Summary
Denne protokol beskriver produktion af en mus ekstrahepatisk galdegang 3-dimensionel organoid system. Disse biliær organoids kan opretholdes i kultur til at studere cholangiocyte biologi. Biliær organoids express markører for både Stamform og galde celler og er sammensat af polariseret epitelceller.
Abstract
Cholangiopathies, som påvirker ekstrahepatisk galdeveje (EHBDs), omfatter biliær atresi, primær skleroserende cholangitis og leverkræft. De har ingen effektive terapeutiske muligheder. Værktøjer til at studere EHBD er meget begrænset. Vores formål var at udvikle et orgel-specifikke, alsidig, voksne stamceller-afledt, prækliniske cholangiocyte model, der nemt kan genereres fra vildtype og gensplejsede mus. Dermed, vi rapport om den nye teknik for at udvikle en EHBD organoid (EHBDO) kultur system fra voksne mus EHBDs. Modellen er omkostningseffektiv, kunnet analyseres let, og har flere downstream programmer. Specifikt, beskrive vi metoden i mus EHBD isolation og enkelt celle dissociation, organoid kultur indledning, formering, og langsigtet vedligeholdelse og opbevaring. Dette manuskript beskriver også EHBDO behandling for immunhistokemi, fluorescerende mikroskopi og mRNA overflod kvantitering af real-time kvantitativ reverse transkription polymerase kæde reaktion (qRT-PCR). Denne protokol har betydelige fordele ud over producerer EHBD-specifikke organoids. Brug af en konditioneret medium fra L-WRN celler reducerer omkostningerne ved denne model. Brugen af musen EHBDs giver næsten ubegrænsede væv for kultur generation, i modsætning til humant væv. Genereret mus EHBDOs indeholde en ren population af epitelceller med markører for endodermal Stamform og differentieret biliær celler. Kulturperler organoids bevare homogene morfologi gennem flere passager og kan inddrives efter en langvarig oplagringsperiode i flydende kvælstof. Modellen giver mulighed for undersøgelse af galde stamfader celleproliferation, kan manipuleres farmakologisk og kan genereres fra gensplejsede mus. Fremtidige undersøgelser er nødvendige for at optimere dyrkningsbetingelserne for at øge plating effektivitet, evaluere funktionelle celle modenhed og direkte Celledifferentiering. Udvikling af fælles kultur modeller og en mere biologisk neutral ekstracellulære matrix er også ønskelig.
Introduction
Cholangiopathies er uhelbredelig kronisk progressive lidelser, der påvirker biliær celler beliggende i intra- og ekstrahepatisk galdeveje kanalerne (EHBDs)1. Nogle cholangiopathies, som primær skleroserende cholangitis, leverkræft, biliær atresi og choledochal cyster, påvirker overvejende EHBDs. Udviklingen af terapier for cholangiopathies er begrænset af de begrænsede mængder af prækliniske modeller. Derudover tidligere undersøgelser fokuseret på cholangiopathies grupperet sammen: lever, intra- og EHBDs. Dog intra- og EHBDs har en særskilt embryonale oprindelse og, derfor, bør betragtes som særskilte molekylære patologier. Intrahepatisk galdegangene udvikle fra intrahepatisk duktalt pladerne og den kranielle del af hepatisk divertikel, hele EHBDs udvikle sig fra den caudale del af hepatisk divertikel2. De er også afhængige af forskellige stamfader celle rum til voksen homøostase, herunder kanaler af Hering i intrahepatisk galdegangene og peribiliary kirtler i EHBDs2,3. Brug af dyremodeller for prækliniske undersøgelser er begrænset af udgift og skal være minimeret af etiske grunde. Reduktionistisk, reproducerbar, tid og omkostninger-effektiv in vitro-modeller er derfor meget ønskeligt.
De fleste tidligere undersøgelser af cholangiopathies udnyttede normal mus eller rotte kræftmodeller eller menneskelige leverkræft cellelinjer udvundet af intra- og EHBDs4,5,6,7. Men disse er modeller af transformerede celler og sammenfatte ikke normale cholangiocyte biologi på homøostase eller i en sund tilstand. De seneste fremskridt i udviklingen af organotypic kultur modeller har tilladt udvikling af 3-dimensionelle strukturer fra forskellige vævstyper, herunder hepatobiliære væv, men ikke normal mus EHBDs8,9, 10. Disse "orgel-lignende" strukturer sigter mod at efterligne primære væv og dyrkes i en kunstig niche støtte selvfornyelse orgel-specifikke stilk/stamfader celler11.
"Organoid" er en bred sigt der mest almindeligt beskriver 3-dimensionelle væv modeller fremstillet af stamceller. Organoids kan genereres fra omprogrammeret pluripotente stamceller repræsenteret af embryonale stamceller og induceret pluripotente stamceller. De kan også genereres fra orgel-specifikke voksne stamceller12. Nogle cholangiocyte organoid modeller er blevet foreslået i tidligere undersøgelser. Således organoids stammer fra humane pluripotente stamceller har været rapporteret7,9,13 og give et værdifuldt, tid effektivt værktøj, der giver mulighed for den samtidige generation af forskellige celletyper. Men disse pluripotente stamceller-afledt organoids ikke fuldt ud afspejler struktur og funktionalitet af primære voksne EHBD cholangiocytes.
Organoids stammer fra voksne stamceller af den menneskelige9 og feline10 lever blev også foreslået. Feline modeller er ikke almindeligt tilgængelig og har begrænset værktøj angrebsformål henblik på studier. Desuden, disse leveren-afledte voksne stamceller-afledt organoids ikke model ekstrahepatisk cholangiocytes men snarere intrahepatisk cholangiocytes.
EHBD organoid generation blev rapporteret fra menneskers normale EHBDs14 og mus EHBD leverkræft15. Dog adgang til menneskelige EHBD væv er yderst begrænset, og organoids stammer fra en genetisk murine model af leverkræft15 repræsenterer ikke sund cholangiocyte biologi på homøostase og er afledt af genetisk modificerede celler.
For at løse begrænsningerne af pluripotente stamceller og leveren afledt cholangiocyte organoid modeller og den begrænsede adgang til humane væv i prækliniske modeller, udviklet vi en murine EHBD organoid model (figur 1A). Dette manuskript beskriver udviklingen af en teknik til mus EHBD-afledte organoids fra voksne væv. Disse EHBD organoids opkaldt EHBDOs vil være et vigtigt in vitro-værktøj til studiet af mekanismerne bag EHBDs cholangiocyte homeostase og sygdom processer, såsom cholangiopathies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) af The University of Michigan.
1. fremstilling af udstyr og materialer til mus EHBD Isolation
- Forberede seeding medium og vask buffer (Table of Materials) i 50 mL koniske rør og holde dem ved 4 ° C eller på is indtil brug.
- Oprette en kirurgisk tabel (figur 1B). Forberede steriliseret kirurgiske instrumenter (figur 1 c).
- Placer en steril 24-godt plade i 37 ° C vævskultur inkubator at pre varme det.
- Anbringes en alikvot af kælderen matrix på is. Bruge kælderen matrix, kun når det er helt flydende.
2. EHBD Isolation og galde Organoid kultur
-
Isolation og forberedelse af en enkelt cellesuspension af musen EHBD
- Aflive en voksen mus (ældre end 2 måneder) efter de institutionelle retningslinjer. Placere musen i en liggende stilling. Åbn bughulen bruger en midterlinjen tilgang og trække leveren til at hvile på mellemgulvet.
- Identificere fælles galdegang placeret umiddelbart under leveren hilum af forsigtigt trække den proksimale duodenum med et hemostat. Adskille EHBD fra omkringliggende væv ved hjælp af en skalpel klinge. Holder den proksimale ende af fælles galdegang med pincet, dissekere det distalt lige over sin situation med duodenum, så dissekere den proksimale ende af kanalen fra leveren (fig. 1 d). Umiddelbart Placer isoleret EHBD (figur 1E) til kold vask buffer.
- Fjerne EHBD fra vask buffer og hakkekød i 0,5 mm sektioner ved hjælp af en steril skalpel klinge. Placer vævet på en glasplade på isen under proceduren (figur 1B).
- Placer afsnittene EHBD ind i et rør, der indeholder 500 µL af dissociation buffer. Inkuber i 20 min ved 37 ° C. Neutralisere dissociation buffer ved at tilføje 500 µL af iskold cellekulturmedium.
- Hakkede cellesuspension op og ned ad forløber gennem 18 G og 20 G nåle, 20 gange hver. Filtrere cellesuspension gennem en 70 µm celle si og indsamle gennemstrømnings i en 50 mL tube.
Bemærk: Pre betingelse si med 500 µL sterilt fosfatbufferet saltopløsning (PBS) inden filtreringen for at lette passagen af cellesuspension.
-
Oprettelse af EHBD organoids
- Centrifuge gennemstrømnings-fra skridt 2.1.5 på 300 x g i 5 min. ved 4 ° C.
- Fjern forsigtigt supernatanten. Resuspend celler i 1 mL iskold steril PBS. Overføre ophvirvling ind i en ny 1,5 mL rør. Gentag trin 2.2.1.
- Efter centrifugering, forsigtigt fjerne supernatanten fra vasket celler indsamlet nederst tube. Resuspenderes celle i 120 µL af flydende iskolde kælderen matrix af pipettering op og ned ved hjælp af P200 tips.
Bemærk: Celle pellet resuspension i kælderen matrix har skal udføres på is-bad. - Plade 40 µL af celle resuspension i kælderen matrix ind i midten af en brønd i en pre varmede 24-godt plade.
Bemærk: Undgå sugning luft mens manipulere kælderen matrix for at forhindre boble dannelse. - Returnere pladen med celler genopslemmes i kælderen matrix til 37 ° C vævskultur inkubator for 15 min eller indtil kælderen matrix er størknet. Tilføje 600 µL af seeding mediet varmes op til 37 ° C til hver brønd (Tabel af materialer). Returnere pladen til 37 ° C vævskultur inkubator.
- Erstatte den seeding medium med 600 µL af næringssubstratet friske organoid i 3 dage og hver 3 dage derefter. Overvåge organoid vækst med en inverteret mikroskop. Brug organoids for en downstream ansøgning eller split hver 7-9 dage før ophobning af intraluminal snavs og organoid sammenbrud er observeret (figur 2A).
3. EHBD Organoid Passage og opbevaring
-
Passage af EHBD organoids 1:3 til 1:4 hver 7-9 dage
- Fjern mediet fra brønden og tilsæt 400 µL af iskold PBS. Resuspend organoids af forsigtigt pipettering blandingen op og ned 10 gange i brønden. Overfør blandingen til en 1,5 mL tube.
- Passage blandingen gennem en 25 G nål 4 gange for at adskille organoids. Centrifugeres blandingen på 400 x g i 4 min. ved 4 ° C.
- Fjern forsigtigt supernatanten og resuspend celler i kælderen matrix (1:3 til 1:4) for yderligere dyrkning (trin 2.2.4.) eller vaske cellerne med is kold PBS til videreforarbejdning.
Bemærk: Typisk, 250-300 celler er belagt i 24-godt pladen for efterfølgende ansøgninger. Plating effektivitet kan vurderes af lysfelt mikroskopi ved hjælp af en omvendt mikroskop på dag 3-5 efter passaging ved at tælle antallet af organoids og beregning af deres procent fra første celle nummer. mRNA kan isoleres fra EHBDOs vasket i PBS ved hjælp af standard-protokol ved hjælp af guanidinium kaliumthiocyanat-phenol-chloroform udvinding.
-
Langtidsopbevaring af EHBD organoids
- Fjern mediet fra brønden og vaske organoids med stuetemperatur PBS. Fjerne PBS fra brønden uden at forstyrre kælderen matrix drop.
- Tilsættes 500 µL af iskold celle frysning medium til brønden. Forsigtigt resuspend organoids i flydende kælderen matrix og celle frysning medium og Overfør blandingen til kryogene hætteglas.
- Gemme hætteglas ved-80 ° C for 48 h. overførsel hætteglas til en nitrogen tank til langtidsopbevaring i en damp fase.
4. EHBD Organoid Pprocessing til Paraffin indlejring
- Resuspend EHBDOs i 500 µL af iskold PBS (4 ° C) af pipettering op og ned 5 til 10 gange. Indsamle resuspenderede EHBDO i flydende kælderen matrix i en 1,5 mL tube.
Bemærk: At undgå at bryde organoids, afbrød nederst 2-3 mm af en P1000 tip og Fjern supernatanten meget omhyggeligt. - Centrifuge EHBD organoids på 350 x g i 5 min. Fjern forsigtigt supernatanten uden at forstyrre organoid pellet.
- 1 mL iskold 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) tilsættes til organoids og inkuberes organoids i 4% PFA natten over ved 4° C. Fjern 4% PFA fra organoids ved hjælp af en P1000 tip efter natten inkubation.
- Tilføje 1000 µL af stuetemperatur PBS til røret med organoids og inkuberes i 5 min. ved stuetemperatur (RT). Centrifugeres tube med organoids i PBS på 350 x g i 5 min. Gentag processen to gange mere.
- Fjern PBS og tilsæt 1 mL 30% ethanol til organoids. Inkuber i 5 min på RT.
- Der centrifugeres tube på 350 x g i 5 min på RT. Fjern 30% ethanol. Der tilsættes 1 mL af 70% ethanol, og der inkuberes i 5 min på RT.
- Centrifugate ved 350 x g i 5 min. Fjern 70% ethanol. Der tilsættes 1 mL 100% ethanol, og der inkuberes i 5 min på RT.
Bemærk: Organoids kan holdes i 100% ethanol ved stuetemperatur i op til 48 timer før videre behandling. - Varme modellen behandling gel i en mikrobølgeovn til 20 s eller indtil flydende. Tilsæt 50 µL af prøven behandling gel i tube med organoids. Røret anbringes på is, indtil prøven behandling gel er størknet.
- Fjern dråbe af modellen behandling gel med organoids fra røret og placere mellem blå svamp puderne i en kassette til videreforarbejdning i væv processor. Bruge 15 min til hvert trin i paraffin embedder under videre forarbejdning...
- Afsnit paraffin-embedded organoids i modellen behandling gel på 4 µm. Fortsæt med immunhistokemisk farvning som tidligere beskrevet16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vores protokol beskriver generation af mus EHBD organoids, der er vævet-specifikke og voksne stamceller-afledt. Efter at organoids er kulturperler, kan en cystisk struktur dannelse observeres så tidligt som 1 dag efter EHBD isolationen. Forurening med fibroblaster er ikke typisk iagttaget under kultur generation. EHBDO plating effektivitet er ca 2% når isoleret fra enten neonatal eller voksne (ældre end 2 måneder) mus (figur 2B). Plating effektivitet af EHBD organoids stammer fra voksne mus stiger til 11% i passage 2 og forbliver stabil (figur 2B). Fleste af organoids vise cystisk morfologi gennem alle passager med sjældne "uregelmæssige" organoids (figur 2 c-E). Organoids nå en vækst højdepunkt på 5-7 dage hvorefter de begynde at akkumulere intraluminal debris og forværres (figur 2A). Derfor, for vedligeholdelse af organoid kultur, de bør opdeles hver 7-10 dage (figur 2A). Når etableret og behørigt behandlet, kan organoids opretholdes i kultur næsten uendelige (kulturer blev observeret op til 14 måneder). For at undgå kultur fremførte kontaminering med differentierede celler fra første celle isolation, brug organoids passaged mindst to gange før du bruger dem for en downstream ansøgning. Til langtidsopbevaring, bruge tidligere passage (op til passage 7) organoids, da de har højere plating effektivitet efter genopretning fra opbevaring.
Når analyseret med immunofluorescens, består EHBDOs af en ren population af epitelceller præget af E-cadherin (figur 3A-C). Organoid celler demonstrere markører af galde stamceller (pancreas og Duodenal HOXD 1 (PDX1); Figur 3A) samt markører for galde differentiering (cytokeratin 19 (CK19) og Sex-bestemmende Region Y-rubrik 9 (SOX9); Figur 3B, C). Vigtigere, en høj procentdel af organoid celler besidder en primær cilium præget af acetyleret α-tubulin (a-AT; Figur 3D), som er en funktion af normale cholangiocytes, og foreslår passende organoid celle polarisering. Udtryk af markører for stamfader (Pdx1) og galde differentierede celler [Ck19, Sox9, Aquaporin 1 (Aqp1), cystisk fibrose Transmembrane ledningsevne Regulator(Cftr)] kan bekræftes også ved real-time kvantitativ reverse transkription polymerase kæde reaktion (qRT-PCR) (tabel 1). Kombinationen af disse markører er karakteristisk for cholangiocytes i EHBDs14,17,18.
Sammenfattende denne protokol beskriver generation af en organoid kultur model af polariseret galde epitelceller udtrykker Stamform og differentieret markører. Dette system kan opretholdes i kultur i længere tid uden ændringer i morfologi, gemt langsigtet, og analyseret med Immunhistokemi og qRT-PCR.
Figur 1 : Skematisk EHBD organoid kultur generation og kirurgisk sæt up. (A). skematisk af EHBD organoid generation. (B). kirurgisk område var indstillet til EHBD isolation og omfattede en glasplade (stiplet linje) holdes på en Isbak på alle tidspunkter. (C). steril kirurgiske udstyr inkluderet skarpe saks, lige og buede savtakket pincet, hemostat og skalpel. (D og E) EHBD er isoleret fra de omkringliggende bindevæv og pancreas væv efterfulgt af omhyggelig dissektion proksimalt fra den intrahepatisk galdegangene, og leveren (D, pil) og distalt fra duodenum (D, pil). Linealmærker = 1 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : EHBDO kultur. (A). mikroskopiske billeder af EHBDOs over en 12-dages kursus. (B). Plating effektivitet af organoids stammer fra den neonatale (2 mus pr. kultur, n = 3 kulturer) og voksne (> 2 måneder gamle, 1 mus pr. kultur, n = 3 kulturer) mus efter plating 300 celler pr. brønd i 24-godt plade og optælling etableret organoids på dag 5 af kultur. (C og D) EHBDO cystisk versus uregelmæssige morfologi blev analyseret ved mikroskopi. (E). procentdelen af cystisk og uregelmæssige formede organoids blev analyseret i tidligt (< 10) og slutningen (≥10) organoid passager. Skalere barer = 500 µm. kvantitative data viste som middel +/-standard fejl af middelværdien (SEM), t-test. NS = ikke betydelig. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : EHBDOs express markører for Stamform og modne biliær celler. (A-C). EHBDOs blev analyseret ved immunfluorescens farvning for markører epitel (A, B. E-cadherin, red), stamfader (A. PDX1, green), og differentieret (B. CK19, grøn; og C. a AT, rød) biliær celler. Skalere barer = 25 µm. *, lumen. (D). EHBDOs blev analyseret for overflod af Pdx1, Ck19, Sox9, Aqp1og Cftr mRNA af qRT-PCR (gennemsnit +/-SEM i forhold til udtryk af Hprt). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Gen | Stammesamlingsnummer | Primer sekvens | Produktstørrelse | ||
| Hprt | NM_013556 | Videresende 5'-AACTTGCGCTCATCTTAGGCTTTG-3' | 173 bp | ||
| Omvendt 5'-AGGACCTCTCGAAGTGTTGGATAC-3' | |||||
| Pdx1 | NM_008814 | Videresende 5'-GAATTCCTTCTCCAGCTCCA-3' | 133 bp | ||
| Omvendt 5'-GATGAAATCCACCAAAGCTCA-3' | |||||
| Sox9 | NM_011448 | Videresende 5'-TCCACGAAGGGTCTCTTCTC-3' | 107 bp | ||
| Omvendt 5'-AGGAAGCTGGCAGACCAGTA-3' | |||||
| Ck19 | NM_008471 | Videresende 5'-TCTGAAGTCATCTGCAGCCA-3' | 133 bp | ||
| Omvendt 5'-ACCCTCCCGAGATTACAACC-3' | |||||
| Aqp1 | NM_007472 | Videresende 5'-CAGTACCAGCTGCAGAGTGC-3' | 112 bp | ||
| Omvendt 5'-CATCACCTCCTCCCTAGTCG-3' | |||||
Tabel 1: primere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette arbejde beskriver generation af en organotypic 3-dimensional model af mus EHBD cholangiocytes. Vigtigt skridt i EHBDO kultur generation omfatter omhyggelige EHBD dissektion for at undgå bugspytkirtlen celle kontaminering, vedligeholdelse i sterile forhold at undgå bakterie- og svampeinfektioner forurening og omhyggelig manipulation efter centrifugering at undgå den tab af cellulære materiale. Der kræves en nøje overholdelse af beskrevet temperaturforhold. Der er nogle begrænsninger for teknikken. EHBDs af voksen mus er små (ca. 1 mm i diameter; Figur 1E), som kræver finesse til isolation. Dissektion mikroskop kan bruges til at hjælpe med dissektion.
Kælderen matrix bruges i denne protokol er en biologisk matrix, der indeholder kendte og ukendte vækstfaktorer19, koncentrationen af som kan variere fra parti til parti. Vi anbefaler, at det samme parti og/eller alikvot af kælderen matrix for tekniske replikater, bruges til at undgå variabilitet. Vi anbefaler også rutinemæssigt kontrollere L-WRN cellekultur for mycoplasma forurening og konditioneret medium for WNT aktivitet11. Laboratoriet for denne undersøgelse bruges en Mycoplasma detection kit og WNT aktivitet assay henholdsvis. Især, indeholder EHBDOs medium lavt beløb af føtal bovint serum (0,5%; Tabel over materialer).
Den præsenterede protokol beskriver en 3-dimensional epitelcelle kultur celler med inspirator og opdelte celle markører karakteristisk for cholangiocytes og dannede WNT3a, R-spondin1 og Noggin vækstfaktorer og defineret kosttilskud (Tabel af materialer). Det er orgel-specifikke, som det er afledt af voksen mus EHBDs. Det er sandsynligvis stammer fra voksne celler med stamcelle egenskaber fremgår af celle selvorganisering i 3-dimensionelle strukturer og evnen til at være opretholdt og udvidet langsigtede. Organoids er hovedsageligt cystisk struktur med minimal "spirende,", som kan indikere en mere stamcelle-lignende organoid fænotype. Det er muligt, at yderligere stamcelle niche faktorer kan føre til en højere plating effektivitet af organoids, samt en højere grad af differentiering.
Vores teknik producerer en 3-dimensionel organoid kultur, der kan genereres på en gang - og omkostningseffektiv måde, der minimerer brug af dyr, er meget reproducerbare og tillader flere downstream programmer. Dette nye værktøj er vigtigt for EHBD undersøgelser, da redskaberne til at studere voksne EHBDs er meget begrænset. Det ville være af særlige fordele til laboratorier, der ikke har adgang til humane væv eller ønsker at drage fordel af genetisk modificerede musemodeller.
Musen væv, i modsætning til humant væv, er meget tilgængelig. Der er flere reagenser, herunder Immunhistokemi antistoffer for at studere mus væv. Udgifterne til reagenser til kultur voksen væv organoids faldet betydeligt, da denne teknik blev oprindelig indført. Derudover er nye materialer blevet tilgængelige, herunder den L-WRN celle aircondition medium anvendes i denne protokol, hvilket yderligere reducerer organoid kultur omkostninger. EHBDOs er nem at overføre, lagre og bearbejde til analyse. Den immunhistokemiske, mikroskopiske, og qRT-PCR analyser præsenteres som eksempler i dette håndskrift. Derudover er vores gruppe for nylig beskrevet generation og brug af EHBDOs fra gensplejsede mus og kvantitering af EHBDO celleproliferation bruger 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU)16.
Potentielle downstream anvendelser af EHBDOs omfatter, men er ikke begrænset til dyrkning af en næsten ubegrænset mængde af cholangiocytes til at undersøge mekanismerne i EHBD cholangiocyte homeostase. Fremover vil kan denne protokol anvendes til studiet af sygdomstilstande; at teste cholangiocyte organoids, herunder analyse af regenerativ medicin (intrabiliary implantation), genetiske og farmakologisk manipulation, drug test16; og at studere virkningerne af smitstoffer12,20. Celle-celle interaktion kan studeres ved hjælp af fælles kultur af EHBD organoids med andre celler typer21.
Mus-afledte organoids kan bruges til pilotundersøgelser før generation af menneskelige EHBDOs, da humant materiale er værdifulde og begrænset. Fremtidige undersøgelser fokuseret på opdagelsen af faktorer, der fremmer højere plating effektivitet og organoid celledifferentiering er ønsket om undersøgelse af menneskelige organoids. Igangværende undersøgelser, at søge efter en mere biologisk neutral ekstracellulære matrix for organoid kultur er også relevante for EHBDOs kultur raffinement.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af den amerikanske Association for undersøgelse af lever sygdomme Pinnacle award (til Nielsen) og National Institutes of Health, nationale Institut for Diabetes og Digestive og nyresygdomme (awards P30 DK34933 til Nielsen, P01 DK062041 til J.L.M.). Vi takker Dr. Ramon Ocadiz-Ruiz (University of Michigan) for hans hjælp til udviklingen af denne metode.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-WRN cell culture medium | |||
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 1% | Life Technologies | 10437-028 |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| Washing buffer | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | 50 mL | Life Technologies | 10010-023 |
| Penicillin-Streptomycin | 125 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| Amphotericin B | 6.25 µg/mL | Life Technologies | 15290-018 |
| Organoid culture medium | |||
| L-WRN Conditioned medium | 1:1 | ATCC | CRL-3276 |
| Advanced DMEM/F12 | 1:1 | Life Technologies | 12634-010 |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/mL | Life Technologies | 15140-122 |
| N-Glutamine | 10 µl/mL | Life Technologies | 35050-061 |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES | 10 mM | Life Technologies | 15630-080 |
| B27 | 10 µl/mL | Gibco | 17504-044 |
| N2 | 10 µl/mL | Gibco | 17502-048 |
| Organoid seeding medium | |||
| Organoid culture medium | |||
| Epidermal growth factor (EGF) | 50 ng/mL | Invitrogen | PMG8041 |
| Fibroblast growth factor-10 (FGF10) | 100 ng/mL | PeproTech | 100-26 |
| Primary antibodies | |||
| Anti-Cytokeratin 19 (CK19) antibody, Rabbit | 1:250 | Abcam | ab53119 |
| Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) antibody, Rabbit | 1:200 | Santa Cruz | sc-20095 |
| Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antibody, Rabbit | 1:2000 | DSRB | F109-D12 |
| E-cadherin antibody, Goat | 1:500 | Santa Cruz | sc-31020 |
| Acetylated α-tubulin antibody, Mouse | 1:500 | Sigma-Aldrich | T6793 |
| Secondary antibodies | |||
| 488 labeled anti-rabbit, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-21206 |
| 594 labeled anti-goat, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-11058 |
| 568 labeled anti-mouse, Goat IgG2b | 1:500 | Invitrogen | A-21144 |
| TopFlash Wnt reporter assay | |||
| TopFlash HEK293 cell line | ATCC | CRL-1573 | |
| Luciferase Assay Kit | Biotium | 30003-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 0.4% Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
| Additional materials and reagents | |||
| Basement matrix, phenol free Matrigel | CORNING | 356237 | |
| Dissociation buffer, Accutase | Gibco | A1110501 | |
| Cell culture freezing medium, Recovery | Life Technologies | 12648010 | |
| Cell strainer (70 µm, steriled) | Fisherbrand | 22363548 | |
| Guanidinium thiocyanate-phenol RNA extraction, TRIzol | Invitrogen | 15596026 | |
| Specimen processing gel, HistoGel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Universal mycoplasma detection kit | ATCC | 30-1012K | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 24 well plate | USA Scientific | CC7682-7524 | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher scientific | 14-432-22 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse E800 | |
| Inverted microscope | Biotium | 30003-2 | |
| Necropsy tray | Fisherbrand | 13-814-61 |
References
- Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F.
- Carpino, G., et al. Stem/Progenitor Cell Niches Involved in Hepatic and Biliary Regeneration. Stem Cells International. 2016, 3658013 (2016).
- DiPaola, F., et al. Identification of intramural epithelial networks linked to peribiliary glands that express progenitor cell markers and proliferate after injury in mice. Hepatology. 58 (4), 1486-1496 (2013).
- Venter, J., et al. Development and functional characterization of extrahepatic cholangiocyte lines from normal rats. Digestive And Liver Disease. 47 (11), 964-972 (2015).
- Glaser, S. S., et al. Morphological and functional heterogeneity of the mouse intrahepatic biliary epithelium. Laboratry Investigation. 89 (4), 456-469 (2009).
- Cardinale, V., et al. Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets. Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).
- De Assuncao, T. M., et al. Development and characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cholangiocytes. Laboratry Investigation. 95 (6), 684-696 (2015).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Kruitwagen, H. S., et al. Long-Term Adult Feline Liver Organoid Cultures for Disease Modeling of Hepatic Steatosis. Stem Cell Reports. 8 (4), 822-830 (2017).
- Spence, J. R. Taming the Wild West of Organoids, Enteroids, and Mini-Guts. Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 5 (2), 159-160 (2018).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends In Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Sampaziotis, F.
- Sampaziotis, F., et al. Reconstruction of the mouse extrahepatic biliary tree using primary human extrahepatic cholangiocyte organoids. Nature Medicine. 23 (8), 954-963 (2017).
- Nakagawa, H., et al. Biliary epithelial injury-induced regenerative response by IL-33 promotes cholangiocarcinogenesis from peribiliary glands. Proceedings Of The Natural Academy Of Science Of The United States Of America. 114 (19), E3806-E3815 (2017).
- Razumilava, N. Hedgehog signaling modulates IL-33-dependent extrahepatic bile duct cell proliferation in mice. Hepatology Communications. , (2018).
- Boyer, J. L.
- Carpino, G., et al. Biliary tree stem/progenitor cells in glands of extrahepatic and intraheptic bile ducts: an anatomical in situ study yielding evidence of maturational lineages. Journal Of Anatomy. 220 (2), 186-199 (2012).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Williamson, I. A., et al. A High-Throughput Organoid Microinjection Platform to Study Gastrointestinal Microbiota and Luminal Physiology. Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).
- Wan, A. C. A. Recapitulating Cell-Cell Interactions for Organoid Construction - Are Biomaterials Dispensable? Trends In Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).
