Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

בצובר Droplet ויטריפיקציה עבור שימור ההירופציט הראשי

Published: October 25, 2019 doi: 10.3791/60250
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2, 1,2, 1,2
1Center for Engineering in Medicine, Harvard Medical School, Massachusetts General Hospital, 2Shriners Hospitals for Children, Boston, 3Department of Surgery, University of Amsterdam

Summary

כתב יד זה מתאר שיטת הקפאה נטולת קרח עבור כמויות גדולות של החולדות החצציטים לפיה התאים הראשוניים הם טרום מודבטים עם סוכנים הקפאה בריכוז נמוך והוא מוקשה בטיפות גדולות.

Abstract

ויטריפיקציה היא חלופה מבטיחה ללא קרח להקפאה קלאסית (בקירוב 1 ° c/דקות) הקפאה של דגימות ביולוגיות. ויטריפיקציה דורש שיעורי צינון מהיר במיוחד כדי להשיג מעבר של מים לשלב הזכוכית תוך הימנעות היווצרות קרח מזיק. למרות שטרום הדגירה עם סוכנים ביולוגיים (CPA) יכול להפחית את שיעור הצינון הקריטי של דגימות ביולוגיות, ריכוזים גבוהים בדרך כלל נדרשים כדי לאפשר הקפאת קרח חינם על ידי ויטריפיקציה. כתוצאה מכך, ויטריפיקציה מושפע מרעילות CPA ומוגבלת לדגימות קטנות שניתן לקרר במהירות. לאחרונה הפגינו כי אלה מגבלות הטבועה ניתן להתגבר על ידי droplet ויטריפיקציה בצובר. באמצעות שיטה זו הרומן, התאים הם הראשונים לקדם מחדש עם ריכוז הרואה חשבון נמוך תאיים. מינוף התייבשות אוסמוטי מהירה, ה-CPA תאיים מרוכז ישירות לקראת ויטריפיקציה, ללא צורך באופן מלא ריכוזי רואי חשבון רעילים. התייבשות הסלולר מבוצעת במכשיר פלואידיג ומשולב עם הדור תפוקה גבוהה רציפה של טיפות בגודל גדול כי הם התמסדים בחנקן נוזלי. שיטת הקפאת הקרח ללא הקפאה עם רעילות CPA מינימלית מתאימה לכמויות התאים הגדולות והתוצאות בכדאיות המוגברת של המעי האטי ובתפקוד המטבולית לעומת הקריוגנית איטית ומקפיאה. כתב יד זה מתאר את השיטות עבור droplet בצובר מוצלחת ויטריפיקציה בפירוט.

Introduction

הפסד של הכדאיות התאית ותפקוד מטבולית לאחר קריוגנית של hepatocytes עדיין בעיה מרכזית המגבילה יישומים קליניים1,2,3. שיטת בחינת הסדר של ההיפציט הקריוגנית היא איטית-הקפאה, אשר מבוצעת על ידי הפרה מראש של hepatocyte עם CPA (diמתיל סולפוקסיד [dmso], גלוקוז, ו-אלבומין, הקפאת קצב מבוקרת (בקירוב 1 ° c/min) כדי ל טמפרטורות קריוגניים4,5. למרות מיטובי הדיווחים רבים, הרעלת רואי חשבון ביחד עם חוסר איזון אוסמוטי מזיק במהלך הקפאת הלחץ מכני של היווצרות קרח להישאר החסרונות הבסיסיים של קיפאון איטי6,7.

ויטריפיקציה מציע יתרון על הקפאה איטית בפציעה זו בשל היווצרות קרח הוא נמנע לחלוטין על ידי מעבר שלב ישיר של מים למצב זכוכית6. עם זאת, כדי להגיע לטמפרטורת המעבר זכוכית של מים טהורים (-137 ° c), המים חייבים להיות מקורר במחירים בסדר של 1,000,000 מעלות צלזיוס לשנייה (כלומר, שיעור צינון קריטי) כדי למנוע היווצרות קרח מעל טמפרטורת המעבר זכוכית8 . תוספת של CPAs יכול להקטין את שיעור הקירור הקריטי ולהגדיל את טמפרטורת המעבר זכוכית של פתרונות מימית9. עם זאת, גם עם ריכוזי CPA גבוהה (למשל, 40% v/v dmso או גבוה יותר) שיעורי צינון מהיר בכל זאתנדרשים עבור ויטריפיקציהמוצלחת 8,9.

תעריפי הצינון הנדרשים וריכוזי רואי חשבון גבוהים גורמים לשני החסרונות העיקריים של ויטריפיקציה. ראשית, כדי לאפשר קירור מהיר, הדגימות חייב להיות מסה תרמית נמוכה. שנית, כדי להגיע לריכוזי רואי חשבון גבוהים תוך הימנעות מפציעה אוסמוטי, CPAs חייב להיות לאט הציג ומוקצב מלא בין התאים הפנים והחילוץ6. זה מגביר את זמן החשיפה של תאים CPAs רעילים. יחד, הדבר גורם לויטריפיקציה תהליך מסורבל המוגבל למספר דוגמאות קטנות (מיקרוליטר) בכל פעם. מויטריפיקציה Droplet הוצע כפתרון פוטנציאלי להגבלות אלה. על-ידי חשיפת מזערית התאים טיפות (nanoliters) כדי חנקן נוזלי שיעור הקירור הוא גדל באופן משמעותי, אשר כתוצאה מכך מאפשר הפחתה ניכרת בריכוז רואי החשבון10,11,12 ,13,14. למרות שניתן להשתמש בו זמנית במספר רב של החרירים בתדר גבוה, גודל ה-droplet הקטן ביותר מגביל את התפוקה למיקרו-ליטר לדקה10, המונע הויטריפיקציה יעילה של תא גדול אמצעי אחסון עם קצבי עיבוד גניטודות גבוהים יותר לפי סדר מיליליטר לדקה.

לאחרונה הוכח כי אלה מגבלות הטבועה של ויטריפיקציה ניתן להתגבר על ידי droplet ויטריפיקציה15בצובר. זו שיטה הרומן ממנף התייבשות אוסמוטי מהירה כדי לרכז את הריכוז של רואי חשבון תאיים של 7.5% v/v אתילן גליקול ו DMSO מיד לפני ויטריפיקציה, ביטול הצורך של היכולת המלאה של ריכוזי רואי חשבון רעילים. התייבשות תאית מבוצעת במכשיר פלואידיג באמצעות חשיפה קצרה של hepatocytes לריכוז הרואי חשבון גבוהה. למרות חשיפה זו גורמת התייבשות אוסמוטי מהירה, זה קצר מדי עבור ריכוז CPA גבוה כדי לפזר לתוך התאים. מיד לאחר התייבשות, התאים נטענים טיפות כי הם באופן ישיר בחנקן נוזלי. שיטה זו מבטלת את הצורך של ספיגת מלאה תאיים של ריכוזי CPA גבוהים בעוד ריכוז רואי חשבון גבוהה מאפשר ויטריפיקציה של טיפות בגודל גדול, וכתוצאה מכך נפח תפוקה גבוהה עם רעילות CPA מינימלית.

מויטריפיקציה Droplet משפרת את הכדאיות הישירה והארוכת-טווח לאחר שימור, כמו גם מורפולוגיה ותפקוד מטבולי של החולדה הראשית לעומת הקריוגנית קלאסית בהקפאה איטית15. כתב יד זה מספק את הפרטים מתודולוגיים עבור droplet גורפת ויטריפיקציה של החולדה הראשית העכבר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

החרופציט העיקרי עבור פרוטוקול זה בוצעו על-ידי ליבת משאבי התא (CRC) בבית החולים הכללי של מסצ, בוסטון, מסצ, ארה ב. פרוטוקול החיות (#2011N000111) אושר על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של בית החולים הכללי של מסצ.

1. droplet גורפת ויטריפיקציה

  1. הכינו את הפתרונות הויטריפיקציה.
    1. הוסף 40 מ"ג של סרום של שור (BSA) כדי 17.0 mL של הפתרון של אוניברסיטת ויסקונסין (UW) כדי להפוך פתרון ויטריפיקציה 1 (V1). המסנן הסטרילי מסנן את הפתרון V1 באמצעות מסנן 0.22 יקרומטר ואחסן ב-4 ° c.
      הערה: UW הוא פתרון נפוץ לשימור איברים. הוא מכיל 50 g/L הידרוקסיל עמילן, 35.83 g/L חומצה lactoביונית, 3.4 g/L אשלגן פוספט monobasic, 1.23 g/L מגנזיום סולפט הצמח, 17.83 g/L רפפינז הקרב, 1.34 g/L אדנוזין, 0.136 g/L allopurinol, 0.992 g/l סה כ גלוטתיון, 5.61 g /L אשלגן הידרוקסיד, ו הידרוקסיד הנתרן כדי לכוונן את ה-pH ל 7.4.
    2. לשלב 7.0 mL של UW, 6.5 mL של DMSO, 6.5 mL של אתילן גליקול (EG), 40 mg של BSA, ו-5.48 g של סוכרוז להפוך פתרון ויטריפיקציה 2 (V2). מסנן סטרילי הפתרון V2 באמצעות מסנן 0.22 יקרומטר. טעינת 3.5 mL של פתרון מסוננים מסונן ב 3 מ"ל וחנות ב 4 ° c.
      הערה: כדי להקל על המסת ה-CPAs, הפתרונות מוכנים בכמויות גדולות מהנדרש.
  2. הכן את מנגנון ה-droplet ויטריפיקציה בצובר.
    1. כדי להכין את המחט ערבוב, לחתוך הראשון לאורך צד אחד של השרוול החיצוני של המחט ערבוב, ולאחר מכן לכופף את השרוול פתוח כדי להסיר אותו ממחט ערבוב.
    2. שקופית 2 25 mm צינורות סיליקון מקטעים על האינלטס של המחט ערבוב ולאבטח את עמדתם עם דבק (איור 1א).
    3. חותכים את המחט לאורך של 20 מ"מ (כלומר, אורך סליל ערבוב פנימי) כפי שמוצג באיור 1א.
      הערה: אורך המחט ערבוב פרופורציונלי לנפח בתוך המחט ולכן ניתן לשנות כדי לשלוט על זמן חשיפה של hepatocytes לפתרון הריכוז הגבוה CPA.
    4. הכנס את משקע הקיצוץ של המחט ערבוב לתוך מזרק 20 G הזרקה (איור 1B).
      הערה: גודל מחט ההזרקה משפיע על גודל ה-droplet.
    5. לחטא את מכלול המחט הערבוב על ידי אוטוקלינג.
    6. מלאו מלחמה סטרילית. עם חנקן נוזלי לחטא את החלק החיצוני של Dewar עם איזופנול לפני הצבת Dewar במכסה התרבות של תאי זרימה סטרילית למינארי.
      הערה: זיהום הוא שיקול חשוב במהלך חשיפה ישירה של טיפות לחנקן נוזלי. למרות שלא היה זיהום באמצעות חנקן נוזלי לא מעוקר בפרוטוקול הנוכחי, חנקן נוזלי ניתן לסנן או לקרינה כדי להבטיח עקרות אם הצורך16.
    7. הכנס משפך עם אותו קוטר חיצוני כמו הקוטר הפנימי של החנקן הנוזלי dewar לתוך שפופרת חרוט 50 mL ליצירת מכשיר אוסף droplet (איור 1C-E).
    8. להטביע את המכשיר droplet בחנקן נוזלי על ידי לחיצה איטית למטה במיקום האנכי הסופי שלה באמצעות מלקחיים גדולים. ודא שצינור החרוט מונח בתנוחה אנכית בתחתית הדמלחמה (איור 1ד-י).
      הערה: על המשפך להישאר מוכנס ולנוח בצינור החרוט. רמת החנקן הנוזלי צריכה להיות 1 ס מ מתחת לגובה המיפרץ של המשפך, כפי שמוצג באיור 1D.
    9. הר משאבת מזרק בעמדה אנכית על הקיר של כובע תרבות התא על ידי קשירת מחרוזת מכפות הרגליים של משאבת מזרק לברגים בולטות מן הקיר תרבות תא כיפה.
    10. מניחים את החנקן נוזלי Dewar עם מכשיר ה-droplet אוסף תחת משאבת מזרק אנכית נטען (איור 1E).
  3. טרום הדגירה עם CPAs.
    1. לאחר קבלת החולדה מבודדת העכבר הבודד, לספור את הריכוז מניות על ידי טרילון כחול הדרה ולקחת 40,000,000 hepatocytes קיימא.
      הערה: טיפול עדין בהפטציטים בהשעיה הוא קריטי למניעת מוות תאי.
    2. צנטריפוגה ב 50 x g עבור 5 דקות ללא בלם.
    3. ומחדש את ההפטציטים ב-3.4 mL של הפתרון V1.
    4. דגירה על הקרח 3 דקות.
    5. הוסף 150 μL של DMSO ו 150 μL של EG ל-hepatocytes ומערבבים בעדינות.
    6. דגירה על הקרח 3 דקות.
    7. שוב, להוסיף 150 μL של DMSO ו 150 μL של למשל כדי hepatocytes ולערבב בעדינות.
    8. טען 3.5 mL במזרק 3 מ ל.
  4. . לבצע ויטריפיקציה
    1. הכנס את המזרק עם hepatocytes טרום המחשב ואת מזרקים פתרון V2 על מתאם משאבת המזרק.
    2. צרף שתי נקבה Luer נעילת צינור בארב מתאמים מזרקים להחליק את אבובים סיליקון של ההרכבה מחט ערבוב על האביזרים בארב (איור 1F).
    3. הצב את ההרכבה כולה במשאבת המזרק (איור 1E).
    4. שלושה דקות לאחר התוספת האחרונה של DMSO ו-EG כדי hepatocytes, להפעיל את המשאבה ב 2 מ ל/דקה.
    5. הפסיקו את המשאבה לאחר שכל הפטוציטים נוספו לחנקן הנוזלי.

2. אחסון קריוגני

  1. ניקוב 10 חורים קטנים במכסה של צינור 50 mL באמצעות מחט של 20 גרם ולעטוף את החלק החיצוני של המכסה עם סרט גמיש, כפי שמוצג באיור 1B. זה יוצר שסתום המאפשר בריחה של שאריות חנקן נוזלי.
  2. כדי לאסוף את טיפות hepatocyte מעשה, ראשית להסיר את המשפך מן החנקן נוזלי Dewar. הבא, השתמש מלקחיים ארוכים לקחת את צינור חרוט המכיל את טיפות מתוך החנקן הנוזלי ובאיטיות לשפוך את החנקן הנוזלי עודף מצינור החרוט.
  3. סגרו את צינור החרוט עם המכסה הנוקב והציבו ישירות את צינור החרוט הסגור עם טיפות החרופציט לאחור בחנקן הנוזלי.
  4. להעביר את צינור החרוט מן החנקן הנוזלי לתוך אדי חנקן נוזלי קריוטנק.

3. התחממות מחדש של טיפות הפטציט

  1. הכן את פתרון ההתחממות החוזרת.
    1. התמוססות 17.13 גרם של סוכרוז ב-100 mL של מדיית התרבות התרבותית של DMEM כדי ליצור את פתרון ההתחממות מחדש. המסנן הסטרילי מסנן את פתרון ההתחממות מחדש באמצעות פילטר 0.22 יקרומטר וחמים ל-37 ° c.
  2. . חממי מחדש את ההיפטציטים
    1. קח את הצינורית החרותית בעזרת הפטציטים והובלת אותו בחנקן נוזלי למכסה המנוע של התאים.
    2. שחרר קלות את הכובע והחזר את הצינורית החרוטית לתוך החנקן הנוזלי.
    3. הוסיפו את טיפות הפטציט המרופנות לגביע ריק, הוסיפו באופן מיידי את התמיסה החמימה (37 ° c), ומיד מערבבים 10 ס מ.
      הערה: חשוב לעבוד במהירות כדי למנוע הקפאה במהלך התחממות מחדש. בהתאם לדרישות המחקר, מעטים לכל הטיפות ניתן לrewarmed בבת אחת.
  3. בטל את הטעינה של פתרון ההתחממות מחדש.
    1. מחלקים את פתרון ההתחממות החוזרת עם hepatocytes מעל 2 50 מ"ל שפופרות חרוט.
    2. צנטריפוגה את שני צינורות חרוט עבור 2 דקות ב 100 x g ב 4 ° צ' ללא בלם.
    3. משלחים את סופרנאטאנט כדי להשאיר נפח כולל של 12.5 mL באמצעות סימן הסיום של הצינור החרוט כהפניה ולהוסיף 12.5 mL של DMEM קר הקרח בצינור הקירור כדי לדלל את הפתרון התחממות מחדש ל 50%.
    4. השהה מחדש את הפטציטים והדגירה על הקרח במשך 3 דקות.
    5. הוסף 25 מ ל של הקרח קר DMEM לצינור חרוט כדי לדלל את הפתרון התחממות מחדש ל 25%.
    6. צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 50 x g ב 4 ° c ללא בלם.
    7. לאחר מכן, השתמש בתכשיר והשהה מחדש את הפטציטים ב -2 מ ל של מדיום התרבות הרצוי לשימוש.
      הערה: הצנטריפוגה מעבר בצפיפות ניתן להשתמש כדי להסיר hepatocytes מת מהשעיה התא אם יש צורך.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בידוד הראשי הראשוני מבודדים מחמישה כבדי חולדה שונים שימשו להשוואת השוואה ישירה של droplet בצובר ויטריפיקציה כדי הקפאה קלאסית באמצעות פרוטוקולי ההקפאה הראשונה שדווחו בספרות4, 5. בקיצור, hepatocytes הושעו ב UW שיושלם עם BSA (2.2 mg/mL), גלוקוז (333 mM), ו DMSO (10% v/v) קפוא באמצעות מקפיא קצב מבוקר. לאחר האחסון ב-196 ° c, הופלו הדגימות באמבט מים חמים. לאחר כל הקרח נמס, DMSO היה מדולל ישירות בעוד ריכוז הגלוקוז הופחת בהדרגה במהלך שלבים מרובים כדי להפחית את הפציעה אוסמוטי. הפרוטוקול המדויק ניתן למצוא בפירוט במקום אחר15. משכי שימור מגוונת בין 2 עד 8 ימים התאימו בין הויטריפיקציה droplet בצובר והקפאה קריוגנית עבור כל שכפול ביולוגי כדי להבטיח השוואה שווה. למרות שזמני השימור הקצרים נבדקו לשיקולים מעשיים, יש לציין כי ניתן לאחסן את ההיפטציטים הראשוניים ב-196 ° c במשך שנים ללא הפסד של יכולת קיום5.

בצובר droplet ויטריפיקציה מביא לשימור ההודעה הישירה hepatocyte הכדאיות של 79%, נמדד על ידי בדיקות הדרה כחול ההדרה, אשר קובע את שלמות הממברנה (איור 2א). זה גבוה באופן משמעותי מאשר 68% הכדאיות לאחר הקריוגנית ממוטבת קלאסי. התשואה של droplet בצובר ויטריפיקציה היא 56% כי הוא 10% גבוה יותר, וחשוב יותר עקבית, לעומת הקריוגנית קלאסי (איור 2ב).

פעילות חילוף החומרים של hepatocytes, נמדד באמצעות מאמר מטבוליות כחול לטווח ארוך כריך קולגן בתרבויות, היה גבוה באופן משמעותי לאחר droplet בצובר ויטריפיקציה מאשר לאחר קריוגנית קלאסית. סינתזה אלבומין, שהוא הפרמטר הנפוץ ביותר של תפקוד סינתטי של hepatocytes, היה גדול על ידי כמעט פעמיים קיפול לאחר droplet בצובר ויטריפיקציה לעומת הקריוגנית קלאסי (איור 3א). ייצור אוריאה הוא הפרמטר הנפוץ ביותר של פונקציית דטוקסיפיקציה של hepatocyte. לאחר תרבות של שבוע, הייצור האוריאה של הפטציטים בצובר היה גבוה באופן משמעותי מזו של הקריוציטים הקלאסיות (איור 3ב).

לסיכום, droplet בצובר ויטריפיקציה משפר את הכדאיות לאחר שימור ישיר ותפקוד מטבולית לטווח ארוך של החולדה הראשית הראשי בתרבויות כריך קולגן, לעומת הקפאה קריוגנית על ידי קיפאון איטי.

Figure 1
איור 1: droplet בצובר ויטריפיקציה התקנה ניסויית.
(א) איור של איך להכין את המחט ערבוב ולצרף שני צינורות סיליקון מקטעים לחוסר של המחט ערבוב. (ב) איור של החדרת המחט ערבוב לחתוך במחט הזריקה כדי להשלים את הרכבה המחט ערבוב. (ג) איור של צינור המשפך ושפופרת ה-50 mL המהווים את המכשיר של אוסף ה-droplet. (ד) סקיצה המציגה את מיקומו של הצינורית החרוטית, המשפך, ורמת החנקן הנוזלי בדמלחמה. (ה) הייצוג של ההתקנה המלאה של הניסוי droplet ויטריפיקציה מלמטה למעלה: החנקן הנוזלי dewar (אפור); המכשיר של אוסף droplet הממוקם בתוך החנקן הנוזלי Dewar (ברור); מכלול המחט ערבוב (צהוב בהיר) מחובר המחטים כי הם ממוקמים במשאבה מזרק (אדום). (ו) איור של מזרקים וערבוב של מפזר המחט. שני 3 מזרקים mL מהודק לתוך מתאם משאבת מזרק (כחול); מזרק אחד צריך להיות מלא עם hepatocytes טרום-הדגירה בפתרון V1 והשני עם פתרון ריכוז גבוה של CPA (פתרון V2). הרכבה המחט ערבוב מחובר מזרקים על ידי שתי נשים לנעול לנעל מתאמים בארב. (ז) איור של איך ליצור את מכסה הצינור החרוט לאחסון קריוגני המאפשר שאריות של חנקן נוזלי מתאדות כדי להימלט מצינור החרוט במהלך האחסון של טיפות hepatocyte מסויד. למעלה: מכסה עם חורים מנוקב. להלן: מכסה מנוקב עטוף בסרט גמיש. סרגל שורות: 1 ס מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: יכולת ההיפטציט והתשואה לאחר השימור.
(א) הכדאיות של טרי (אפור), cryopreserved מורות (כחול), ו-droplet בצובר (ירוק) hepatocytes. (ב) השתמרות שימור של קריוציטים ובכמות גדולה של droplet. כוכבים: p < 0.05 (Wilcoxon בהתאמה-זוגות חתם על מבחן דירוג). ושפקרס: מינימום למקסימום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: פעילות מטבולית בתרבויות כריך קולגן לטווח ארוך.
(א) אלבומין סינתזה של טרי (אפור), הקפאה (כחול), ו-droplet בתפזורת (ירוק) בימי התרבות 3, 5, ו -7. (ב) הפקת האוריאה של טרי, קריואופרסטית, ובכמות גדולה של droplet המופיציטים. כוכבים: p < 0.05 (לזווג בכיוון אחד ANOVA ואחריו תיקון tukey עבור בדיקות מרובות). קווי שגיאה: סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הקפאת ההזמנה של hepatocytes על ידי הקפאה איטית תוצאות הכדאיות מופחתת פונקציה מטבולית. ויטריפיקציה מציעה חלופה מבטיחה לקריוגנית קלאסית, כאשר הפציעה הקפואה נמנעת לחלוטין9. עם זאת, טרום דגירה עם CPAs נדרש כדי להקטין את קצב הקירור הקריטי8. כתוצאה מכך, הויטריפיקציה מהרעילות של רואי החשבון17 ומוגבלת לנפחים קטנים של מדגם. במאמצים להתגבר על מגבלות אלה ויטריפיקציה בצובר השיטה droplet שהוצגו בכתב יד זה פותחה כדי לאפשר ויטריפיקציה של כמויות גדולות של תאים תוך שימוש נמוך מראש האנטי-מודח הריכוז של רואי חשבון15. זו ויטריפיקציה בצובר מוביל את הכדאיות hepatocyte ותפקוד מטבולית לעומת שיטת ההקפאה האופטימלית ביותר איטית הקפאה בספרות. כאן, השיטות המקיפות של הויטריפיקציה droplet בצובר ותובנות מפורטות בהיבטים המעשיים של ההליכים מסופקים.

שלבים מרובים בפרוטוקול הם קריטיים ודורשים תשומת לב נוספת. מילוי של Dewar עם חנקן נוזלי לא מעוקר עשוי להיות מוביל למצב סטרילי למחצה. באמצעות אמצעי הזהירות הסביר בפרוטוקול, שום זיהום נחשף במהלך התרבויות שלנו לטווח ארוך כריך קולגן. עם זאת, ניתן לנקוט באמצעי עיקור נוספים אם הדבר הכרחי. חנקן נוזלי יכול להיות מעוקר על ידי קרינה או סינון16 והמערכת עשויה להיות סגורה לחלוטין עם מכסה בחנקן נוזלי dewar עם ארובה מחובר מחט ערבוב. לחלופין, ניתן לחקור שיטות droplet ויטריפיקציה שאינן מפנות למערכת, למרות שהדבר עלול להגביל את תפוקת הנפח הגדולה יותר14.

חלקים חיוניים אחרים של הפרוטוקול הם הטעינה מראש של רואי החשבון ופריקת המשך הדגירה. משכים ארוכים יותר עלולים לגרום לפציעה של רואי חשבון רעילים בעוד שמשכים קצרים יותר עלולים לגרום לפציעה אוסמוטי. כמו כן, חשוב להבטיח כי טיפות הפטוציט הקשה תמיד להישאר מתחת לטמפרטורת המעבר זכוכית משום בלתי מבוקרת מאקרו-ומיקרוסקופית קרח בטמפרטורות גבוהות להוביל לפציעה ההיציט חמור ומוות תאים. מנקודת מבט מעשית, הצעד הקריטי ביותר בצובר droplet ויטריפיקציה הוא התחממות מחדש של טיפות hepatocyte. כאשר הטיפות מוסרות מן החנקן הנוזלי הם יכולים להקפיא בתוך שניות אם לא rewarmed במהירות על ידי הוספת מיידי של פתרון התחממות מחדש חם.

אופטימיזציה עתידית של בצובר droplet ויטריפיקציה יכול עוד לשפר את תוצאות השימור, כגון הכדאיות, תשואה, ואת תפקוד חילוף החומרים. שניהם חדירות ושאינם חדירות ניתן לבדוק כדי למטב את התייבשות אוסמוטי לקראת ויטריפיקציה. זה יכול להפחית את ההלם האוסמוטי במהלך התייבשות ואולי גם לאפשר להקטין את ריכוזי CPA מראש מתקופת הדגירה. בנוסף, פלואידיג רציף, במקום batchwise, רואי חשבון טרום הדגירה יהיה תיאורטית לאפשר ויטריפיקציה של כמויות תאים בלתי מוגבל. כי רק ציוד כללי במעבדה נדרש עבור droplet גורפת ויטריפיקציה, היא שיטת שימור פשוטה וחסכונית אשר עלול לשמש לשימור סוגי תאים אחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים על אינטרסים פיננסיים מתחרים. ד ר דה פריז, וואנג, טונר, Tessier, ו Ugun יש בקשות פטנט הזמניים הרלוונטיים למחקר זה. לד ר אויגאן יש אינטרס פיננסי בפתרונות איברים, חברה המתמקדת בפיתוח טכנולוגיית שימור איברים. כל האינטרסים של החוקרים מנוהלים על ידי הבריאות של MGH ושותפים בהתאם לסכסוך המדיניות שלהם.

Acknowledgments

מימון ממוסדות הבריאות הלאומיים של ארה ב (R01DK096075, R01DK107875, R01DK114506) ומשרד ההגנה של ארה ב (משרד הבטחון RTRP W81XWH-17-1-0680) מודה מאוד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD Disposable 3 mL Syringes with Luer-Lok Tips Fisher Scientific 14-823-435
Beaker Sigma-Aldrich CLS1000-250
Belzer UW Cold Storage Solution Bridge to Life BUW-001
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906
Cole-Parmer Female Luer to 1/16" low-profile semi-rigid tubing barb, PP Cole-Parmer EW-45508-12
Cryogentic stroage tank / Cryotank Chart Industries MVE 800
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D8418
DMEM, powder, high glucose, pyruvate Life Technologies 12800-082
Ethylene Glycol Sigma-Aldrich 107-21-1
Extra long forceps Fisher Scientific 10-316C
Fisherbrand Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes - Flat top closure Fisher Scientific 06-443-18
Fishing line Stren SOFS4-15
Liquid nitrogen Airgas 7727-37-9
Masterflex L/S Platinum-Cured Silicone Tubing, L/S 14 Cole-Parmer EW-96410-14
Mix Tips, For Use With 3HPW1 Grainger 3WRL7
Nalgene Polypropylene Powder Funnel ThermoFisher 4252-0100
Needle 20 ga Becton Dickinson (BD) 305175
Parafilm M - Flexible film Sigma-Aldrich P7793-1EA
Razor Blade Fisher Scientific 12-640
Spatula Cole-Parmer EW-06369-18  
Steriflip sterile filter Fisher Scientific SE1M179M6
Sucrose (Crystalline/Certified ACS) Fisher Scientific S5-500
Syringe Pump New Era Pump Systems Inc. NE-1000
Thermo-Flask Benchtop Liquid Nitrogen Container ThermoFisher 2122

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carpentier, B., Gautier, A., Legallais, C. Artificial and bioartificial liver devices: present and future. Gut. 58 (12), 1690-1702 (2009).
  2. Fox, I. J., Chowdhury, J. R. Hepatocyte transplantation: Hepatocyte transplantation. American Journal of Transplantation. 4, 7-13 (2004).
  3. Hughes, R. D., Mitry, R. R., Dhawan, A. Current Status of Hepatocyte Transplantation. Transplantation. 93 (4), 342-347 (2012).
  4. Stéphenne, X., Najimi, M., Sokal, E. M. Hepatocyte cryopreservation: is it time to change the strategy. World Journal of Gastroenterology. 16 (1), 1-14 (2010).
  5. Terry, C., Dhawan, A., Mitry, R. R., Lehec, S. C., Hughes, R. D. Optimization of the cryopreservation and thawing protocol for human hepatocytes for use in cell transplantation. Liver Transplantation. 16 (2), 229-237 (2010).
  6. Pegg, D. E. Principles of cryopreservation. Methods in Molecular Biology. 368, 39 (2007).
  7. Baust, J. G., Gao, D., Baust, J. M. Cryopreservation: An emerging paradigm change. Organogenesis. 5 (3), 90-96 (2009).
  8. Hopkins, J. B., Badeau, R., Warkentin, M., Thorne, R. E. Effect of common cryoprotectants on critical warming rates and ice formation in aqueous solutions. Cryobiology. 65 (3), 169-178 (2012).
  9. Fahy, G. M., MacFarlane, D. R., Angell, C. A., Meryman, H. T. Vitrification as an approach to cryopreservation. Cryobiology. 21 (4), 407-426 (1984).
  10. Demirci, U., Montesano, G. Cell encapsulating droplet vitrification. Lab on a Chip. 7 (11), 1428 (2007).
  11. El Assal, R., et al. Bio-Inspired Cryo-Ink Preserves Red Blood Cell Phenotype and Function During Nanoliter Vitrification. Advanced Materials. 26 (33), 5815-5822 (2014).
  12. Dou, R., Saunders, R. E., Mohamet, L., Ward, C. M., Derby, B. High throughput cryopreservation of cells by rapid freezing of sub-μl drops using inkjet printing--cryoprinting. Lab on a Chip. 15 (17), 3503-3513 (2015).
  13. Samot, J., et al. Blood banking in living droplets. PloS One. 6 (3), 17530 (2011).
  14. Shi, M., et al. High-Throughput Non-Contact Vitrification of Cell-Laden Droplets Based on Cell Printing. Scientific Reports. 5 (1), (2016).
  15. de Vries, R. J., et al. Bulk Droplet Vitrification: An Approach to Improve Large-Scale Hepatocyte Cryopreservation Outcome. Langmuir. , (2019).
  16. Parmegiani, L., et al. Sterilization of liquid nitrogen with ultraviolet irradiation for safe vitrification of human oocytes or embryos. Fertility and Sterility. 94 (4), 1525-1528 (2010).
  17. Best, B. P. Cryoprotectant Toxicity: Facts, Issues, and Questions. Rejuvenation Research. 18 (5), 422-436 (2015).

Tags

ביו-הנדסה סוגיה 152 הפטציט בידוד החרופציט ראשוני droplet ויטריפיקציה הקפאה כימיות סוכן התייבשות סלולרית
בצובר Droplet ויטריפיקציה עבור שימור ההירופציט הראשי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

de Vries, R. J., Banik, P. D.,… More

de Vries, R. J., Banik, P. D., Nagpal, S., Weng, L., Ozer, S., van Gulik, T. M., Toner, M., Tessier, S. N., Uygun, K. Bulk Droplet Vitrification for Primary Hepatocyte Preservation. J. Vis. Exp. (152), e60250, doi:10.3791/60250 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter