Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Använda Near-infraröd Fluorescence och hög upplöst skanning för att mäta protein uttryck i gnagare Brain
Chapters
Summary
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Här presenterar vi ett protokoll som använder nära-infraröda färg ämnen i samband med immunhistokemi och hög upplöst skanning för att assay proteiner i hjärnans regioner.
Transcript
Detta protokoll är betydande eftersom det möjliggör kvantifiering av två proteiner i samma hjärnregion. Detta gör det möjligt för experimentören att titta på aktivitet i molekylära signalering vägar i hjärnan regioner genom assaying pan och fosfoproteiner. Det kan också användas för att assay proteiner som är markörer för olika kognitiva fenomen.
Vi använder en relativt enkel teknik, såsom immunhistokemi, för att svara på frågor som vanligtvis kräver mer engagerade tekniker. Inklusive undersöka aktiviteten av molekylär signalering vägar, undersöka AMPA / NMDA förhållandet. Med hjälp av en kryostat som upprätthålls mellan minus 9 grader Celsius och minus 12 grader Celsius, skiva tidigare isolerade och frysta råtthjärna i regioner av intresse vid 30-50 mikrometer.
Direkt montera skivor på glas diabilder och förvara på minus 80 grader Celsius tills immuncytokemi. Ta ut glasglasen ur frysen och låt dem ekvilligt till rumstemperatur i 30 minuter. Arbeta under en fume huva, placera bilderna i 4%paraformaldehyd i 0,1 molar PBS i en till två timmar vid rumstemperatur för vävnad fixering.
Skölj sedan objektglasen i 0,1 molar TBS tre gånger i 10 minuter vardera. För att permeabilisera cellmembran, inkubera objektglasen i ett milt rengöringsmedel i 30-60 minuter. Och skölj igen i TBS tre gånger i 15 minuter vardera.
Späd primär antikropp för protein av intresse i PBS i korrekt koncentration enligt beskrivningen i manuskriptet. Pipett primär antikroppslösning direkt på hjärnvävnaden. Placera täckglidningar på objektglasen och inkubera hjärnvävnaden i primär antikroppsutspädning i 1-2 timmar vid rumstemperatur.
Efter inkubationen, ta bort täcksliorna och tvätta objektglasen i TBS som har en liten mängd rengöringsmedel tillsatt i den, fyra gånger i 15 minuter vardera. Späd sekundär antikropp i ett spädningsmedel som innehåller TBS, tvättmedel, och 1,5%av värdserum. Tillsätt sekundär antikropp till objektglasen, täck med täcksli och inkubera i rumstemperatur i två timmar.
Efter inkubationen sköljer du objektglasen i TBS-T fyra gånger i 20 minuter vardera och sedan i TBS fyra gånger i 20 minuter vardera. Torka rutschkanorna i rumstemperatur i mörker, över natten. Placera diabilder på nära infraröd skanningsgränssnitt med vävnaden vänd nedåt.
Bild flera bilder i taget med markeringsverktyget. Avbilda bilderna med hjälp av inställningen av högsta kvalitet med en upplösning på 21 mikrometer. I en förskjutning av noll nanometer, importera bilder till bildanalys programvara för att visa och markera för halvkvantitativ proteinanalys.
När du har öppnat bildanalysprogramvaran väljer du det arbetsområde som bilden skannades in i. Öppna sedan den skannade bilden i bildanalysprogramvaran för att visa genomsökningen och justera våglängder, kontrast, ljusstyrka och förstoring som visas utan att den råa bilden eller det totala kvantifierade utsläppet ändras. När du har identifierat nyckelregionerna för kvantifiering markerar du analysfliken längs sidans överkant och väljer sedan rita rektangel för att rita en rektangel över området som ska kvantifieras.
Om du vill visa rektangelstorleken markerar du former längs skärmens nederkant till vänster. Välj sedan kolumner längs nederkanten till höger. Lägg sedan till höjd- och breddkolumner för att identifiera formens storlek.
Slutligen, namnge formen och upprepa. När alla regioner är samplad, fortsätt med att kombinera och analysera de data som finns tillgängliga från fliken kolumner. För att verifiera att detta protokoll fungerar inkuberades hjärnsektioner med primära och sekundära antikroppar, enbart sekundär antikropp eller varken primär eller sekundär antikropp.
Den omedelbara tidiga genen c-jun uttryck upptäcktes i den dorsala hippocampus och amygdala endast när både primära och sekundära antikroppar tillämpades på hjärnvävnaden. GluR1 sub-enhet ampa receptorn och NR2A sub-enhet av NMDA-receptorn var assayed i avföringen protein upptäckt i amygdala atomkärnor. Detta tillät undersöka förhållandet mellan AMPA NMDA-receptorer i sub-kärnor av amygdala som är en neurobiologisk signatur av lärande och minne.
Medelvärde och normaliserade åtgärder av protein uttryck erhölls från högupplösta skanningar i ventrala hippocampus. Med hjälp av bildanalysprogramvaran placeras en rektangel i intresseområdet och medelintensiteten hos ljus från formen användes som ett mått på fluoroforeuttryck, vilket är ett mått på proteinuttryck. För att erhålla den normaliserade kurvan placerades en form över en region som uttrycker hög signal och låg signal i området under kurvan användes som ett mått på proteinuttryck.
Den största kampen med detta förfarande är att hitta en antikropp och se till att det fungerar. Ansökan är enkel. Mitt råd skulle vara att först försöka en regelbunden immunohistochemical förfarande, sedan prova denna teknik.
Alltid utför en validering analys först. Det viktigaste att komma ihåg är att kontrollera din antikroppsutspädning och se till att den tillämpas korrekt. Utan dessa steg kommer proceduren att misslyckas.
Tags
Neurovetenskap immunhistokemi nära-infraröd hög upplöst mPFC amygdala HippocampusRelated Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
