Summary
We tonen een methode voor het storten van Escherichia coli bacteriën biofilms in willekeurige ruimtelijke patronen met een hoge resolutie met behulp van optische stimulatie voor een genetisch gecodeerde oppervlak wrijvingscoëfficiënt construct.
Abstract
Ruimtelijke structuur en patronen spelen een belangrijke rol in de bacteriële biofilms. Hier tonen we een toegankelijke methode voor het kweken van E. coli biofilms in willekeurige ruimtelijke patronen met hoge ruimtelijke resolutie. De techniek maakt gebruik van een genetisch gecodeerde optogenetic constructie — pDawn-Ag43 — die biofilm vorming in E. coli paren om optische stimulatie door blauw licht. We detail het proces voor het omzetten van E. coli met pDawn-Ag43, de vereiste optische set-up en het protocol voorbereiding culturing gedessineerde biofilms met behulp van pDawn-Ag43 bacteriën. Met behulp van dit protocol, kan biofilms met een ruimtelijke resolutie onder 25 μm patroon worden op verschillende oppervlakken en omgevingen, met inbegrip van ingesloten chambers, zonder microfabrication, schoon-kamer faciliteiten of ondergrond voorbehandeling. De techniek is handig en geschikt is voor gebruik in toepassingen die onderzoeken van het effect van biofilm structuur, verstrekken van afstembare controle over biofilm patronen. Meer in het algemeen, heeft het ook potentiële toepassingen in biomaterialen, onderwijs en bio-art.
Introduction
Biofilms zijn oppervlak-ingeschrevenen gemeenschappen van microben en staan bekend om hun sterke structuur-functie-koppeling. Ruimtelijke geometrie en patronen van biofilms spelen een belangrijke rol in de algehele gemeenschap functie (en vice versa)1. De kleine lengte schalen die betrokken zijn bij de biofilm structuur — over de volgorde van tientallen micron2— afstembare en handig controle van biofilm patronen een uitdagende probleem maken. Hier tonen we een protocol waarmee voor biofilms te zijn precies patroon in willekeurige geometrieën, gebaseerd op optische verlichting.
Het hier gepresenteerde protocol maakt gebruik van pDawn-Ag433, een optogenetic-constructie waarbij de biofilm vorming in E. coli bacteriën om optische verlichting paren door het rijden van de expressie van Ag43 (een adhesine gen dat verantwoordelijk is voor de oppervlakte hechting en een biofilm vorming) onder de controle van pDawn4 (een transcriptionele regulator gecontroleerd door optische verlichting). De methode is handig in gebruik en kan patroon biofilms op verschillende oppervlakte omgevingen, met inbegrip van de ingesloten (transparant) cultuur kamers. In vergelijking met bestaande cel afzetting methoden, zoals druppel gebaseerde afzetting5 of oppervlak prepatterning/behandeling6, pDawn-Ag43 vereist geen microfabrication of schoon-kamer voorzieningen en vereist geen materialen die verder gaan dan beschikbaar voor een typische microbiologie laboratorium. Is het kundig voor patroon met een ruimtelijke resolutie onder 25 μm, nadert de ruimtelijke dimensies van microcolonies in natuurlijk bestaande biofilms2. Over het geheel genomen, deze techniek biedt de mogelijkheid om te manipuleren van de structuur van de biofilm, die vervolgens opent veel mogelijkheden om te studeren van microecology in bacteriële gemeenschappen7. Gedessineerde biofilms kunnen bovendien een handig platform waarop ingenieur nuttig biomaterialen8,9. In dit document, wij bespreken het basisprotocol die nodig zijn voor de patronen van biofilms met behulp van pDawn-Ag43 en aanpakken van potentiële wijzigingen en probleemoplossing gerelateerde aan de methode.
Protocol
1. bereiding van pDawn-Ag43 bacteriestammen
- PDawn-Ag43 omvormen tot een stam E. coli van belang (Figuur 1).
- Groeien een klonen stam hosting pDawn-Ag43 plasmide (verkrijgbaar bij een plasmide repository) door het enten van de stam in de pond-Bouillon aangevuld met 50 μg/mL spectinomycine (LB + spec) in een buis van de cultuur ('s nachts in een schudden incubator bij ~ 250 omwentelingen per minuut, 37 ° C). Gebruik vervolgens een miniprep kit om te oogsten van de plasmide gezuiverde pDawn-Ag4310.
- Kies een stam E. coli van belang zijn voor het patroon worden. PDawn-Ag43 is tot nu toe geverifieerd om te werken in MG16553 en BW25113.
- Gebruik een gangbaar protocol voor het genereren van bevoegde (b.v., chemisch bevoegde11 of electrocompetent12) voorraden van de gekozen E. coli stam (bijvoorbeeldMG1655).
- PDawn-Ag43-plasmide transformeren in de bevoegde bacteriën11,12, gevolgd door 1 h terugwinning en plaat op LB + spec agar platen. Toestaan van kolonies groeien 's nachts bij 37 ° C.
- Winkel de pDawn-Ag43 getransformeerd stammen.
- Enten van een één kolonie van pDawn-Ag43 van een LB + spec agarplaat in LB + spec Bouillon in een buis van de cultuur en het groeien in een schudden incubator (bij ~ 250 omwentelingen per minuut, 37 ° C) tot exponentiële fase (OD600 ~0.4 - 0.8).
- Voorraad voor het opslaan van de stam van de pDawn-Ag43 omgezet bij-80 ° C op lange termijn door het mengen van 1 mL van de cultuur met 1 mL steriele glycerol van 50% in een cryo-buis te verkrijgen van een 25% glycerol vriezer voorraad voor te bereiden. Bewaar dit in een vriezer-80 ° C.
- Als extra plasmiden (b.v., fluorescerende verslaggever plasmiden) moeten worden omgezet, maken de bevoegde cellen11,12 van de pDawn-Ag43 getransformeerd stam en herhaal het transformatie proces11 , 12 voor de extra plasmiden zoals nodig.
Opmerking: Als electroporation8gebruikt, is het mogelijk om cotransform van meerdere plasmiden (met inbegrip van pDawn-Ag43) tegelijkertijd; echter is een gelijktijdige transformatie niet aanbevolen referentiemethoden chemisch te worden verwerkt, zoals de grote omvang (> 10 kB) van pDawn-Ag43 betekent transformatie efficiëntie worden verlaagd.
2. voorbereiding van de Projector optische Set-up voor verhelderend bacteriën
- Verkrijgen van een bacteriële incubator met niet-transparante muren en een gat voor het doorgeven van kabels, een draagbare projector geschikt voor montage en functioneren binnen de bacteriële incubator, en een laptop uitgerust met software voor presentatie-projectie (Zie tabel van Materialen). Wanneer het kiezen van de projector en de incubator, ervoor zorgen dat de minimale scherpstelafstand van de projector is minder dan de binnenhoogte van de incubator.
- Plaats de projector in de incubator aan de onderkant, met de diafragma wijzen direct naar boven, naar het plafond, waar de biofilm cultuur kamer is gekoppeld (Figuur 2).
- Correctie van de projector in plaats door de aanleg van een installatie met een optische breadboard basis verbonden aan een verticale post, verbonden op zijn beurt met een horizontale post welke schroeven in de projector (Figuur 2). Merk op dat deze set-up kan worden gewijzigd, afhankelijk van de projector/beschikbare onderdelen. Uiteindelijk is het belangrijkste vereiste is dat de projector stevig wordt bevestigd in de buurt van de onderkant van de incubator, met de opening naar boven wijzen.
- Sluit de laptop via de kabel van weergave (bijvoorbeeldHDMI) aan op de projector in de incubator.
- Als de oppervlakken — vooral het plafond — van het interieur van de incubator worden reflecterende (bijvoorbeeldmetalen gepolijste oppervlak), dek ze af met donkere matte oppervlakken te minimaliseren reflecties.
- Tape gebruiken om een lege 'dummy' cultuur schotel hechten aan het plafond van de incubator. Merk op dat, zoals met de projector, er meerdere aanvaardbaar manieren zijn om het koppelen van een schotel van cultuur; Zorg ervoor dat het oppervlak van de transparante onderstuk van de kamer van de cultuur, waar verlichting voorkomt, niet bedekt is.
- De focus op de projector aanpassen door te draaien aan de focus knop zodat het scherpstellen vliegtuig met de onderkant van de schotel van de cultuur van de biofilm (bijvoorbeeldeen goed plaat samenvalt) gekoppeld aan het plafond van de incubator (Figuur 2). De projector moet het verlichten van een scherpe, niet-wazig beeld op de bodem van de schotel cultuur. Verwijder de 'dummy' cultuur schotel zodra de projectie is geoptimaliseerd.
- Laptop softwarematig, direct de projector voor de verlichting van het volledige gezichtsveld met maximale blauwe verlichting (bijvoorbeeldRGB = [0, 0, 255]) door de indiening van een volledige blauwe dia.
- Meet de intensiteit van de verlichting van de projector met behulp van een optische Energiemeter door het hoofd van de foto-elektrische cel plaatsen bij de incubator plafond en de intensiteit van de overeenkomstige Energiemeter gekalibreerd tot licht golflengte 460 nm te lezen. Volg de instructies over het aansluiten en het kalibreren van de foto-elektrische cel voor de specifieke Energiemeter gebruikt.
- Omgevingslicht te verminderen (b.v., kamer lichten uit te schakelen, of de incubator plaats uit de buurt van lichtbronnen) zo veel mogelijk alvorens de verlichting intensiteit metingen.
- Pas de intensiteit van de verlichting met behulp van een verstelbare neutrale-opaciteitsfilter geplaatst op de opening van de projector. Draai het filter om aan te passen van de intensiteit van de verlichtingssterkte gemeten door de Energiemeter, totdat de intensiteit van de verlichting in het midden van de blauw-licht geprojecteerde regio 50 μW/cm2 leest.
Opmerking: Hoewel het mogelijk is om de intensiteit van de verlichting met behulp van lagere blauw RGB-waarden aan de software kant, met behulp van een filter terwijl het maximaliseren van de waarde voor blauw RGB-het voordeel heeft van het maximaliseren van de optische contrast van het systeem tussen verlichte versus. donkere regio's. - Tekenen van willekeurige patronen met behulp van de software van de presentatie/projector op de laptop en deze patronen weergeven op het plafond van de incubator, met behulp van de projector.
Opmerking: Biofilm-vormende regio's moeten worden getekend met maximale blauwe verlichting (bijvoorbeeldRGB = [0, 0, 255]), niet-biofilm-vorming van regio's met geen verlichting (bijvoorbeeldRGB = [0, 0, 0]).
3. het kweken van patroon Biofilms
- Vóór de verlichting, de pDawn-Ag43-bacteriën, vanaf de glycerol vriezer voorraad, zodat ze op betrouwbare wijze worden veroorzaakt in de late fase van de exponentiële groei voor verlichting (figuur 3A) te bereiden.
- Strijk een pDawn-Ag43-stam uit glycerol voorraad op LB + spec agar platen. Toestaan van kolonies groeien overnachting (37 ° C).
Opmerking: Vanaf hier tot de verlichting cultuur stap, zorgen de cellen blijven zo veel mogelijk in het donker — korte perioden op ambient verlichting (bijvoorbeeldvoor subdilution) zijn aanvaardbaar. - Enten van een kolonie van pDawn-Ag43 bacteriën uit een agarplaat in LB + spec Bouillon en groeien de cultuur 's nachts aan de stationaire fase (in een schudden incubator bij ~ 250 omwentelingen per minuut, 37 ° C, voor ~ 16 h).
- Subdilute van de cultuur in een verhouding van 1:1,000 met LB + spec Bouillon (bv1 μL van overnachting cultuur toevoegen aan 1 mL verse LB + spec).
- Laat de subdiluted cultuur te groeien tot de laat-exponentiële/vroeg-stationaire groeifase (OD ~ 1.0, ~ 6 h in een schudden incubator bij ~ 250 omwentelingen per minuut, 37 ° C).
- Tijdens het wachten voor de cultuur te groeien, bereiden M63 media met 1 x M63 zouten, 1 mM MgSO4, 0,2% glucose, 0,1% casamino zuren en 50 μg/mL spectinomycine in water (zorgen voor de samenstellende delen zijn steriel).
- Subdilute de cultuur van de laat-exponentiële-fase bij een verhouding van 1:100 met M63 media aangevuld met 50 μg/mL spectinomycine. De verdunning in een biofilm cultuur schotel vervolgens, in te voeren (bijvoorbeeldhet verdunde monster Pipetteer in een goed plaat).
Opmerking: De hoeveelheden die nodig zijn voor deze 1:100 subdilution hangt de schotel van de cultuur wordt gebruikt (bijvoorbeeld, als met een 6-well polystyreen goed plaat [niet--Weefselkweek behandeld], één sample zou vereisen 20 μL van cultuur aan 2 mL M63 + spec, toe te voegen als de standaard goed volume van een 6-well plaat is ~ 2 mL).
- Strijk een pDawn-Ag43-stam uit glycerol voorraad op LB + spec agar platen. Toestaan van kolonies groeien overnachting (37 ° C).
- Als de monsters nu gereed voor verlichting zijn, tape de cultuur schotel aan het plafond van de incubator, ervoor te zorgen dat het oppervlak aan de onderkant van de schotel transparant voor de verlichting van onderaf door de projector is.
Opmerking: Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat het plafond van de incubator niet reflecterende is, tot een minimum beperken van verdwaalde verlichting. Verdwaalde verlichting kan ook worden verminderd door het gebruik van zwart-ommuurde platen als cultuur gerechten, hoewel dit niet strikt noodzakelijk is — als dergelijke platen gebruikt, controleert de onderkant is transparant. - De biofilms aan cultuur in de incubator's nachts (16 h met geen schudden, bij 37 ° C) toestaan. Merk op dat sommige projectoren minder betrouwbaar bij hogere temperaturen worden. Als dat het geval, houdend cultuur bij lagere temperaturen (bijvoorbeeld30 ° C), in mening dat de incubatietijd worden verhoogd moeten kan, afhankelijk van de stam E. coli .
4. imaging patroon Biofilms
- Na de overnachting groei van de biofilm monsters, de cultuur schotel uit de incubator te verwijderen. Het gerecht zal hebben biofilm bacteriën gekoppeld aan de onderkant, waar het heeft zijn verlicht, evenals planktonische bacteriën verspreid in de vloeibare media hierboven.
- Gooi de planktonische cellen door het verwijderen van het vloeibare media uit de cultuur schotel (bijvoorbeelddoor met een pipet zachtjes zuigen).
- Spoel het monster 2 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) oplossing voor het verwijderen van de resterende planktonische cellen (figuur 3B) door het voorzichtig pipetteren in PBS, gevolgd door aspiratie.
- Als de cellen zijn fluorescently gecodeerd, direct het imago van de monsters met behulp van fluorescentie microscopie13 (b.v., breed-gebied13, 3D-confocale14, enz.).
Opmerking: TL biofilms kunnen ook worden bewaard met behulp van een zelf verharden montage medium. Toepassen van één druppel media een biofilm steekproef te monteren, bedek het met een dekglaasje glas aan, niet te vangen luchtbellen onder, het verzorgen en laten harden's nachts voor imaging. - Als de gebruikte bacteriële cellen fluorescently niet zijn gecodeerd, gelden de kristalviolet vlek techniek15 (figuur 3B) van biofilm contrast verbeteren voorafgaand aan de beeldvorming.
5. protocol wijzigingen/alternatieven
- PDawn-Ag43 bacteriën op verschillende oppervlakken te groeien.
- Glas- of poly-dimethyl-siloxaan (PDMS) kortingsbonnen (bijvoorbeeld, coverslips of dunne reepjes van PDMS) gestoken met goed platen voordat het prestatiemeteritembestand van een bacteriële monster/verlichting, en volg hetzelfde protocol als voorheen naar patroon pDawn-ag43 biofilms op glas en PDMS.
- PDawn-Ag43 bacteriën in een transparante, gesloten cultuur kamer groeien.
- Het genereren van een schimmel cultuur kamer voor PDMS.
- Genereren voor een fundamentele cultuur kamer, schimmel door een harde, rechthoekige Prisma op een plat oppervlak (de prism zal een holte in de PDMS die als de cultuur zaal fungeert zodra de schimmel wordt geworpen worden). Merk op dat meer ingewikkelde cultuur kamer mallen kunnen worden vervaardigd met behulp van zachte lithografie16.
- Een holte PDMS voorstemmen PDMS in de mal gieten en het te genezen (Zie voor een gedetailleerde zachte litho-protocol, JoVE van Science Education Database16).
- Na uitharding trim eventuele overtollige PDMS, punch inlaat/uitlaat kanalen in de bedwelmingsruimte holte/cultuur en de holte op een plat oppervlak (bijvoorbeeld, glas/polystyreen) band door stevig op de PDMS op de vlakke ondergrond, waardoor de holte tussen het oppervlak en het PDMS plafond als de biofilm cultuur kamer.
Opmerking: Meer permanente hechting op basis van plasma behandeling16 kan ook worden gebruikt, maar de chips zal dan niet herbruikbaar zijn. - Volg het protocol van de cultuur als voorheen, met behulp van een spuit met het botte uiteinde naalden (in plaats van een pipet) te introduceren het bacteriële monster in de cultuur kamer/spoelen met PBS buffer (Figuur 3 c).
- Als met een tijdelijk gekleefde Holte, gebruikt u alleen negatieve druk te trekken van de kamer, om ervoor te zorgen dat de holte niet unbonded van het onderliggende oppervlak van het glas/polystyreen tot vloeibare in/out.
- Het genereren van een schimmel cultuur kamer voor PDMS.
- PDawn-Ag43-bacteriën met behulp van een photomask film voor gestructureerde verlichting groeien.
- Het ontwerp van een patroon van de biofilm met behulp van CAD software compatibel is met een film photomask printer/print service. Het ontwerp van de film photomask moeten duidelijk in regio's waar de biofilm is bedoeld om te worden afgedrukt, en zwart/ondoorzichtig elders. Als alles klaar is, het photomask-bestand naar de printer/afdrukservice verzendt en wachten op de terugkeer van de fysieke photomask.
- Instrueren van de projector voor het verlichten van een volledige gezichtsveld met maximale blauwe verlichting (bijvoorbeeldRGB = [0, 0, 255]) laptop softwarematig.
- Knip uit een regio van belangstelling van de grotere photomask van de film, en tape het rechtstreeks naar de onderkant van de biofilm cultuur schotel vóór invoering van het bacteriële monster voor overnachting verlichting (figuur 3D). Cultuur van de biofilms als voorheen en verwijder de photomask na het kweken, voorafgaand aan de beeldvorming.
Representative Results
Zoals te zien in figuur 4A, pDawn-Ag43-bacteriën werden gebruikt voor het genereren van biofilms patroon in polystyreen goed platen met projector verlichting (de projector werd ingesteld op het verlichten van een polka-dot patroon), beeld via helderveld microscopie met kristal Violet vlek als contrast agent, en fluorescentie microscopie met rood-fluorescerende-eiwit-uiting van bacteriën. Fluorescerende biofilm monsters kunnen ook worden beeld met behulp van de confocal microscopie14 te verkrijgen van beelden van de biofilm met 3D-opmaak (figuur 4B). In figuur 4Cillustreren we de high-resolution patronen mogelijk met behulp van een photomask film bieden gedessineerde verlichting aan de biofilm monster. Ten slotte in Figuur 4 d en 4E, we tonen voorbeelden van patronen op glas en PDMS oppervlakken, evenals ingesloten PDMS cultuur chambers — deze illustreren de verschillende soorten omgevingen waar pDawn-Ag43 patronen kan worden toegepast.
Figuur 1: opstelling van pDawn-Ag43-bacteriën (protocol sectie 1). PDawn-Ag43 bacteriën kunnen licht-gereglementeerde biofilm vorming voorbereiding omvat zuiveren van pDawn-Ag43 plasmide vanaf een host klonen stam, transformeren in een stam E. coli van belang en het maken van bacteriële vriezer materieel voor lange termijn opslag. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: voorbereiding van een optische set-up voor de biofilm monster verlichting (protocol sectie 2). De optische set-up is gehuisvest in een bacteriële incubator en bestaat uit een computer verbonden projector verlichten van een biofilm monster. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Cultuur protocol voor patronen biofilms (protocol sectie 3). (A) voorafgaand aan verlichting, pDawn-Ag43-bacteriën zijn bereid vóór patronen zodat ze op betrouwbare wijze worden veroorzaakt in de juiste groeifase. (B) na 's nachts groei verlicht, een patroon biofilm aanwezig zal zijn aan de onderkant van de schotel van cultuur, samen met planktonische cellen in de vloeibare media, en na enkele verdere verwerking, de biofilm is klaar voor de beeldvorming. (C) als een alternatief voor goed platen, biofilms kunnen worden gekweekt in gesloten cultuur kamers zoals een gegoten PDMS holte. In dit geval kunnen spuiten gekoppeld aan botte uiteinde naalden worden gebruikt in te voeren van het monster en spoelen van vloeistoffen uit de zaal. (D) als alternatief voor projector gebaseerde verlichting patronen, patronen kunnen ook worden gegenereerd door taping film fotomaskers rechtstreeks naar de onderkant van biofilm cultuur kamers. In dit geval moet de projector worden ingesteld voor het verlichten van blauw licht over het volledige veld. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: representatieve resultaten van biofilms patroon met behulp van pDawn-Ag43. Alle resultaten werden verkregen met behulp van een stam van de host MG1655 E. coli . (A) pDawn-Ag43 bacteriën werden gebruikt voor het genereren van biofilms patroon in polystyreen goed platen met projector verlichting (de projector werd ingesteld op het verlichten van een polka-dot patroon), beeld via helderveld microscopie met kristalviolet vlek als een contrast agent, en fluorescentie microscopie met rood-fluorescerende-eiwit-uiting van bacteriën. (B) TL biofilm monsters zijn beeld met confocale microscopie verkrijgen van 3D-beelden van de biofilm. (C) met een hoge resolutie biofilms kunnen worden patroon met een photomask van de film te bieden gedessineerde verlichting aan de biofilm monster. (D) Biofilms kunnen worden patroon op glas en PDMS oppervlakken. (E) Biofilms kunnen worden patroon in de gesloten cultuur kamers. Dit percentage is aangepast van eerdere werk3zijn. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Probleem | Mogelijke oorzaken/oplossingen |
| Tranforming pDawn-Ag43 in host strain - geen koloniën | Lage concentratie van de plasmide - plasmide concentratie op spectrometer controleren. Een typische miniprep van pDawn-Ag43 moet opleveren ten minste 100 ng/l; uitputten aan 10-100 ng voor transformatie |
| Selectievakje/remake bevoegde cellen: bevoegde cellen moet transformatie-efficiëntie ten minste 10 ^ 6 cfu/µg geverifieerd met behulp van een standaard plasmide zoals pUC19 - zoniet remake bevoegde cellen | |
| Verkeerd (mate van) antibiotica op LB agarplaat - zorg ervoor dat u 50 μg/mL spectinomycine voor selectie | |
| Projector verlichting schakelt uit / inconsistent's nachts | Uitschakelen problematische software zoals: automatische overnachting software/OS updates, nachtelijke blauw-licht filteren |
| Projector kan worden oververhitting - set incubator op lagere temperatuur, terwijl de projector is ingeschakeld (bijvoorbeeld 30 ° C in plaats van 37 ° C) - Opmerking projector als warmtebron incubator buiten instelpunt oververhitten kan | |
| Verwijder geen onnodige bronnen van vochtigheid uit incubator, zoals deze van invloed kunnen zijn op de projector elektronica | |
| Geen/lage niveaus van biofilm gevormd na nachtelijke verlichting, geen groei van de planktonische cellen ofwel (d.w.z. vloeibare is duidelijk) | Verkeerd (mate van) antibiotica - Maak gebruik van 50 μg/mL spectinomycine |
| Check die alles goed aan M63 recept is toegevoegd | |
| Geen/lage niveaus van biofilm gevormd na nachtelijke verlichting, alleen planktonische cellen (d.w.z. vloeibare is bewolkt) | Controleer licht niveau, projector moet worden verlicht blauw licht op 50 μW/cm ^ 2 bij 460 nm golflengte |
| Probeer te laten bacteriën groeien korter/langer na 1:1000 LB subdilution stap voorafgaand aan toe te voegen aan M63 | |
| Restreak bacteriën op LB plaat, vanaf vers kolonie voor het genereren van overnachting stationaire fase cultuur | |
| Zorgen van de projector is consequent 's nachts werken - zie punt hierboven | |
| Fuzzy biofilm patronen, hoge niveaus van achtergrondgeluiden | Verminderen van strooilicht van optische verlichting systeem, reflecterende oppervlakken op interieur van incubator dekken |
| Overweeg het gebruik van gestructureerde verlichting gebaseerde photomask (in tegenstelling tot projector-gebaseerd) | |
| Controleren van de projector is juist gericht op de onderkant van de biofilm cultuur kamer |
Tabel 1: Common problemen.
Discussion
In het licht van de behoefte aan onderzoekstools waarmee voor biofilm structuur controle, hebben we een easy-to-use-protocol voor de patronen van bacteriële biofilms met behulp van de pDawn-Ag43 optogenetic constructie gepresenteerd. Met deze techniek, kunnen E. coli biofilms optisch worden patroon op verschillende oppervlakte omgevingen, met inbegrip van de bijgevoegde kamers, met een ruimtelijke resolutie onder 25 μm.
Globaal, dit protocol kan worden onderverdeeld in vier secties: (1) de opstelling van de pDawn-Ag43-bacteriën, (2) de opstelling van de optische en cultuur set-up hardware, (3) de pre verlichting bacteriële groei stappen en (4) de post verlichting gespoeld en beeldvorming.
De kritische deel van sectie 1 is de geslaagde transformatie van pDawn-Ag43-plasmide in de E. coli stam van belang. Dit wordt vergemakkelijkt door kwalitatief hoogwaardige gezuiverde plasmide isoleren en het genereren van kwalitatief hoogwaardige bevoegde cellen voor transformatie (tabel 1, probleemoplossing).
Het kritische deel van sectie 2 is de optimalisatie van de set-up van de projector zodat de intensiteit van de verlichting is aangepast aan de 50 μW/cm2 bij de 460-nm golflengte, en de projector juist op de hoogte van de biofilm monster gericht is. Merk op dat in dit protocol, beschrijven we de set-up van een omgekeerde verlichting waar de projector licht van onderaf, omhoog richting de biofilm monster schijnt. Het voordeel van deze opzet is dat het licht maar nodig heeft om te reizen via de onderkant van de schotel cultuur alvorens de biofilm vorming oppervlak. Verlichting uit bovenstaande betekent dat het licht hebben zou om te reizen via de vloeibare media boven het oppervlak van de biofilm, die, in de loop van de groei, bewolkt met planktonische cellen krijgt. Naast deze zorgen, is het ook belangrijk om te minimaliseren van strooilicht in de optische set-up zoveel mogelijk, bijvoorbeeld door het bedekken van reflecterende oppervlakken aan de binnenkant van de incubator — hierdoor scherper gedessineerde biofilms te verkrijgen. Op een verwante nota, kunnen scherper biofilm patronen ook worden verkregen met behulp van een photomask om te controleren van verlichting patronen (figuur 3D, figuur 4C). Veelvoorkomende problemen vereisen probleemoplossing omvatten projector betrouwbaarheidsproblemen bij hogere temperaturen (b.v., 37 ° C), die kunnen worden geminimaliseerd door de biofilm groei bij lagere temperaturen (b.v., 30 ° C) incuberen, evenals computersoftware die zorgt ervoor dat updates van het besturingssysteem of blauw licht filteren tijdens nachtelijke groei (tabel 1). Het is ook belangrijk op te merken dat, afhankelijk van de projector en incubator model gebruikt, het is ook mogelijk dat de warmte van de projector in een hogere binnentemperatuur resulteren zal dan de incubator instellen temperatuur, die mogelijk moet worden gecorrigeerd.
Het kritische deel van hoofdstuk 3 is het verkrijgen van betrouwbare en herhaalbare bacteriële monsters voordat ze door de verlichting worden veroorzaakt. Om deze reden, is het aanbevolen om het verkrijgen van klonen bacteriekolonies pDawn-Ag43 door ze uit op een agarplaat strepen en vervolgens met behulp van de vloeibare cultuur stappen om ervoor te zorgen dat de bacteriën verlicht/veroorzaakte in de late fase van de exponentiële groei in een herhaalbare wijze.
Tot slot, het kritische deel van hoofdstuk 4 is grondig, maar ook zacht, weg te wassen de planktonische cellen die overblijven na de biofilm patronen protocol; Dus, is het aanbevolen om meerdere zachte spoelen stappen met PBS.
In vergelijking met bestaande technieken voor cel patronen5,heeft6, optische biofilm patronen op basis van pDawn-Ag43 een redelijk lage barrière van binnenkomst te gebruiken, in die zin dat het vereist geen microfabrication, schoon-kamer faciliteiten, complex chemie, of de voorbehandeling van het oppervlak, is nog stilstaand kundig voor patroon met de hoge resolutie (25 μm) die doorgaans samenhangen met microfabrication technieken. De methode breidt vorige werk op bacteriële fotolithografie voor het beheersen van gen expressie17. PDawn-Ag43-plasmide is momenteel beperkt tot E. coli, maar het maakt gebruik van een pUC gebaseerde oorsprong van replicatie, pDawn en Ag43 beide compatibel in andere (gramnegatieve) bacteriesoorten zijn. Genetische technieken zijn beschikbaar voor de potentieel invoering van licht-gereglementeerde biofilm vorming aan verschillende bacteriesoorten en vertegenwoordigt een mogelijke richting voor toekomstig onderzoek. Een andere mogelijke beperking van de techniek is dat het werkt door het verhogen van de vorming van de biofilm in stammen met zwakke inheemse biofilm vorming (b.v., MG1655 E. coli). Echter, de stammen met sterke inheemse biofilm vorming hebben biofilms vorm ongeacht verlichting voorwaarden, uitschakeling van patroon biofilm vorming met behulp van pDawn-Ag43 zoals beschreven hier; nog blijken optogenetic technieken nog steeds die van toepassing zijn bij het reguleren van biofilm vorming. Wij stellen vast dat in andere contexten, alternatieve methoden van biofilm patronen beschikbaar, zoals via optische c-di-GMP modulatie18kunnen zijn.
Globaal, pDawn-Ag43 gebaseerd patronen zullen geschikt zijn voor gebruik in toepassingen die onderzoeken van het effect van biofilm structuur op functie1 en dus kon profiteren van afstembare controle over biofilm patronen — een bijzonder relevant in het volgende voorbeeld wil is de studie van microbiële ecologie in biofilms2. Toekomstige richtingen omvatten maken patroon biomaterialen8,9 en/of gestructureerde bacteriële Gemeenschappen. Alternatieve toepassingen van dit toegankelijk protocol ook bio-art19, gegeven het duidelijke esthetische potentieel, evenals de biowetenschappen formele en informele onderwijs20,21,22. Vanuit educatief oogpunt, het protocol hier beschreven combineert vele relevante technieken (bacteriële cultuur, transformatie, optica/optogenetics) en is ook modulair uitbreidbaar (b.v.microfluidics omvatten).
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken D. glas, H. Kim, N. Cira, A. Choksi, S. Rajan en B. sleutels voor hun nuttige suggesties en het Spormann-laboratorium voor toegang tot hun confocal microscoop. Bovendien, de auteurs erkennen de steun van Stanford Bio-X Bowes en NSERC PGS-beurzen, het National Institute of Health (R21-AI-139941) en de American Cancer Society (RSG-14-01-177).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DH5alpha/pDawn-Ag43 | Addgene | 107742 | DH5alpha cloning strain hosting pDawn-Ag43 plasmid - plasmid needs to be moved to E. coli strain of interest prior to use |
| MG1655 E. coli | Coli Genetic Stock Center - Yale University | CGSC #6300 | MG1655 was used as E. coli strain of interest in this paper's representative results |
| RFP expression plasmid | iGEM biobricks | J04450-pSB4K5bb | Many options exist to obtain fluorescent bacteria - if using plasmid, ensure backbone does not conflict with colE1 ori of pDawn-Ag43 |
| Plasmid miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
| LB broth powder | Affymetrix | 75852 | Add 20 g/L to water, autoclave, add 50 μg/mL spectinomycin to get sterile LB+spec |
| LB agar powder | Affymetrix | 75851 | Add 35 g/L to water, autoclave, add 50 μg/mL spectinomycin, pour into petri dishes to get sterile LB+spec plates |
| Petri dishes | Fisherbrand | 431760 | |
| Spectinomycin hydrochloride pentahydrate | abcam | ab141968 | Make 1000x stock 50mg/mL in water, filter sterilize and dilute into media as needed |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Mix at 1:1 ratio with water, sterilize by autoclave or filter to obtain 50% glycerol |
| M63 media salts 5X solution | Bio-world | 705729 | Add cas-amino acids, glucose and MgSO4, bring to 1X salts concentration by adding sterile water |
| Casamino acids | Amresco | J851 | Make 20% stock in water, filter sterilize and add to M63 as supplement (final concentration 0.1%) |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Make 20% stock in water, filter sterilize and add to M63 as supplement (final concentration 0.2%) |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Make 1 M stock in water, autoclave and add to M63 as supplement (final concentration 1 mM) |
| Crystal violet | Acros organics | 212120250 | Dilute to 0.1% in water prior to use |
| Self-hardening mounting media (Shandon immumount) | Thermo Scientific | 9990402 | Use to preserve samples over long term for fluorescence imaging |
| Phosphate buffered saline (PBS) solution | Gibco | 10010023 | Can also use PBS prepared from powder / tablets |
| 6 well plate | Fisherbrand | 351146 | Used as biofilm culture dish for representative results |
| PDMS kit | Dow | SYLGARD 184 | Can be used to make enclosed microchamber cavities using soft lithography |
| 1 mL syringe | BD syringe | 309659 | For use with liquid handling with enclosed microchambers |
| Blunt tip needle | CML supply | 901-23-050 | Attaches to 1 mL syringe |
| Lab tape | Fisherbrand | 15-901 | Use to attach culture chamber to incubator ceiling |
| Bacterial incubator | Sheldon Manufacturing | SMI6 | Ensure interior height of incubator is tall enough to focus projector at the ceiling |
| Portable projector | Ivation | IV-PJ-PRO-4-1 | Many portable projector models exist, pDawn-Ag43 has been tested with multiple models including LED/laser based, with blue light channel ranging from 450-460nm central wavelength |
| Optical breadboard base | ThorLabs | MSB6 | Base for optical setup to hold projector - many other setups possible, just need to hold projector firmly at bottom of incubator, pointing upwards |
| Optical post | ThorLabs | TR8 | 2 posts needed - one to be set up vertically extending out of breadboard base, one horizontally attached via right-angle clamp |
| Optical post right-angle clamp | ThorLabs | RA90 | Connects vertical and horizontal posts |
| Mounting base | ThorLabs | BA1S | Connects optical breadboard base and vertical post |
| 1/4"-20 screw | ThorLabs | SH25S050 | Attaches vertical post to mounting base, mounting base to breadboard base |
| 1/4"-20 set-screw | ThorLabs | SS25E63D | Connects horizontal post to projector via tripod screw-hole |
| Optical power meter | Newport | 840 | Use with power meter detector to measure projector illumination intensity - many power meter models exist, using one that has extendable detector will facilitate measurement |
| Optical power meter detector | Newport | 818-UV | Connects to power meter (above) - UV detector not strictly necessary as blue light is within visible range |
| Adjustable ND filter | K&F Concept | SKU0689 | Adjustable (by rotating) neutral density filter - place above projector aperture |
| Presentation-projector software | Microsoft | Powerpoint | Any software that allows drawing / presentation will suffice |
| CAD software | Autodesk | AutoCAD | Used for designing photomasks, many mask printing services are compatible with AutoCAD files |
| Film photomask | Fineline Imaging | n/a | Many photomask printer services exist for high resolution (>30000DPI) film photomask printing |
References
- Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M.
- Christensen, B. B., Haagensen, J. A. J., Heydorn, A., Molin, S. Metabolic commensalism and competition in a two-species microbial consortium. Applied and environmental microbiology. 68 (5), 2495-2502 (2002).
- Jin, X., Riedel-Kruse, I. H. Biofilm Lithography enables high-resolution cell patterning via optogenetic adhesin expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (14), 3698-3703 (2018).
- Ohlendorf, R., Vidavski, R. R., Eldar, A., Moffat, K., Möglich, A. From dusk till dawn: one-plasmid systems for light-regulated gene expression. Journal of Molecular Biology. 416 (4), 534-542 (2012).
- Xu, T., et al. Construction of high-density bacterial colony arrays and patterns by the ink-jet method. Biotechnology and Bioengineering. 85 (1), 29-33 (2004).
- Gu, H., Hou, S., Yongyat, C., Detore, S., Ren, D. Patterned Biofilm Formation Reveals A Mechanism for Structural Heterogeneity in Bacterial Biofilms. Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 29 (35), 11145-11153 (2013).
- Davey, M. E., O'Toole, G. A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 64 (4), 847-867 (2000).
- Nguyen, P. Q., Botyanszki, Z., Tay, P. K. R., Joshi, N. S. Programmable biofilm-based materials from engineered curli nanofibres. Nature Communications. 5, 4945 (2014).
- Chen, A. Y., et al. Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells. Nature Materials. 13, 515-523 (2014).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Plasmid Purification. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Introduction to Fluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- Pawley, J. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , Springer Science & Business Media. New York, NY. (2010).
- O'Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. Journal of Visualized Experiments. 47, e2437 (2011).
- JoVE Science Education Database. Bioengineering. Soft Lithography. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461 (7266), 997-1001 (2009).
- Huang, Y., Xia, A., Yang, G., Jin, F. Bioprinting Living Biofilms through Optogenetic Manipulation. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1195-1200 (2018).
- Kac, E. Signs of Life: Bio Art and Beyond. , MIT Press. Cambridge, MA. (2007).
- Lee, S. A., et al. Trap it!: A Playful Human-Biology Interaction for a Museum Installation. Proceedings of the 33rd Annual ACM Conference on Human Factors in Computing Systems. , 2593-2602 (2015).
- Cira, N. J., et al. A Biotic Game Design Project for Integrated Life Science and Engineering Education. PLOS Biology. 13 (3), e1002110 (2015).
- Bybee, R. W. The next generation science standards and the life sciences. Science and Children. 50 (6), 7 (2013).
