Summary
Vi demonstrere en metode for deponering Escherichia coli bakterielle biofilm i vilkårlige rumlige mønstre med en høj opløsning ved hjælp af optisk stimulering af en genetisk kodet overflade-vedhæftning konstruktion.
Abstract
Rumlige struktur og mønstre spiller en vigtig rolle i bakterielle biofilm. Her viser vi en tilgængelig metode til dyrkning af E. coli biofilm i vilkårlige rumlige mønstre på høj rumlige opløsning. Teknikken, der bruger en genetisk kodet optogenetic konstruktion — Pedersencharlotte1975-Ag43 — der par Biofilmdannelse i E. coli på optiske stimulation af blåt lys. Vi detalje proces for at omdanne E. coli med Pedersencharlotte1975-Ag43, forberede de nødvendige optiske set-up, og protokollen til dyrkning mønstrede biofilm ved hjælp af Pedersencharlotte1975-Ag43 bakterier. Ved hjælp af denne protokol, kan være mønstrede biofilm med en rumlig opløsning under 25 μm på forskellige overflader og miljøer, herunder lukkede kamre, uden at kræve microfabrication, rene værelse faciliteter eller overflade forbehandling. Teknikken er praktisk og egnet til brug i applikationer, der undersøger effekten af biofilm struktur, leverer afstemmelige kontrol over biofilm mønstre. Mere bredt, det har også potentielle anvendelser i biomaterialer, uddannelse og bio-kunst.
Introduction
Biofilm er overflade-attached Fællesskaber af mikrober, og er kendt for deres stærke struktur-funktion kobling. Rumlige geometri og mønstre af biofilm spiller en vigtig rolle i samlede Fællesskabets funktion (og omvendt)1. Den lille længde skalaer involveret i biofilm struktur — om snese mikron2— gøre afstemmelige og bekvem kontrol af biofilm mønster et udfordrende problem. Her viser vi en protokol, der giver mulighed for biofilm at være netop mønstrede i vilkårlige geometrier, baseret på optisk belysning.
Protokollen præsenteres her bruger Pedersencharlotte1975-Ag433, en optogenetic konstruktion, der par Biofilmdannelse i E. coli bakterier til optisk belysning ved at køre et udtryk for Ag43 (en adhesin genet er ansvarlig for overflade vedhæftning og biofilm dannelsen) under kontrol af Pedersencharlotte19754 (en transcriptional regulator kontrolleret af optisk belysning). Metoden er nem at bruge og kan mønster biofilm på forskellige overfladen miljøer, herunder lukkede (gennemsigtig) kultur kamre. I forhold til eksisterende celle deposition metoder, såsom droplet-baserede deposition5 eller overflade prepatterning/behandling6, Pedersencharlotte1975-Ag43 kræver ikke microfabrication eller rense-værelse faciliteter og kræver ikke materialer ud over dem rådighed for en typisk Mikrobiologi laboratorium. Det er i stand til mønster med en rumlig opløsning under 25 μm, nærmer sig de rumlige dimensioner af microcolonies i naturligt eksisterende biofilm2. Samlet set giver denne teknik mulighed for at manipulere biofilm struktur, som derefter åbner mange muligheder for at studere microecology i bakterielle samfund7. Derudover kan mønstrede biofilm give en bekvem platform, hvorpå ingeniør nyttige biomaterialer8,9. I dette papir, vi diskutere de grundlæggende protokollen kræves for mønster biofilm ved hjælp af Pedersencharlotte1975-Ag43 og løse potentielle ændringer og fejlfinding i forbindelse med metoden.
Protocol
1. forberedelse af Pedersencharlotte1975-Ag43 bakteriestammer
- Omdanne Pedersencharlotte1975-Ag43 til en E. coli -stamme af interesse (figur 1).
- Vokse en kloning stamme hosting Pedersencharlotte1975-Ag43 plasmid (fås fra et plasmid lager) ved at vaccinere belastning i LB bouillon suppleret med 50 μg/mL spectinomycin (LB + spec) i en kultur tube (overnatning i en rystende inkubator på ~ 250 rpm, 37 ° C). Brug derefter en miniprep kit til at høste renset Pedersencharlotte1975-Ag43 plasmid10.
- Vælg en E. coli -stamme af interesse at være mønstrede. Hidtil er Pedersencharlotte1975-Ag43 blevet verificeret for at arbejde i MG16553 og BW25113.
- Bruge en etableret protokol til at generere kompetente (f.eks., kemisk kompetente11 eller electrocompetent12) bestande af valgt E. coli stamme (f.eks.MG1655).
- Omdanne den kompetente bakterier11,12, efterfulgt af 1 h opsving, og pladen på LB + spec agar plader Pedersencharlotte1975-Ag43 plasmid. Tillad kolonier til at vokse natten over ved 37 ° C.
- Butik Pedersencharlotte1975-Ag43 forvandlet stammer.
- Podes en enkelt koloni af Pedersencharlotte1975-Ag43 fra en LB + spec agar plade i LB + spec bouillon i en kultur tube og dyrke det i en rystende inkubator (på ~ 250 rpm, 37 ° C) til eksponentiel fase (OD600 ~0.4 - 0,8).
- Forberede lager til at gemme Pedersencharlotte1975-Ag43 forvandlet stamme ved-80 ° C langsigtede ved at blande 1 mL af kultur med 1 mL 50% steril glycerol i cryo-rør til at opnå en 25% glycerol fryser lager. Gemme det i et-80 ° C fryser.
- Hvis yderligere plasmider (fx, fluorescerende reporter plasmider) har brug at blive omdannet, skabe kompetente celler11,12 fra Pedersencharlotte1975-Ag43 forvandlet stamme og Gentag transformation processen11 , 12 for yderligere plasmider efter behov.
Bemærk: Hvis du bruger elektroporation8, det er muligt at cotransform flere plasmider (herunder Pedersencharlotte1975-Ag43) samtidigt; dog anbefales en samtidige transformation ikke ved hjælp af kemisk omdannelse metoder, som Pedersencharlotte1975-Ag43 store (> 10 kB) betyder transformation effektivitetsgevinster reduceres.
2. forberedelse af projektor optisk Set-up for lysende bakterier
- Få en bakteriel kuvøse med ikke-gennemsigtige vægge og et hul for at videregive kabler, en transportabel projektor i stand til montering og funktion inde bakteriel rugemaskinen, og en bærbar computer udstyret med software til præsentation-projektion (Se tabel af Materialer). Når du vælger projektor og inkubator, sikre, at den minimale fokuseringsafstand af projektoren er mindre end den indvendige højde af rugemaskinen.
- Placere projektoren inde i rugemaskinen i bunden, med aperture peger direkte opadgående, på loftet, hvor biofilm kultur kammer er knyttet (figur 2).
- Fix projektor på plads ved at konstruere et set-up med en optisk breadboard base er tilsluttet en lodret stilling, forbundet igen til en vandret stilling som skruer til projektor (figur 2). Bemærk at dette set-up kan blive ændret afhængigt af de projektor/tilgængelige dele. I sidste ende, det centrale krav er, at projektoren er solidt fast nær bunden af varmeskabet, med blænden pegende opad.
- Slut den bærbare computer via skærmkablet (fxHDMI) til projektor inde i rugemaskinen.
- Hvis overflader — specielt loft — i indre af rugemaskinen er reflekterende (f.eks.metal poleret overflade), dækker dem med mørke matte overflader til at minimere refleksioner.
- Brug tape til at vedhæfte en tom "dummy" kultur parabol til loftet i rugemaskinen. Bemærk, at som med projektoren, er der flere acceptable måder til at vedhæfte en kultur parabol; sikre at gennemsigtig bunden overfladen af kultur kammer, hvor belysningen opstår, ikke er omfattet.
- Justere fokus på projektoren ved at dreje fokus knop, således at fokus flyet falder sammen med bunden overfladen af biofilm kultur parabol (f.eks.et godt plade) knyttet til loftet for inkubator (figur 2). Projektoren skal belyse en skarp og ikke-sløret billede på bunden af kultur parabol. Fjern "dummy" kultur fadet når projektionen er blevet optimeret.
- Ved hjælp af bærbare software, direkte projektor til at belyse den fulde synsfelt med maksimal blå belysning (f.eks.RGB = [0, 0, 255]) ved at præsentere en fuld blå dias.
- Måle belysning intensiteten af projektoren ved hjælp af en optisk wattmeteret ved at placere fotodetektor hoved til rugemaskine loftet og læsning intensitet på tilsvarende wattmeteret kalibreret til lys bølgelængde 460 nm. Følg vejledningen på tilslutning og kalibrere fotodetektor for specifikke wattmeteret anvendes.
- Reducere omgivende lys (f.eksslukke værelse lys, eller placere rugemaskinen fra lyskilder) så meget som muligt før belysning intensitet målinger.
- Justere belysning intensitet ved hjælp af en justerbar neutralfiltre placeret på projektor blænde. Rotere filteret for at justere belysning intensitet måles ved energimåler, indtil belysning intensiteten i midten af regionen blåt-lys forventede læser 50 μW/cm2.
Bemærk: Mens det er muligt at justere belysning intensitet ved hjælp af lavere blå RGB-værdier på software ende, ved hjælp af et filter mens maksimere den blå RGB-værdi har fordelen, at maksimere systemet optisk kontrasten mellem belyste vs. mørke områder. - Tegne vilkårlige mønstre ved hjælp af præsentation/projektor softwaren på bærbare og vise disse mønstre på loftet i rugemaskine projektoren.
Bemærk: Biofilm-dannende regioner bør trækkes med maksimal blå belysning (f.eks.RGB = [0, 0, 255]), ikke danner biofilm regioner med ingen belysning (f.eks.RGB = [0, 0, 0]).
3. dyrkning mønstrede biofilm
- Før belysning, forberede Pedersencharlotte1975-Ag43 bakterier, startende fra glycerol fryser lager, således at de er pålideligt induceret på den sene eksponentielle vækstfase for belysning (figur 3A).
- Streak en Pedersencharlotte1975-Ag43 stamme fra glycerol lager på LB + spec agar plader. Tillad kolonier til at vokse overnatning (37 ° C).
Bemærk: Herfra indtil belysning kultur skridt sikre cellerne bo i mørke så meget som muligt – korte perioder på omgivende belysning (fxtil subdilution) kan accepteres. - Podes en koloni af Pedersencharlotte1975-Ag43 bakterier fra en agar plade i LB + spec bouillon og vokse kultur natten til stationær fase (i en rystende inkubator på ~ 250 rpm, 37 ° C, for ~ 16 h).
- Subdilute kultur i forholdet 1:1,000 med LB + spec bouillon (f.eks.tilføje 1 μL af overnight kultur til 1 mL frisk LB + spec).
- Tillad den subdiluted kultur at vokse indtil sent eksponentiel/tidlig stationære fase (OD ~ 1.0, ~ 6 h i en rystende inkubator på ~ 250 rpm, 37 ° C).
- Mens vi venter kultur at vokse, forberede M63 medier med 1 x M63 salte, 1 mM MgSO4, 0,2% glukose, 0,1% casamino syrer og 50 μg/mL spectinomycin i vand (sikre bestanddele er sterile).
- Subdilute sen-eksponentiel-fase kultur i forholdet 1: 100 med M63 media suppleret med 50 μg/mL spectinomycin. Derefter, indføre fortyndingsluft i en biofilm kultur skål (fxafpipetteres den fortyndede prøve i et godt plade).
Bemærk: De mængder, der kræves til denne 1: 100 subdilution afhænger af kultur skålen bliver brugt (f.eks.hvis ved hjælp af en 6-godt polystyren godt plade [ikke-cellekultur behandlet], en enkelt prøve ville kræve tilføjer 20 μL af kultur til 2 mL af M63 + spec, som den standard godt volumen af en 6-godt plade er ~ 2 mL).
- Streak en Pedersencharlotte1975-Ag43 stamme fra glycerol lager på LB + spec agar plader. Tillad kolonier til at vokse overnatning (37 ° C).
- Prøverne er nu klar til belysning, tape kultur parabol til loftet i rugemaskinen, sikre, at overfladen i bunden af fadet er gennemsigtig for belysning fra neden af projektoren.
Bemærk: Det er vigtigt at sikre, at loftet i rugemaskinen ikke er reflekterende, at minimere omstrejfende belysning. Omstrejfende belysning kan også reduceres ved hjælp af sort-walled plader som kultur retter, selv om dette ikke er strengt nødvendig — hvis du bruger sådanne plader, sikre den nederste overflade er gennemsigtig. - Tillad biofilm til kultur i rugemaskinen natten (16 h med ingen ryster, ved 37 ° C). Bemærk at nogle projektorer bliver mindre pålidelige ved højere temperaturer. Hvis det er tilfældet, holde kultur ved lavere temperaturer (f.eks.30 ° C), sig for øje, at inkubationstiden muligvis skal hæves, afhængigt af E. coli -stamme.
4. imaging mønstrede biofilm
- Efter overnatning væksten af biofilm prøver, skal du fjerne kultur parabol fra rugemaskinen. Skålen har biofilm bakterier knyttet til bunden overfladen hvor det har været belyst, samt planktoniske bakterier spredt i den flydende medier ovenfor.
- Kassér de planktoniske celler ved at fjerne den flydende medier fra kultur parabol (f.eks.ved forsigtigt sugning med en pipette).
- Skyl prøve 2 x med en fosfatbufferet saltopløsning (PBS) løsning til at fjerne de resterende planktoniske celler (figur 3B) ved forsigtigt pipettering i PBS, efterfulgt af aspiration.
- Hvis cellerne er fluorescently markeret, direkte billede prøverne ved hjælp af Fluorescens mikroskopi13 (fx, wide-felt13, 3-D Konfokal14, osv.).
Bemærk: Fluorescerende biofilm kan også bevares ved hjælp af en selvstændig hærdning montering medium. Påfør en dråbe af montering medier til en biofilm stikprøve, dække det med et glas coverslip, pas på ikke for at fange nogen bobler nedenunder, og lad det hærde natten før billeddannelse. - Hvis bakterieceller anvendes ikke er fluorescently markeret, anvende krystalviolet pletten teknik15 (figur 3B) for at forbedre kontrasten i biofilm før billeddannelse.
5. protokollen ændringer/alternativer
- Vokse Pedersencharlotte1975-Ag43 bakterier på forskellige overflader.
- Sætte glas eller poly-dimethyl-siloxan (PDMS) Kuponer (f.eks, coverslips eller tynde strimler af PDMS) i godt plader før tilføjelsen af en bakteriel prøve/belysning, og følge samme protokol som før til mønster Pedersencharlotte1975-ag43 biofilm på glas og PDMS.
- Vokse Pedersencharlotte1975-Ag43 bakterier inde i en gennemsigtig, lukket kultur kammer.
- Generere en kultur kammer skimmel til PDMS.
- For en grundlæggende kultur kammer, generere skimmel ved at knytte en hård, rektangulære prisme til en flad overflade (prisme bliver et hulrum i den PDMS, der fungerer som kultur-kammer, når formen er kastet). Bemærk, at mere indviklede kultur kammer forme kan være opdigtet benytter bløde litografi16.
- Støbt en PDMS hulrum af hælde PDMS i formen og gør det muligt at helbrede (for en detaljeret bløde litografi protokol, se Joves videnskab uddannelse Database16).
- Efter hærdning, trim eventuelle overskydende PDMS, punch indløb/udløb kanaler ind i hulrummet/kultur kammeret og lænker hulrum til en flad overflade (f.eks., glas/polystyren) vedattrykkepå fast PDMS på en flad overflade, forlader hulrummet mellem overfladen og PDMS loftet som biofilm kultur kammer.
Bemærk: Mere permanent limning baseret på plasma behandling16 kan også bruges, men chipsene vil så ikke være genanvendelige. - Følg kultur-protokollen som før, ved hjælp af en sprøjte med stump spids nåle (i stedet for en pipette) at indføre bakteriel prøven i kultur kammer/skylning med PBS buffer (figur 3 c).
- Hvis bruger en midlertidigt agglomererede hulrum, brug kun negative pres til at trække væske ind/ud af salen, at sikre, at hulrummet ikke bliver unbonded fra den underliggende glas/polystyren overflade.
- Generere en kultur kammer skimmel til PDMS.
- Vokse Pedersencharlotte1975-Ag43 bakterier bruger en film photomask til struktureret belysning.
- Designe en biofilm mønster ved hjælp af CAD-software kompatibelt med en film photomask printer/print service. Photomask film design bør være klar i regioner hvor biofilm er beregnet til at blive udskrevet, og sort/uigennemsigtig andetsteds. Når det er fuldført, send filen photomask til printer/udskrivning service og afventer returnering af de fysiske photomask.
- Instruere projektor til at belyse et fuldt synsfelt med maksimal blå belysning (f.eks.RGB = [0, 0, 255]) ved hjælp af bærbare software.
- Skære en region af interesse fra større film photomask, og tape det direkte til bunden af biofilm kulturen parabol før at indføre bakteriel prøven for natten belysning (figur 3D). Kultur af biofilm som før og fjerne photomask efter dyrkning, før billeddannelse.
Representative Results
Som det ses i figur 4A, Pedersencharlotte1975-Ag43 bakterier blev brugt til at generere biofilm mønstrede i polystyren godt plader med projektor belysning (projektoren blev sat til at belyse en polka-dot mønster), fotograferet gennem brightfield mikroskopi med krystal Violet pletten som et kontraststof, og Fluorescens mikroskopi ved hjælp af rødt-fluorescerende-protein-udtrykker bakterier. Fluorescerende biofilm prøver kan også være afbildet ved hjælp af konfokalmikroskopi14 at få billeder af biofilm i 3D (figur 4B). I figur 4 cillustrere vi høj opløsning mønstret muligt ved hjælp af en film photomask for at levere mønstrede belysning til eksemplet biofilm. Endelig, i figur 4D og 4E, vi viser eksempler på mønstre på glas samt PDMS overflader og lukkede PDMS kultur kamre – de viser de forskellige typer af miljøer hvor Pedersencharlotte1975-Ag43 mønstre kan anvendes.
Figur 1: forberedelse af Pedersencharlotte1975-Ag43 bakterier (protokollen afsnit 1). Forberede Pedersencharlotte1975-Ag43 bakterier i stand til at lys-regulerede Biofilmdannelse inddrager rensende Pedersencharlotte1975-Ag43 plasmid fra en vært kloning stamme, omdanne det til en E. coli -stamme af interesse og oprette bakteriel fryser lager for langsigtet opbevaring. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: forberedelse af en optisk set-up for biofilm prøve belysning (protokollen afsnit 2). Den optiske set-up ligger inde i en bakteriel inkubator og består af en computer tilsluttet projektoren lysende en biofilm prøve. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: kultur protokol for mønster biofilm (protokollen afsnit 3). (A) forud for belysning, Pedersencharlotte1975-Ag43 bakterier er udarbejdet før mønster således, at de er pålideligt induceret på ordentlig vækstfase. (B) efter natten belyst vækst, en mønstrede biofilm vil være til stede i bunden af kultur-fadet sammen med planktoniske celler i den flydende medier, og efter nogle yderligere forarbejdning af biofilm er klar til billedbehandling. (C) som et alternativ til godt plader, biofilm kan være kulturperler i lukkede kultur kamre som en støbt PDMS hulrum. I dette tilfælde kan sprøjter knyttet til stump spids nåle bruges til at indføre prøven og skylle væsker ud af salen. (D) som et alternativ til projektor-baseret belysning mønstre, mønstre kan også genereres ved at tape film komponeneter direkte til bunden af biofilm kultur kamre. I dette tilfælde bør projektoren sættes op til at belyse blåt lys på tværs af feltet fuld. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: repræsentative resultater af biofilm mønstrede ved hjælp af Pedersencharlotte1975-Ag43. Alle resultater blev opnået ved hjælp af en MG1655 E. coli vært stamme. (A) Pedersencharlotte1975-Ag43 bakterier blev brugt til at generere biofilm mønstrede i polystyren godt plader med projektor belysning (projektoren blev sat til at belyse en polka-dot mønster), fotograferet gennem brightfield mikroskopi med krystalviolet pletten som en kontraststof, og Fluorescens mikroskopi ved hjælp af rødt-fluorescerende-protein-udtrykker bakterier. (B) fluorescerende biofilm prøver er afbildet med Konfokal mikroskopi til at hente 3D-billeder af biofilm. (C) med høj opløsning biofilm kan være mønstrede med en film photomask at levere mønstrede belysning til eksemplet biofilm. (D) biofilm kan være mønstrede på glas og PDMS overflader. (E) biofilm kan være mønstrede i lukkede kultur kamre. Dette tal er blevet tilpasset fra tidligere arbejde3. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Problem | Potentielle årsager/løsninger |
| Tranforming SmukkeLolle-Ag43 til værten stamme - ingen kolonier | Lav plasmid koncentration - tjek plasmid koncentration på spektrometret. En typisk miniprep af Pedersencharlotte1975-Ag43 bør give mindst 100 ng/μl; bruge op til 10-100 ng for transformation |
| Check/genindspilning kompetente celler: kompetente celler bør have transformation effektivitet mindst 10 ^ 6 cfu/µg verificeret ved hjælp af en standard plasmid såsom pUC19 - hvis ikke, genindspilning kompetente celler | |
| Forkert (niveau) antibiotikum på LB agar plade - Sørg for at bruge 50 μg/mL spectinomycin udvælgelseskriterier, | |
| Projektor belysning viser off / inkonsekvent natten over | Deaktivere problematiske software såsom: automatiske overnight software/OS opdateringer, natten blåt-lys filter |
| Projektoren kan overophedning - sæt inkubator til lavere temperatur mens projektoren er aktiveret (f.eks. 30 ° C i stedet for 37 ° C) - Bemærk projektor som varmekilde kan overophede inkubator ud over setpunkt | |
| Fjern unødvendige kilder af fugtighed fra rugemaskinen, da disse kan påvirke projektor elektronik | |
| No/lave niveauer af biofilm dannet efter natten belysning, ingen planktoniske celler vækst enten (dvs. flydende er klart) | Forkert (niveau) antibiotikum - Sørg for at bruge 50 μg/mL spectinomycin |
| Kontrollere alt er føjet til M63 opskrift korrekt | |
| No/lave niveauer af biofilm dannet efter natten belysning, kun planktoniske celler (dvs. flydende er overskyet) | Tjek lys niveau, projektor bør lysende blå lys på 50 μW/cm ^ 2 på 460 nm bølgelængde |
| Prøv at lade bakterier vokse til kortere/længere tid efter 1:1000 LB subdilution skridt før tilføjelse til M63 | |
| Restreak bakterier på LB plade, starter fra frisk koloni til at generere overnight stationær fase kultur | |
| Sikre projektor arbejder konsekvent overnight - se punkt ovenfor | |
| Fuzzy biofilm mønstre, høje niveauer af baggrundsstøj | Reducere omstrejfende lys fra optisk belysning system, dække reflekterende flader på indvendige af inkubator |
| Overvej at bruge photomask-baserede (i modsætning til projektor-baseret) struktureret belysning | |
| Check projektor er ordentligt fokuseret på bunden overfladen af biofilm kultur kammer |
Tabel 1: Almindelige fejlfindingsproblemer.
Discussion
I lyset af behovet for forskningsværktøjer, der giver mulighed for biofilm struktur kontrol, har vi præsenteret en nem-at-bruge protokollen for mønster bakterielle biofilm ved hjælp af Pedersencharlotte1975-Ag43 optogenetic konstruktion. Med denne teknik kan E. coli biofilm optisk mønstret på forskellige overflade miljøer, herunder lukkede kamre, med en rumlig opløsning under 25 μm.
Samlet set denne protokol kan opdeles i fire hovedafsnit: (1) udarbejdelse af Pedersencharlotte1975-Ag43 bakterier, (2) udarbejdelse af de optiske og kultur set-up hardware, (3) før belysning bakterievækst trin og (4) efter belysning skylninger og billedbehandling.
Den kritiske del af afsnit 1 er den vellykkede transformation af Pedersencharlotte1975-Ag43 plasmid til E. coli -stamme af interesse. Dette er lettet ved isolering af høj kvalitet renset plasmid og skabe høj kvalitet kompetente celler for transformation (tabel 1, fejlfinding).
Den kritiske del af afsnit 2 er optimering af projektor set-up, så belysning intensitet er justeret til 50 μW/cm2 på 460-nm bølgelængde, og projektoren er ordentligt fokuseret på biofilm prøve højde. Bemærk, at i denne protokol, vi beskriver en inverteret belysning set-up hvor projektoren skinner lys nedefra, opad mod eksemplet biofilm. Fordelen ved denne struktur er, at lyset kun skal rejse gennem bunden af kultur parabol før nå biofilm dannelse overflade. Belysning fra ovenstående betyder, at lyset ville have til at rejse gennem den flydende medier over biofilm overflade, som i løbet af væksten, bliver overskyet med planktoniske celler. Ud over disse bekymringer, er det også vigtigt at minimere omstrejfende lys i den optiske set-up så meget som muligt, for eksempel ved at dække op reflekterende overflader på indre af rugemaskinen – dette hjælper med at få skarpere mønstrede biofilm. På et beslægtet note, kan skarpere biofilm mønstre også opnås ved hjælp af en photomask til at styre belysningsstyrke mønstre (figur 3D, figur 4 c). Fælles problemer kræver fejlfinding omfatter projektor pålidelighed spørgsmål ved højere temperaturer (f.eks, 37 ° C), som kan minimeres ved at inkubere biofilm vækst ved lavere temperaturer (f.eks., 30 ° C), samt edb-programmel, der forårsager operativsystemet opdateringer eller blåt lys filtrering under overnight væksten (tabel 1). Det er også vigtigt at bemærke, at afhængigt af projektoren og kuvøse model anvendes, det er også muligt at varme, der genereres fra projektoren vil resultere i en højere indvendige temperatur end rugemaskinen indstillet temperatur, som muligvis skal korrigeres.
Den kritiske del af afsnit 3 er at opnå pålidelige og repeterbare bakteriel prøver før de er fremkaldt af belysning. Af denne grund anbefales det at få klonede kolonier af bakterier, Pedersencharlotte1975-Ag43 ved striber dem ud på en agar plade og derefter bruge flydende kultur skridt til at sikre, at bakterier er belyst/induceret på den sene eksponentielle vækstfase i en gentagelig måde.
Endelig er den kritiske del af afsnit 4 grundigt, men også forsigtigt vaske væk de planktoniske celler tilbage efter biofilm mønster protokol; således, det anbefales at udføre flere blid skyl trin med PBS.
I forhold til eksisterende teknikker til celle mønstre5,har6, optisk biofilm mønster baseret på Pedersencharlotte1975-Ag43 en rimelig lav barriere for indrejse til at bruge, idet det ikke kræver microfabrication, rene værelse faciliteter, kompleks kemi eller overflade forbehandling, men er stadig i stand til mønster med høj opløsning (25 μm) typisk er forbundet med microfabrication teknikker. Metoden udvider tidligere arbejde på bakteriel fotolitografi for kontrollerende gen expression17. I øjeblikket er Pedersencharlotte1975-Ag43 plasmid begrænset til E. coli, da det bruger en pUC-baserede oprindelse af replikering, men Pedersencharlotte1975 og Ag43 er begge kompatibel i andre (Gram-negative) bakteriearter. Genetiske teknikker er til rådighed for potentielt indførelse af lys-regulerede Biofilmdannelse til forskellige bakteriearter og repræsenterer en mulig retning for fremtidig forskning. En anden potentiel begrænsning af teknik er, at det virker ved at øge Biofilmdannelse i stammer med svag indfødte Biofilmdannelse (f.eks.MG1655 E. coli). Imidlertid har stammer med stærk indfødte Biofilmdannelse biofilm form uanset belysning betingelser, udelukkes mønstrede Biofilmdannelse bruger Pedersencharlotte1975-Ag43 som beskrevet her; endnu optogenetic teknikker kan stadig vise sig gældende i reguleringen Biofilmdannelse. Vi bemærke, at i andre sammenhænge, alternative metoder til biofilm mønstre kan være tilgængelige, såsom via optisk c-di-GMP graduering18.
Samlet set Pedersencharlotte1975-Ag43 baseret mønstre vil være egnet til brug i applikationer, der undersøger effekten af biofilm struktur på funktion1 , og derfor kunne drage fordel af afstemmelige kontrol over biofilm mønstre — en særlig relevant eksempel fremhæve er studiet af mikrobiel økologi i biofilm2. Fremtidige retninger omfatter gøre mønstrede biomaterialer8,9 og/eller struktureret bakterielle samfund. Alternative anvendelser af denne tilgængelig protokol omfatter også bio-art19, givet klart æstetiske potentiale, såvel som formelle og uformelle life science uddannelse20,21,22. Fra et pædagogisk perspektiv, protokollen beskrevet her kombinerer mange relevante teknikker (bakteriekulturen, transformation, optik/optogenetics) og er også modulært forlænges (f.eks.omfatter mikrofluidik).
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne takke D. glas, H. Kim, N. Cira, A. Choksi, S. Rajan og B. nøgler for deres nyttige forslag og Spormann lab for adgang til deres Konfokal mikroskop. Derudover anerkender forfatterne støtten fra Stanford Bio-X Bowes og NSERC PGS stipendier, National Institute of Health (R21-AI-139941), og the American Cancer Society (RSG-14-177-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DH5alpha/pDawn-Ag43 | Addgene | 107742 | DH5alpha cloning strain hosting pDawn-Ag43 plasmid - plasmid needs to be moved to E. coli strain of interest prior to use |
| MG1655 E. coli | Coli Genetic Stock Center - Yale University | CGSC #6300 | MG1655 was used as E. coli strain of interest in this paper's representative results |
| RFP expression plasmid | iGEM biobricks | J04450-pSB4K5bb | Many options exist to obtain fluorescent bacteria - if using plasmid, ensure backbone does not conflict with colE1 ori of pDawn-Ag43 |
| Plasmid miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
| LB broth powder | Affymetrix | 75852 | Add 20 g/L to water, autoclave, add 50 μg/mL spectinomycin to get sterile LB+spec |
| LB agar powder | Affymetrix | 75851 | Add 35 g/L to water, autoclave, add 50 μg/mL spectinomycin, pour into petri dishes to get sterile LB+spec plates |
| Petri dishes | Fisherbrand | 431760 | |
| Spectinomycin hydrochloride pentahydrate | abcam | ab141968 | Make 1000x stock 50mg/mL in water, filter sterilize and dilute into media as needed |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Mix at 1:1 ratio with water, sterilize by autoclave or filter to obtain 50% glycerol |
| M63 media salts 5X solution | Bio-world | 705729 | Add cas-amino acids, glucose and MgSO4, bring to 1X salts concentration by adding sterile water |
| Casamino acids | Amresco | J851 | Make 20% stock in water, filter sterilize and add to M63 as supplement (final concentration 0.1%) |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Make 20% stock in water, filter sterilize and add to M63 as supplement (final concentration 0.2%) |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Make 1 M stock in water, autoclave and add to M63 as supplement (final concentration 1 mM) |
| Crystal violet | Acros organics | 212120250 | Dilute to 0.1% in water prior to use |
| Self-hardening mounting media (Shandon immumount) | Thermo Scientific | 9990402 | Use to preserve samples over long term for fluorescence imaging |
| Phosphate buffered saline (PBS) solution | Gibco | 10010023 | Can also use PBS prepared from powder / tablets |
| 6 well plate | Fisherbrand | 351146 | Used as biofilm culture dish for representative results |
| PDMS kit | Dow | SYLGARD 184 | Can be used to make enclosed microchamber cavities using soft lithography |
| 1 mL syringe | BD syringe | 309659 | For use with liquid handling with enclosed microchambers |
| Blunt tip needle | CML supply | 901-23-050 | Attaches to 1 mL syringe |
| Lab tape | Fisherbrand | 15-901 | Use to attach culture chamber to incubator ceiling |
| Bacterial incubator | Sheldon Manufacturing | SMI6 | Ensure interior height of incubator is tall enough to focus projector at the ceiling |
| Portable projector | Ivation | IV-PJ-PRO-4-1 | Many portable projector models exist, pDawn-Ag43 has been tested with multiple models including LED/laser based, with blue light channel ranging from 450-460nm central wavelength |
| Optical breadboard base | ThorLabs | MSB6 | Base for optical setup to hold projector - many other setups possible, just need to hold projector firmly at bottom of incubator, pointing upwards |
| Optical post | ThorLabs | TR8 | 2 posts needed - one to be set up vertically extending out of breadboard base, one horizontally attached via right-angle clamp |
| Optical post right-angle clamp | ThorLabs | RA90 | Connects vertical and horizontal posts |
| Mounting base | ThorLabs | BA1S | Connects optical breadboard base and vertical post |
| 1/4"-20 screw | ThorLabs | SH25S050 | Attaches vertical post to mounting base, mounting base to breadboard base |
| 1/4"-20 set-screw | ThorLabs | SS25E63D | Connects horizontal post to projector via tripod screw-hole |
| Optical power meter | Newport | 840 | Use with power meter detector to measure projector illumination intensity - many power meter models exist, using one that has extendable detector will facilitate measurement |
| Optical power meter detector | Newport | 818-UV | Connects to power meter (above) - UV detector not strictly necessary as blue light is within visible range |
| Adjustable ND filter | K&F Concept | SKU0689 | Adjustable (by rotating) neutral density filter - place above projector aperture |
| Presentation-projector software | Microsoft | Powerpoint | Any software that allows drawing / presentation will suffice |
| CAD software | Autodesk | AutoCAD | Used for designing photomasks, many mask printing services are compatible with AutoCAD files |
| Film photomask | Fineline Imaging | n/a | Many photomask printer services exist for high resolution (>30000DPI) film photomask printing |
References
- Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M.
- Christensen, B. B., Haagensen, J. A. J., Heydorn, A., Molin, S. Metabolic commensalism and competition in a two-species microbial consortium. Applied and environmental microbiology. 68 (5), 2495-2502 (2002).
- Jin, X., Riedel-Kruse, I. H. Biofilm Lithography enables high-resolution cell patterning via optogenetic adhesin expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (14), 3698-3703 (2018).
- Ohlendorf, R., Vidavski, R. R., Eldar, A., Moffat, K., Möglich, A. From dusk till dawn: one-plasmid systems for light-regulated gene expression. Journal of Molecular Biology. 416 (4), 534-542 (2012).
- Xu, T., et al. Construction of high-density bacterial colony arrays and patterns by the ink-jet method. Biotechnology and Bioengineering. 85 (1), 29-33 (2004).
- Gu, H., Hou, S., Yongyat, C., Detore, S., Ren, D. Patterned Biofilm Formation Reveals A Mechanism for Structural Heterogeneity in Bacterial Biofilms. Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 29 (35), 11145-11153 (2013).
- Davey, M. E., O'Toole, G. A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 64 (4), 847-867 (2000).
- Nguyen, P. Q., Botyanszki, Z., Tay, P. K. R., Joshi, N. S. Programmable biofilm-based materials from engineered curli nanofibres. Nature Communications. 5, 4945 (2014).
- Chen, A. Y., et al. Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells. Nature Materials. 13, 515-523 (2014).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Plasmid Purification. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Introduction to Fluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- Pawley, J. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , Springer Science & Business Media. New York, NY. (2010).
- O'Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. Journal of Visualized Experiments. 47, e2437 (2011).
- JoVE Science Education Database. Bioengineering. Soft Lithography. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461 (7266), 997-1001 (2009).
- Huang, Y., Xia, A., Yang, G., Jin, F. Bioprinting Living Biofilms through Optogenetic Manipulation. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1195-1200 (2018).
- Kac, E. Signs of Life: Bio Art and Beyond. , MIT Press. Cambridge, MA. (2007).
- Lee, S. A., et al. Trap it!: A Playful Human-Biology Interaction for a Museum Installation. Proceedings of the 33rd Annual ACM Conference on Human Factors in Computing Systems. , 2593-2602 (2015).
- Cira, N. J., et al. A Biotic Game Design Project for Integrated Life Science and Engineering Education. PLOS Biology. 13 (3), e1002110 (2015).
- Bybee, R. W. The next generation science standards and the life sciences. Science and Children. 50 (6), 7 (2013).
