Summary
Här presenterar vi ett protokoll som använder nära-infraröda färg ämnen i samband med immunhistokemi och hög upplöst skanning för att assay proteiner i hjärnans regioner.
Abstract
Neurovetenskap är studiet av hur celler i hjärnan förmedlar olika funktioner. Att mäta protein uttryck i nerv celler och glia är avgörande för studiet av neurovetenskap eftersom cellulär funktion bestäms av cell proteiners sammansättning och aktivitet. I den här artikeln beskriver vi hur immunocytokemi kan kombineras med nära infraröd hög upplöst skanning för att ge ett semikvantitativt mått av protein uttryck i olika hjärn regioner. Denna teknik kan användas för enkel eller dubbel protein uttryck i samma hjärn region. Att mäta proteiner på detta sätt kan användas för att få en relativ förändring i protein uttryck med en experimentell manipulation, molekylär signatur av inlärning och minne, aktivitet i molekyl ära vägar och neurala aktiviteter i flera hjärn regioner. Med hjälp av rätt proteiner och statistisk analys kan funktionell anslutning mellan hjärn regioner också bestämmas. Med tanke på enkelheten att implementera immuncytokemi i ett laboratorium, med hjälp av immuncytochemistry med nära infraröd hög upplöst scanning kan utöka förmågan hos neuroforskaren att undersöka neurobiologiska processer på system nivå.
Introduction
Studien av neurovetenskap angår en utredning av hur celler i hjärnan förmedlar specifika funktioner1. Dessa kan vara cellulära i naturen såsom hur glia celler ge immunitet i det centrala nerv systemet eller kan innebära experiment som syftar till att förklara hur aktiviteten av nerv celler i dorsala Hippocampus leder till geografisk navigering. I vid bemärkelse bestäms cellulär funktion av de proteiner som uttrycks i en cell och aktiviteten hos dessa proteiner2. Som ett resultat, att mäta uttryck och/eller aktivitet av proteiner i hjärn celler är avgörande för studiet av neurovetenskap.
Ett antal tekniker finns tillgängliga för att mäta protein uttryck i hjärnan. Dessa inkluderar in vivo metoder såsom positron emission topografi för receptor tätheter3 och mikro-dialys för små peptider4. Mer allmänt används ex vivo-metoder för att undersöka proteiners funktion och uttryck. Dessa inkluderar masspektrometri tekniker5, Western blot och enzymlänkade immunosorbent ASSAY (Elisa)6, och immuncytochemistry7. Immunocytokemi används i stor utsträckning inom neurovetenskap. Denna teknik innebär användning av en primär anti kropp för att detektera ett protein (eller antigen) av intresse (t. ex. c-FOS) och en konjugerad sekundär anti kropp för att detektera det protein primära anti kropps komplexet (figur 1). För att möjliggöra detektion av protein-primära anti kropps-sekundära anti kropp komplex, sekundära anti kroppar har oxiderande ämnen såsom pepparrotperoxidas (HRP) konjugerat till dem. Detta möjliggör bildandet av fälltates i celler som kan detekteras med hjälp av ljusmikroskopi7. Sekundära anti kroppar kan också ha kemikalier fluorescerar i konjugerade till dem (dvs. fluorophores). När stimuleras dessa kemikalier avger ljus, som kan användas för att upptäcka protein-primära anti kropp-sekundära anti kropps komplex7. Slutligen, ibland primära anti kroppar har reducerande medel och fluorescens kemikalier knutna till dem direkt förneka behovet av sekundära anti kroppar7 (figur 1).
Intressant, många immuncytochemistry metoder möjliggör visualisering av proteiner i hjärn celler, men inte förmågan att kvantifiera mängden protein i en specifik cell eller hjärn region. Med hjälp av ljusmikroskopi för att detektera fällning från Reduktions reaktioner möjliggör visualisering av nerv celler och glia, men denna metod kan inte användas för att kvantifiera protein uttryck i celler eller i en specifik hjärn region. I teorin kan fluorescensmikroskopi användas för detta, eftersom det ljus som avges från den fluorescerande sekundära anti kroppen är ett mått på det protein primära anti kropps-sekundära anti kropps komplexet. Emellertid, autofluorescence i hjärn vävnad kan göra det svårt att använda fluorescens mikroskopi att kvantifiera protein uttryck i hjärn vävnad8. Som ett resultat, ljus avges från fluorescerande bilder av hjärn vävnad används sällan för att kvantifiera protein uttryck i hjärnan.
Många av dessa problem kan åtgärdas med hjälp av nära-infraröd immuncytokemi i samband med hög upplöst skanning9,10. I den här artikeln beskriver vi hur immuncytokemi i kombination med fluorophores i de nära infraröda emissions spektra kan kombineras med hög upplöst skanning (t. ex. 10 – 21 μm) för att få skarpa bilder som möjliggör semikvantifiering av protein i olika regioner i hjärnan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Följande protokoll godkändes av den institutionella djur omsorgs-och användnings kommittén (IACUC) vid University of Delaware. Male Sprague Dawley råttor ungefär 55-75 dagar gammal användes för detta protokoll.
1. Brain extraktion och vävnads beredning
- Anesthetize råtta med isofluran i anestesi induktions kammare tills råtta inte längre uppvisar ett svar på foten nypa.
- Offra råttor via snabb hals hals huggning med hjälp av en giljotin.
- Skär huden på skalle posteriort om Anterior och klar från toppen av skalle.
- Använd rongeurs att försiktigt ta bort den bakre delen av skalle, och sedan använda små dissekera sax skära ner mitt linjen av skalle, trycka uppåt mot toppen av skallen hela tiden för att undvika att skada hjärn vävnaden.
- Använd rongeurs att skala bort höger och vänster halva av skalle för att exponera hjärnan.
- Använd en liten spatel för att skopa under hjärna och bryta nerverna, försiktigt höja hjärnan och frysa hjärnor i isopentan kyld på torris (minst-20 ° c). Efter detta, lagra hjärnor i en-80 ° c frys tills skivning.
- Segmentera hjärnor i områden av intresse på 30 – 50 μm i en kryostat upprätthålls mellan-9 ° c och-12 ° c. Direkt montera skivor på glas rutsch banor och förvara i en-80 ° c frys tills tiden för immuncytokemi analys.
Anmärkning: I detta protokoll hjärnan regioner av intresse var hippocampus och amygdala.
2. singel immunohistokemisk reaktion
Anmärkning: För dubbel immunohistokemisk reaktion är protokollet densamma som den enda immunhistokemiska reaktionen, förutom att denna reaktion har två primära anti kroppar från olika värdar (t. ex. kanin och mus) och två sekundära anti kroppar för motsvarande primärfärgerna ska vara från en enda värd (t. ex. getantikanin och getantimus). De sekundära anti kropparna måste också vara från två olika spektra som finns i hög upplöst skannrar. Till exempel, en sekundär anti kropp med en emission spektrum topp vid 680 nm och en sekundär anti kropp 800CW (emission spektrum topp vid 780 nm).
- Ta bort glas glasen från frysen och låt den bli tempererad till rums temperatur i 30 min.
- Under en draghuv, fixa hjärn vävnad i 4% paraformaldehyd i 0,1 M fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för 1 − 2 h vid rums temperatur.
- Skölj glasen i 0,1 M tris buffrad saltlösning (TBS) tre gånger i 10 min vardera. Permeabilize cell membran genom inkubering av dia bilder i ett milt rengörings medel (t. ex. 0,01% tvätt medel) i 30 − 60 min.
- Skölj glasen i TBS tre gånger i 15 minuter vardera.
- Späd primär anti kropp för protein av intresse i PBS i rätt koncentration. Till exempel, för att upptäcka den omedelbara tidiga genen c-FoS, förbereda en kanin primär anti c-FOS anti kropp i en koncentration av 1:500.
- Pipettera primär anti kropps lösning direkt på hjärn vävnaden (cirka 200 μL per 3 tum x 1 tum Slide).
- Använd täckglasen för att Inkubera hjärn vävnaden på glas rutsch banor i primär anti kropps utspädning för antingen 1 − 2 timmar vid rums temperatur eller över natten (~ 17 h) vid 4 ° c.
- Ta bort täckglasen och tvätta dem i TBS som har en liten mängd disk medel tillsatt (t. ex. 0,01% tvätt medel, "TBS-T") fyra gånger i 15 min vardera.
- Använd täckglas för att Inkubera hjärn sektioner i en sekundär anti kropp vid rums temperatur i 2 h.
Anmärkning: Den sekundära anti kroppen måste vara korrekt spädning och i en spädnings vätska som innehåller TBS, tvätt medel och 1,5% av värd serum. Till exempel, en get sekundär anti kropp i en utspädning av 1:2000 skulle innehålla 1,5% get serum och 0,05% tvätt medel. - Skölj glasen i TBS-T fyra gånger i 20 minuter vardera, och sedan i TBS fyra gånger i 20 minuter vardera.
- Torra rutsch banor i rums temperatur i mörkret över natten. När bilderna är torra är de klara för bild tagning.
3. avbildning
- Placera bilderna på det nära infraröda skannings gränssnittet med vävnaden vänd nedåt. Antingen bild en glas bild eller flera bilder i taget med hjälp av ett markerings verktyg.
- Bild bilder med den högsta kvalitets inställningen med en förskjutning på 0 nm och en upplösning på 21 μm. Skanningen tar normalt 13 − 19 timmar beroende på vilken skannings utrustning som används.
- Importera bilder till bild analys program varan (t. ex. ImageStudio) för att visa och markera för semikvantitativ protein analys.
4. analys av protein uttryck
- Öppna bild analys programmet och välj den arbets yta som bilden skannades till.
- Öppna den skannade bilden i bild analys program för att Visa skanningen, och justera vilka våg längder visas, liksom kontrasten, ljus styrka och förstoring visas utan att ändra den råa bilden eller den totala kvantifierade utsläpp.
- Identifiera nyckel områden för kvantifiering och välj fliken analys längst upp på sidan och välj sedan Rita rektangel (eller Rita Ellipse/Draw FreeHand) för att rita en rektangel över det område som kommer att kvantifieras.
- Om du vill visa rektangelns storlek väljer du former längst ned till vänster på skärmen och väljer sedan kolumner längs nederkanten till höger. Lägg till höjd -och bredd kolumner för att identifiera form storleken.
Anmärkning: Det är viktigt att styra för form storlek vid jämförelse av kvantifiering. Det rekommenderas att använda identiska former placerade inom den önskade kvantifieringsplatsen för att få en korrekt provtagning av utsläppen för den regionen. - Namnge sedan formen och upprepa. När alla regioner har samplats kan de data som är tillgängliga från kolumnfliken aggregeras och analyseras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Innan man använder hög upplöst skanning för immunhistokemi bör man kontrol lera att protokollet fungerar. Detta kan åstadkommas med hjälp av ett validerings test där hjärn avsnitt från samma djur inkuberas med primära och sekundära anti kroppar, sekundär anti kropp ensam, eller varken primär eller sekundär anti kropp. Resultaten för en sådan validerings analys visas i figur 2. I denna reaktion var vi upptäcka den omedelbara tidiga genen c-juni i dorsala hippocampus och amygdala. C-juni uttryck observerades endast när primära och sekundära anti kroppar applicerades på hjärn vävnaden.
Figur 3 visar dubbel protein detektion i amygdala kärnor. I detta experiment vi analyseras GluR1 subenhet av α-amino-3-hydroxy-5-metyl-4-isoxazolepropionsyra (AMPA) receptor och NR2A subenhet av N-metyl-D-aspartat receptor (NMDA) receptorn i samma hjärn vävnad. Detta tillät oss att undersöka förhållandet mellan AMPA/NMDA-receptorer i sub-nuclei av amygdala. Detta förhållande är en neurobiologisk signatur av inlärning och minne11,12. Som kan ses i figur 3, signal för GluR2 (780 nm ljus pseudo färgad i grönt) och NR2A (680 nm ljus pseudo färgad i rött) kan endast observeras i hjärn vävnaden som utsattes för primära och sekundära anti kroppar.
Figur 4 visar hur medelvärdet och normaliserade mått av protein uttryck kan erhållas från högupplösta skanningar i ventrala Hippocampus. Med hjälp av bild analys program vara, en rektangel placeras i regionen av intresse (molekyl skikt av CA1) och genomsnittlig intensitet av ljus från formen kan användas som ett mått på fluorophore uttryck (figur 4a). Detta är i sin tur ett mått på protein uttryck (dvs. det antigen-primära anti kropps-sekundära anti kropps komplexet). Formen kan också placeras över en region som uttrycker hög signal och låg signal för att få en normaliserad kurva (figur 4b). I detta exempel, en rektangel placerades över det molekyl ära skiktet av CA1, men omfattade dendritiska fält också, som inte uttrycker betydande mängder av c-juni i denna analys. Arean under kurvan kan sedan användas som ett mått på protein uttryck. Om installationen i ett experiment involverar behandlings grupper (t. ex. stress exponering) och en kontroll, kan relativa förändringar av protein uttryck i hjärnan erhållas.
Figur 1 : Illustration av den immunhistokemiska reaktionen med primär (1St) och sekundär (2nd) anti kroppar eller bara primär anti kropp. Fyllda svarta cirklar representerar en etikett, som kan vara ett oxidations medel som peppar rots peroxidas eller en fluorophore såsom Boron-dipyrromethene (BODIPY). Gröna kvadrater representerar antigen (på protein av intresse) som upptäcks i den immunhistokemiska reaktionen.
Figur 2 : Bilder av ett validerings test för detektion av c-jun. I denna analys, vävnad från samma djur behandlades med en kanin primär anti kropp som erkänner c-juni och get antirabbit sekundära anti kropp med bifogade fluorophore med utsläpp vid 780 nm (pseudo färgad i grönt, vänster panel). Intilliggande vävnad behandlades med antingen sekundär anti kropp ensam (mellersta panelen) eller ingen anti kropp (höger panel). Skalbar = 1 mm.
Figur 3 : Validering analys för dubbel märkning immunohistokemisk reaktion i amygdala. Triplicate hjärnan avsnitt från samma råtta var antingen utsätts för kanin anti kropp som erkänner GluR1 och mus anti kropp som erkänner NR2A (vänster paneler), sekundär anti kropp (mellersta paneler), eller ingen anti kropp (höger paneler). GlurR1 var visualiseras med get anti kanin 800CW sekundära anti kropp (780 nm, pseudo färgad i grönt) och NR2A var visualiseras med hjälp av en get antimouse 680RD sekundär anti kropp (680 nm, pseudo färgad i rött). Skalbar = 1 mm. OT = optisk tarm kanal; IC = inre kapsel; EC = extern kapsel. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Erhållande av semikvantitativa mått på protein uttryck i hjärn vävnad. (A och B) skärm dum par av gjorda bilder i bild analys program som används för att analysera bilder från skannern. Vävnad var från den ventrala hippocampus och behandlas för att visualisera c-juni. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De resultat som presenteras i denna artikel visar att nära-infraröd immuncytokemi i kombination med hög upplöst scanning kan användas för att få semi-kvantitativa mått av protein uttryck i hjärn vävnad. Det kan också användas för att märka två proteiner samtidigt i samma hjärn region. Vi har tidigare använt närinfraröd immunohistokemi för att mäta omedelbart tidigt gen uttryck i flera hjärn regioner9,10. Omedelbara tidiga gener kan användas som ett mått på neurala aktivitet. Vi utsattes också för dessa semikvantitativa mått av protein uttryck för statistiska analyser som tillät oss att gruppera hjärn regioner med korrelerade nivåer av omedelbara tidiga gener (IEGs). Vi använde detta som ett mått på funktionell anslutning för att undersöka hur stress påverkar funktionell anslutning mellan noder inom rädsla kretsen under emotionell inlärning och minne9,10. Vi visade hur AMPA/NMDA nyckeltal (en signatur av inlärning och minne) kan mätas med nära infraröd immuncytokemi med hög upplöst skanning13. En liknande teknik kan användas för att mäta Pan och fosho-proteiner för att bestämma molekyl ära signalering. Detta åstadkoms med hjälp av Western blot14. Emellertid, detta kräver dissekera hjärn regioner av tjocka hjärn skivor och är inte mottaglig för små hjärn regioner. Detta problem kan kringgås med närinfraröd immunocytokemi med hög upplöst skanning. Slutligen, alla immuncytokemi bilder digitaliseras, vilket möjliggör obegränsad lagring och bekväm re-analys av tidigare analyser.
Som med alla metoder finns det nack delar. Det finns ingen förstoring i hög upplöst skannrar och behandling av vävnad inte lätt tillåter avsökning med fluorescens mikroskopiska tekniker. Även tar alternativa skivor från hjärnan kanske inte fungerar, eftersom konfokalmikroskopi kan fungera bäst i parfymerad hjärn vävnad, men nära infraröd avbildning med hög upplöst skanning är typiskt gjort på Flash frysta hjärnor. Protein uttryck i specifika nerv celler (t. ex. Interneuron kontra pyramidal neuron) eller olika cell typer i hjärnan (t. ex., neuroner vs. glia) kan inte bestämmas med nära infraröd immuncytokemi med hög upplöst skanning. Utföra validering analyser är kritiska eftersom detta är fortfarande en relativt ny metod för att undersöka protein uttryck i hjärn vävnad.
När den används på rätt sätt, nära infraröda immuncytokemi med hög upplöst skanning erbjuder fördelar. Autofluorescence i hjärn vävnad reduceras i nära infraröda intervallet, semi-kvantitativa åtgärder för protein uttryck kan erhållas, uttryck av två proteiner i samma hjärn region kan erhållas, och bilder av analysen kan lagras på obestämd tid. När den kombineras med rätt protein och/eller statistisk metod kan denna teknik användas för att undersöka protein uttryck, neural aktivitet, molekylär signalering och funktionell anslutning i hjärnan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Forskningen i denna rapport finansierades av ett mål stipendium från NIGMS (1P20GM103653) som tilldelades DK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Extraction | |||
| Anesthesia Induction Chamber | Kent Scientific | VetFlo-0530SM | |
| Kleine Guillotine | Harvard Apparatus | 73-1920 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | used to remove back of skull |
| Delicate Dissecting Scissors | Fischer Scientific | 08-951-5 | used to cut upward along midline of skull |
| Micro Spatula | Fischer Scientific | 21-401-5 | used to scoop out brain |
| Glass Microscope Slides | Fischer Scientific | 12-549-6 | |
| Immunohistochemical Reaction | |||
| Triton X-100 | Used as a mild detergent to permeabilize cells after fixing in Paraformaldehyde, also used as mild detergent in combination with host serum and secondary antibody | ||
| Tween-20 | Used as a small amount of detergent added to TBS to procuce TBS-T after coverslipping slides with primary antibody | ||
| Licor Odyssey scanner | Licor Biotechnology Inc. | ||
| Image Studio | Licor Biotechnology Inc. |
References
- Kandel, E. R. Principles of Neural Science. , McGraw Hill. New York. (2013).
- Byrne, J. H., Roberts, J. L. From Molecules to Networks: An Introduction to Cellular and Molecular Neuroscience. , Academic Press/Elsevier. (2009).
- Salami, A., et al. Dopamine D2/3 binding potential modulates neural signatures of working memory in a load-dependent fashion. Journal of Neuroscience. , (2018).
- Merali, Z., Khan, S., Michaud, D. S., Shippy, S. A., Anisman, H. Does amygdaloid corticotropin-releasing hormone (CRH) mediate anxiety-like behaviors? Dissociation of anxiogenic effects and CRH release. European Journal of Neuroscience. 20 (1), 229-239 (2004).
- English, J. A., et al. Dataset of mouse hippocampus profiled by LC-MS/MS for label-free quantitation. Data in Brief. 7, 341-343 (2016).
- David, M. A., Tayebi, M. Detection of protein aggregates in brain and cerebrospinal fluid derived from multiple sclerosis patients. Frontiers in Neurology. 5, 251 (2014).
- Oliver, C., Jamur, M. C.
- Spitzer, N., Sammons, G. S., Price, E. M. Autofluorescent cells in rat brain can be convincing impostors in green fluorescent reporter studies. Journal of Neuroscience Methods. 197 (1), 48-55 (2011).
- Knox, D., et al. Using c-Jun to identify fear extinction learning-specific patterns of neural activity that are affected by single prolonged stress. Behavioural Brain Researach. 341, 189-197 (2018).
- Knox, D., et al. Neural circuits via which single prolonged stress exposure leads to fear extinction retention deficits. Learning & Memory. 23 (12), 689-698 (2016).
- Malinow, R., Malenka, R. C. AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Annual Review of Neuroscience. 25, 103-126 (2002).
- Nabavi, S., et al. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
- Kimmelmann-Shultz, B., Mohammadmirzaei, N., Della Valle, R., Knox, D. Using high resolution near infrared imaging to measure fear-learning induced changes in AMPA/NMDA ratios throughout the fear circuit. The Annual Delaware Neuroscience Research and Poster Symposium, Newark, DE, , (2018).
- Eagle, A. L., et al. Single prolonged stress enhances hippocampal glucocorticoid receptor and phosphorylated protein kinase B levels. Neuroscience Research. 75 (2), 130-137 (2013).
