조.

세포 주기 부분 작동 정의 계산 * 값 * *
조상 영역 핵 모든 WAPL-1 (또는 REC-8) 긍정적인, 그 3 부정적인 핵 A + B + C + D 231 ± 23 핵
S 단계 핵 핵 듀 후 30 분 듀 레이블 및 WAPL-1 긍정적인 긍정적인 A + C 133 ± 20 핵
M 단계 핵 pH3와 WAPL-1 co-positive 핵 A + B 5.2 ± 2.3 핵
S 단계 인덱스 S 단계 핵 / 조상 영역 핵 A + C / A + B + C + D 세포 주기의 57%
M 단계 인덱스 M 단계 핵 / 조상 영역 핵 A + B / A + B + C + D 세포 주기의 2%
Meiotic 항목 셀 감수 분열에서 핵을 분류 하는 듀 E 듀 라벨의 기간에 따라 다름
Meiotic 항목 속도 듀 라벨의 h 당 meiotic 항목 핵 그림 4 C * * *에서 슬로프 h 당 20.3 핵
G 2 기간 (중간) Figure4A에서 50% 차단 2.5 h
G 2 기간 (최대) 그림 4A에서 99% 차단 3.5 h
G 1 g 2 + M + 기간 (최대) 그림 4B에서 99% 차단 3.5 h
세포 주기 기간 (중간) 메디아 g 2 기간 / G2-색인 * * * 6.5 h
세포 주기 기간 (최대) 최대 g 2 기간 / G2-색인 * * * 8.1 h

표 2: 세포 주기 계산. * 편지는 표 1 및 그림 3에 정의 된 핵의 클래스를 나타냅니다. 계산 폭스 외 에서 수정 20111. * * 값 (± 표준 편차) 20 ° C에서 발생 야생-타입 광고에 나온 것에 대 한 24 시간 게시물 중반 L4 단계에 세. Note y 절편 절편 0이 아닌 때문 회귀 meiotic 항목의 속도의 정확한 계산을 위해 필요 하다. G2-인덱스 폭스 외. 20111에 설명 된 대로 S 단계 인덱스, M-단계 인덱스 및 대략적인 g 1-인덱스 (2%), 100%에서 빼서 의해 결정 됩니다.

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Discussion

듀 라는 박테리아 (단계 1)의 준비는이 프로토콜 및 문제 해결을 위한 첫 번째 포인트에 대 한 중요 한 이다. 야생-타입 젊은 성인 광고에 나온 것 4 h 듀-펄스, 듀 라는 박테리아의 모든 새로운 배치를 위한 유용한 컨트롤 만들기에 매우 안정적으로 레이블. 또한, 소장 (입력 더 오래 된 동물 또는 특정 인 두/분쇄기 결함이 있는 돌연변이) 그대로 듀 라는 박테리아 클릭 화학 레이블 하 고 용기에 밝은 직사각형 puncta로 나타납니다. 광고에 나온 것을 라벨에 대 한 대체 기술 듀3의 높은 농도 (1 mM) "소"를 사용 합니다. 이 기술은,의 기간에 대 한 동물을 starves 하지만 고정 문제를 해결할 때 만드는 듀 라는 박테리아를 무시 하 고 화학을 클릭 하는 유용한 방법을 제공 합니다. 듀 피드 동안 듀 "적신 다" 실험 성공 하면 다음 신선한 듀 라는 박테리아를 준비 합니다. 도달 하기 위해 충분 한 세균 밀도 높은 듀 콘텐츠를 달성 하는 동안, 하나 듀와 티 미 딘 농도 조정 해야 할 수 있습니다.

S 단계의 라벨에 대 한이 기술의 주요 제한은 동물에 듀 라는 박테리아를 피드 하는 필요에서입니다. (때문에 유전자 형 또는 단계) 먹이 수 없는 동물이 기술을 표시 되지 않을 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, nucleoside 아날로그는 선 충 C. 생식에 S 상 핵을 식별 하는 유일한 방법은 현재 그리고 그들의 사용에 어떤 transgenes는 동물에 있이 필요 하지 않습니다. 또한, 통합, 일단 핵에 듀 남아도 그들은 S-단계, 세포 주기 진행 종료 분할 또는 차별화. 신호는 모든 세포 분열으로 절반으로 약화. 이것은 듀 심지어 몇 가지 세포 분열을 통해 셀의 역사를 추적 하기 위한 완벽 한 있습니다.

펄스 추적 실험 듀의 안정성에 게 간단 합니다. 단순히 원하는 기간 펄스 완료 되 면 동물에서 과잉 듀 박테리아를 헹 구 고 레이블이 없는 박테리아에 동물을 전송. 듀는 DNA에 남아 있고 여러 세포 분열 후에 볼 수 있다. 그러나, 실험 S 단계 레이블 (듀의 단일 펄스)의 단일 유형으로 제한 됩니다. 공동 듀와 BrdU 라벨은 포유류 세포31 가능 하지만 C. 선 충에 보고 하지 않은. IdU 및 CldU의 공동 레이블 포유류32 에 사용 하지만 또한 보고 하지 않은 C. 선 충에.

듀 라벨의 주요 이점은 그 메서드가 필요 없습니다 transgenes, 듀 일반 문화 중 C. 선 충 을 먹이, 화학 immunofluorescent 기술, 호환 이며 듀 DNA에는 수 유 후 오랜 시간 지속 중지. 이러한 기능에 듀 세포 주기 및 생식 세포 역학의 여러 측면을 연구 하는 훌륭한 도구를 확인 합니다.

연구 질문의 다양 한에 듀와 세포 주기 및 생식 세포 역학 분석을 적용할 수 있습니다. 이 방법의 추가 응용 프로그램의 단지 몇 가지 예: 세포 주기의 역학 동물 세포 주기 유전자 돌연변이와 어떻게 변경 합니까? 어떻게 생리 조건 줄기 세포, 생식 세포 입국 meiotic 의향의 속도 meiotic 의향을 통해 생식 세포 진행의 속도에서 세포 주기 영향을 합니까? 세포 주기는 애벌레의 개발 하는 동안 어떻게 바꿉니까? 어떻게 할 주요 신호 통로 중단에 영향을 세포 주기 (예: 소성 확산) 셀 운명에 변화 뿐만 아니라? 이 시스템은 셀 많은 다른 조건에서 뭘 공부를 수정할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

우리는 MG1693;에 대 한 대장균 재고 센터에 감사 Wormbase; 프로그램에 의해 국립 연구소의 건강 사무실의 연구 인프라 (P40OD010440) 긴장;에 대 한 투자는 꼬마 유전학 센터 자크 Pincus 통계 조언; Aiping Feng 시 약;에 대 한 루크 슈나이더, 안드레아 Scharf, Sandeep 쿠마, 그리고 교육, 조언, 지원, 및 유용한 토론; 존 브 레너 그리고이 원고에 피드백 Kornfeld Schedl 실험실. 이 작품 부분 건강의 국가 학회에 의해 지원 되었다 주식, TS R01 GM100756 [R01 AG02656106A1]와 [당선-1143954와 ZK DGE-1745038] 국립 과학 재단 predoctoral 친목. 건강의 국가 학회도 국립 과학 재단 연구, 수집, 분석, 및 데이터의 해석의 디자인에도 원고를 쓰기에 어떤 역할을 했다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E. coli MG1693 Coli Genetic Stock Center 6411 grows fine in standard unsupplemented LB
E. coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center OP50
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit Thermo Fisher Scientific C10337
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine Sigma 900584-50MG or use EdU provided in kit
Glucose Sigma D9434-500G D-(+)-Dextrose
Thiamine (Vitamin B1) Sigma T4625-5G Reagent Grade
Thymidine Sigma T1895-1G BioReagent
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma M1880-1KG MgSO4, Reagent Grade
Sodium Phosphate, dibasic, anhydrous Fisher BP332-500G Na2HPO4
Potassium Phosphate, monobasic Sigma P5379-500G KH2PO4
Ammonium Chloride Sigma A4514-500G NH4Cl, Reagent Plus
Bacteriological Agar US Biological C13071058
Calcium Chloride dihydrate Sigma C3881-500G CaCl
LB Broth (Miller) Sigma L3522-1KG Used at 25g/L
Levamisole Sigma L9756-5G 0.241g/10ml
Phosphate buffered saline Calbiochem Omnipur 6506 homemade PBS works just as well
Tween-20 Sigma P1379-500ML
16% Paraformaldehyde, EM-grade ampules Electron Microscopy Sciences 15710 10ml ampules
100% methanol Thermo Fisher Scientific A454-1L Gold-label methanol is critical for proper morphology with certain antibodies
Goat Serum Gibco 16210-072 Lot 1671330
rabbit-anti-WAPL-1 Novus biologicals 49300002 Lot G3048-179A02, used at 1:2000
mouse-anti-pH3 clone 3H10 Millipore 05-806 Lot#2680533, used at 1:500
goat-anti-rabbit IgG-conjugated Alexa Fluor 594 Invitrogen A11012 Lot 1256147, used at 1:400
goat-anti-mouse IgG-conjugated Alexa Fluor 647 Invitrogen A21236 Lot 1511347, used at 1:400
Vectashield antifade mounting medium containing 4',6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI) Vector Laboratories H-1200 mounting medium without DAPI can be used instead, following a separate DAPI incubation
nail polish Wet n Wild DTC450B any clear nail polish should work
S-medium various see wormbook.org for protocol
M9 buffer various see wormbook.org for protocol
M9 agar various same recipe as M9 buffer, but add 1.7% agar
Nematode Growth Medium various see wormbook.org for protocol
dissecting watch glass Carolina Biological 42300
Parafilm laboratory film Pechiney Plastic Packaging PM-996 4 inch wide laboratory film
petri dishes 60 mm diameter
Long glass Pasteur pipettes
1ml centrifuge tubes MidSci Avant 2926
Tips
Serological pipettes
500 mL Erlenmyer flask
Aluminum foil
25G 5/8” needles BD PrecisionGlide  305122
5ml glass centrifuge tube Pyrex 
Borosilicate glass tubes 1ml
glass slides
no 1 coverslips 22 x 40 mm no 1.5 may work, also
37 °C Shaker incubator
Tabletop Centrifuge
Clinical Centrifuge IEC 428 with 6 swinging bucket rotor
Mini Centrifuge
20 °C incubator
4 °C refrigerator
-20 °C freezer
Observer Z1 microscope Zeiss
Plan Apo 63X 1.4 oil-immersion objective lens Zeiss
Ultraview Vox spinning disc confocal system PerkinElmer  Nikon spinning disc confocal system works very well, also, as described here: http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy 

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References

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개발 생물학 문제 140 C. 선 충 듀 S 단계 세포 주기 생식 meiotic S 단계 M-위상 G2 단계
티 미 딘 아날로그 듀와 <em>선 충 C.</em> 생식에 세포 주기 분석
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