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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Un modelo de xenoinjerto derivado del paciente para la malformación venosa

Published: June 15, 2020 doi: 10.3791/61501
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Division of Experimental Hematology and Cancer Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Presentamos un protocolo detallado para generar un modelo de xenoinjerto murino de malformación venosa. Este modelo se basa en la inyección subcutánea de células endoteliales derivadas del paciente que contienen mutaciones hiperactivantes de los genes TIE2 y/o PIK3CA. Las lesiones de xenoinjerto recapitulan estrechamente las características histopatológicas del tejido del paciente con VM.

Abstract

La malformación venosa (VM) es una anomalía vascular que surge del deterioro del desarrollo de la red venosa que resulta en venas dilatadas y a menudo disfuncionales. El propósito de este artículo es describir cuidadosamente el establecimiento de un modelo de xenoinjerto murino que imita la VM humana y es capaz de reflejar la heterogeneidad del paciente. Las mutaciones TEK (TEK2) y PIK3CA no heredadas hiperactivantes en células endoteliales (EC) se han identificado como los principales impulsores de la ampliación patológica del buque en la máquina virtual. El siguiente protocolo describe el aislamiento, purificación y expansión de la CE derivada del paciente que expresa EL TIE2 mutante y/o PIK3CA. Estas EC se inyectan por vía subcutánea en la parte posterior de ratones athímicos inmunodeficientes para generar canales vasculares ectáticos. Las lesiones generadas con TIE2 o PIK3CA-mutant EC se vascularizan visiblemente dentro de los 7 u20129 días de la inyección y recapitulan las características histopatológicas del tejido del paciente con VM. Este modelo de xenoinjerto de VM proporciona una plataforma confiable para investigar los mecanismos celulares y moleculares que impulsan la formación y expansión de máquinas virtuales. Además, este modelo será fundamental para los estudios traslacionales que prueban la eficacia de los nuevos candidatos a fármacos en la prevención de la ampliación anormal de los vasos observados en la máquina virtual humana.

Introduction

Los defectos en el desarrollo de la vasculatura son la causa subyacente de muchas enfermedades, incluida la malformación venosa (VM). La VM es una enfermedad congénita caracterizada por morfogénesis anormal y expansión de las venas1. Importantes estudios sobre el tejido VM y las células endoteliales (EC) han identificado mutaciones de ganancia de función en dos genes: TEK, que codifica el receptor de tirosina quinasa TIE2, y PIK3CA,que codifica la isoforma p110o (subunidad catalítica) de PI3-kinasa (PI3K)2,3,,4,5. Estas mutaciones somáticas dan lugar a la hiperactivación independiente del ligando de vías clave de señalización angiogénica/crecimiento, incluyendo PI3K/AKT, lo que resulta en venas ectáticas dilatadas3. A pesar de estos importantes descubrimientos genéticos, los mecanismos celulares y moleculares subsiguientes que desencadenan la angiogénesis anormal y la formación de canales vasculares agrandados todavía no se entienden completamente.

Durante la angiogénesis normal y patológica, los nuevos vasos brotan de una red vascular preexistente y la EC se someten a una secuencia de procesos celulares importantes, incluyendo la proliferación, la migración, la remodelación de la matriz extracelular (ECM) y la formación de lúmenes6. Los cultivos in vitro bidimensionales y tridimensionales (2D/3D) de EC son herramientas importantes para investigar cada una de estas propiedades celulares individualmente. Sin embargo, existe una clara demanda de un modelo de ratón que recapitula la ampliación de los vasos patológicos dentro del microambiente anfitrión, al tiempo que proporciona una plataforma eficaz para la evaluación preclínica de fármacos específicos para la investigación traslacional.

Hasta la fecha, no se ha notificado un modelo murino transgénico de VM asociado con mutaciones de ganancia de función de TIE2. Los modelos actuales de ratón VM transgénicos se basan en la expresión omnipresente o restringida en los tejidos de la mutación activadora PIK3CA p.H1047R3,5. Estos animales transgénicos proporcionan una visión significativa de los efectos específicos de todo el cuerpo o tejido de esta mutación PIK3CA de punto caliente. La limitación de estos modelos es la formación de una red vascular altamente patológica que resulta en la letalidad temprana. Por lo tanto, estos modelos de ratón no reflejan completamente la ocurrencia esporádica de eventos mutacionales y la naturaleza localizada de la patología de la VM.

Por el contrario, los modelos de xenoinjerto derivados del paciente se basan en el trasplante o la inyección de tejido patológico o células derivadas de pacientes en ratones inmunodeficientes7. Los modelos de xenoinjertos son una poderosa herramienta para ampliar el conocimiento sobre el desarrollo de enfermedades y el descubrimiento de nuevos agentes terapéuticos8. Además, el uso de células derivadas del paciente permite a los científicos recapitular la heterogeneidad de la mutación para estudiar el espectro de fenotipos de pacientes.

Aquí, describimos un protocolo en el que la EC VM derivada del paciente que expresa una forma mutante constitutivamente activa de TIE2 y/o PIK3CA se inyecta por vía subcutánea en la parte posterior de ratones desnudos athímicos. Las células vasculares inyectadas se suspenden en un marco ECM para promover la angiogénesis como se describe en los modelos anteriores de xenoinjerto vascular9,10,11. Estos VM EC sufren una morfogénesis significativa y generan vasos patológicos agrandados y perfundidos en ausencia de células de soporte. El modelo de xenoinjerto descrito de VM proporciona una plataforma eficiente para la evaluación preclínica de fármacos específicos por su capacidad para inhibir la expansión de lúmenes no controlada.

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Protocol

Las muestras de tejido del paciente se obtuvieron de los participantes después del consentimiento informado de la Colección y Repositorio de Muestras de Tejidos y Datos de Pacientes con Tumores y Anomalías Vasculares bajo una Junta de Revisión Institucional (IRB) aprobada por las políticas institucionales en Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC), Cancer and Blood Disease Institute y con la aprobación del Comité de Investigación Clínica. Todos los procedimientos con animales descritos a continuación han sido revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la CCHMC.

1. Preparación de materiales y soluciones de stock

  1. Preparación de un medio de crecimiento completo de células endoteliales (EGM)
    1. Suplemento endotelial basal medio (EBM) con los siguientes factores de crecimiento presentes en el kit (ver Tabla de Materiales):Factor de Crecimiento de Fibroblasto humano-Beta (hFGF-), Factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), Largo Arg3 Insulina-Like Factor de Crecimiento- I (R3-IGF-I), ácido ascórbico, factor de crecimiento epidérmico (EGF), gentamicina sulfato y ampatería de Añadir 1% De Penicilina/Estreptomicina/L-Glutamina (PSG) solución y 20% de suero bovino fetal (FBS).
      NOTA: No recomendamos añadir hidrocortisona.
    2. La solución estéril filtra la solución bajo una campana de flujo laminar a través de un filtro superior de botella de 0,2 m en una botella de vidrio autoclavado y medios de alícuota en tubos cónicos de 50 ml y se almacena a 4 oC hasta una semana o a -20 oC durante un año.
  2. Preparar colagenasa Una solución de stock
    1. Preparar 50 mg/ml de colagenasa Una solución en stock en 1x solución salina tampón de fosfato (PBS).
    2. Filtro estéril de la solución bajo una campana de flujo laminar con filtro y jeringa de 0,2 m, y almacenar 100 l de alícuotas a -20 oC.
  3. Preparar el medio de recogida de tejido (Buffer A)
    1. Preparar una solución de Stock ca2+/Mg2+ añadiendo 0,927 g de cloruro de calcio dihidrato (CaCl2.2H 2O) y 1 g de sulfato de magnesio heptahidrato (MgSO4.7H2O) a 500 ml de agua destilada. La solución estéril filtra la solución a través de un filtro superior de botella de 0,2 m en una botella de vidrio autoclavado y se almacena a temperatura ambiente (RT).
    2. Suplemento Medio águila modificada de Dulbecco (DMEM) con solución 10% Ca2+/Mg2+ y 2% FBS.
    3. Filtro estéril de la solución bajo una campana de flujo laminar con filtro y jeringa de 0,2 m y almacenar alícuotas de 5 ml a -20 oC.
  4. Recubrimiento de fibronectina de placas de cultivo de tejidos
    1. Preparar el tampón de recubrimiento (Buffer B) disolviendo 5,3 g de carbonato sódico (Na2CO3; 0,1 M) en 500 ml de agua desionizada. Ajuste el pH del tampón a 9,4 utilizando ácido clorhídrico de 1 M (HCl). Filtrar bajo una campana de flujo laminar a través de un filtro superior de botella de 0,2 m en una botella de vidrio autoclavado y almacenar en RT.
    2. Para recubrimiento, pipeta 2 mL/5 mL/10 mL de Tampón B por placa de cultivo de tejido de 60 mm/100 mm/145 mm, respectivamente. Añadir 1 g/cm2 de solución de proteína purificada de fibronectina plasmática humana y distribuir suavemente el líquido sobre la placa.
    3. Incubar la placa a 37oC, 5% CO2 durante 20 min.
    4. Aspirar el búfer B y lavar la placa con PBS antes de cultivar las células.

2. Aislamiento de células endoteliales del tejido del paciente VM

  1. Aislamiento de la CE del tejido sólido de VM
    NOTA: El tejido VM se resegura mediante la desbulción de la cirugía12,,13 bajo un protocolo aprobado por el IRB.
    1. Lavar el tejido VM (el peso de la muestra de tejido suele oscilar entre 0,5 g y 1,5 g) en un 5% de PSG en PBS.
    2. Transfiera el tejido a un plato de cultivo celular de 100 mm, muestree la muestra de tejido picado en trozos pequeños utilizando herramientas de disección quirúrgica estériles y transfiera a un tubo cónico de 50 ml.
    3. Añadir 100 l de colagenasa Una solución de stock a 5 ml de Tampón A para una concentración final de 1 mg/ml, luego añadir esto al tejido y digerir el tejido picado a 37 oC durante 30 min mientras agita el contenido cada 5 min.
    4. Moler cuidadosamente el tejido digerido en RT utilizando una amoladora de pestle de superficie lisa de 6 mm dentro del tubo cónico de 50 ml.
    5. Continúe moliendo cuidadosamente el tejido digerido usando un pestle mientras agrega 5 ml de PBS frío complementado con 0.5% de albúmina sérica bovina (BSA) y 2% PSG. Repita este paso cuatro veces.
    6. Filtrar la solución a través de un colador celular de 100 m en un tubo cónico de 50 ml para eliminar fragmentos de tejido.
    7. Suspensión de la célula de centrifugadora durante 5 min a 400 x g en RT. Proceda al paso 2.3.
  2. Aislamiento de VM EC a partir de sangre lesionada obtenida de la escleroterapia del paciente
    1. Obtener sangre lesional de VM humana de la escleroterapia bajo un protocolo aprobado por el IRB.
    2. Diluir la sangre lesional (el volumen de la muestra suele oscilar entre 0,5 ml y 5 ml) en PBS y un volumen final de 40 ml.
    3. Suspensión de la célula de centrífuga durante 5 min a 200 x g en RT.
  3. Revestimiento inicial de celdas
    1. Deseche el sobrenadante y resusppend el pellet de una sola célula en 1 ml de EGM.
    2. Añadir 9 ml de EGM completo en placas recubiertas de fibronectina (1 g/cm2) de 100 mm y semilla 1 ml de suspensión celular.
    3. Incubar las células a 37oC en una atmósfera humidificada del 5% deCO2.
    4. Cada dos días retire 2 mL de medios y agregue 2 ml de FBS filtrado estéril.
    5. Una vez que los cultivos celulares alcanzan una confluencia de 40-u201250% cambiar el medio para completar EGM. Por lo general, las células tardan entre 2.u20123 semanas en alcanzar esta confluencia.
    6. Observar diariamente la aparición de colonias de EC. Pueden ser reconocidos por su morfología típica "como el adoquines"(Figura 1A). En cada muestra aparecen colonias EC de 3o3o3125.
    7. Cambie el medio cada dos días durante otros 5 días de 5 a 20127 días hasta que las colonias individuales de la CE comiencen a tocarse unas a otras.
  4. Aislamiento manual de colonias ec individuales
    1. Para cosechar colonias EC, lave la placa con 5 ml de PBS y aspire manualmente con una pipeta serológica.
    2. Lleve la placa a un microscopio y circule las ubicaciones de varias colonias EC usando una pluma de marcado tanto en la tapa como en la parte inferior antes de devolverla a la campana de flujo laminar.
    3. Separe las colonias de EC pipeteando 50 l de solución de trippsina-EDTA al 0,05% en las áreas marcadas.
    4. Usando un rascador de celda pequeña o una punta de pipeta, raspe suavemente las células de la placa.
    5. Incline la placa hasta el borde más cercano y enjuague con 1 ml de EGM por área marcada y recoja las células.
    6. Cuente el número de células utilizando un hemocitoómetro o un contador de células automatizado.
    7. Plato de las colonias EC recogidas a una densidad de 1 x 104 células/cm2 en platos de cultivo celular recubiertos de fibronectina (1 g/cm2) que contengan EGM fresco. Al día siguiente, cambie el medio a EGM completo.
    8. Cambie el medio para completar el EGM cada dos días durante 2-u20123 semanas hasta que las células alcancen el 80% de confluencia.
    9. Trypsinize EC con 2 ml de precalentó 0.05% de trippsina-EDTA por plato de 100 mm a 37 oC durante 2 min y neutralizar la trippsina añadiendo 4 ml de EGM.
    10. Recoger la suspensión celular en un tubo cónico de 15 ml y centrífuga a 400 x g en RT durante 5 min. Aspirar las células sobrenadantes y resuspendidas en 2 ml de EGM.
    11. Cuente el número de células utilizando un hemocitoómetro o un contador de células automatizado. Los números de celda típicos obtenidos son 1 x 106 células por placa de cultivo celular de 60 mm o 2 x 106 células por placa de cultivo de tejido de 100 mm.
    12. Pele el líquido de las células por centrifugación a 400 x g a RT durante 5 minutos y aspirar el sobrenadante. Continúe con el paso 3.2.1.

3. Selección y expansión de células endoteliales

  1. Preparación de perlas magnéticas anti-CD31-conjugadas
    1. Vórtice el vial que contiene las perlas magnéticas anti-CD31-conjugadas durante 30 s. El número de perlas requeridas es 8 x 106 perlas/2 x 106 células.
    2. Lavar la cantidad deseada de perlas magnéticas anti-CD31-conjugadas con 1 ml de solución de lavado que contiene 0.1% de BSA en PBS en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
    3. Coloque el tubo de microcentrífuga en un imán de aislamiento celular durante 1 min.
    4. Aspirar el sobrenadante y repetir el paso de lavado.
  2. Purificación y enchapado de células endoteliales
    1. Pellet de célula resuspendida obtenido en 2.4.12 en 500 l de solución de lavado que contiene 0.1% de BSA en PBS.
    2. Añadir solución celular al tubo de microcentrífuga que contiene perlas magnéticas y resuspend a fondo.
    3. Incubar durante 20 min a 4oC con una suave inclinación.
    4. Añadir 500 l de 0,1% de BSA en PBS y mezclar bien.
    5. Coloque el tubo sobre un imán de aislamiento celular durante 1 min.
    6. Aspirar suavemente todo el líquido, que contiene la fracción CD31 negativa de las células sin tocar las cuentas.
    7. Lavar el pellet de cordón que contiene la fracción de célula CD31 positiva con 1 ml de 0.1% BSA en PBS y repetir la separación magnética.
    8. Repita el lavado y el paso de separación magnética durante un mínimo de 3 veces para purificar la fracción de celda CD31 positiva.
    9. Resuspender las células endoteliales purificadas en un tubo cónico de 15 ml y girar hacia abajo durante 5 minutos a 400 x g en RT.
    10. Retire el sobrenadante y el pellet de célula resuspendida en 1 ml de EGM.
    11. Añadir 9 ml de EGM completo en placas recubiertas de fibronectina (1 g/cm2) de 100 mm y semilla 1 ml de suspensión celular. Tenga en cuenta que algunas perlas magnéticas todavía están unidas a las células en este paso inicial de siembra. La mayoría de las cuentas se lavan durante la expansión celular, pero un pequeño número de cuentas puede persistir en los pasajes tempranos.
    12. Incubar las células a 37oC en una atmósfera humidificada del 5% deCO2.
    13. Cambie el medio cada dos días hasta que las células alcancen el 80 % de confluencia (Figura 1B).
  3. Expansión de células endoteliales
    1. Una vez que las células alcanzan el 80 % de confluencia, desprende con 2 ml de 0,05% de trippsina-EDTA por plato de 100 mm a 37 oC durante 2 min.
    2. Neutralice la trippsina añadiendo 4 ml de EGM y recoja células en un tubo cónico de 15 ml.
    3. Centrífuga a 400 x g a RT durante 5 min.
    4. Aspirar el sobrenadante, resuspend las células en 2 ml de EGM, y contar el número de células con un hemocitoómetro o mediante el recuento automatizado de células.
    5. Células de semillas a una densidad de 1 x 104 células/cm2 en placas de cultivo de tejido recubiertas de fibronectina de 145 mm (1 g/cm2).
    6. Continúe pasando las celdas hasta que se haya alcanzado el número de celda deseado. Tenga en cuenta que una placa de cultivo de tejido confluente de 145 mm contiene aproximadamente 8 -u20129 x 106 células y el número de células necesarias es 2,5 x 106 células por inyección. Sólo se deben considerar las células entre los pasos 3 y 8 para el xenoinjerto.

4. Protocolo de xenoinjerto derivado del paciente VM

NOTA: En este protocolo utilizamos ratones Foxn1 desnudos de Foxn1 de 5nu años de edad, inmunodeficientes y athímicos.

Todos los procedimientos con animales deben ser aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC).

  1. Preparación de materiales el día antes de la inyección
    1. Pre-enfriar jeringas, agujas y puntas de pipeteo en el congelador de -20 oC durante la noche.
    2. Descongelar lentamente la matriz extracelular de membrana del sótano (BMEM) durante la noche en un cubo de hielo colocado a 4 oC para evitar una mayor viscosidad del gel.
  2. Preparación de la suspensión celular inyectable
    1. Trypsinize EC con 5 ml de precalentó 0.05% de trippsina-EDTA por plato de 145 mm a 37 oC durante 2 min.
    2. Neutralice la trippsina añadiendo 5 ml de EGM y recoja células en un tubo cónico de 15 ml.
    3. Centrífuga a 400 x g a RT durante 5 min.
    4. Aspirar el sobrenadante, resuspend las células en 3 ml de EGM, y contar el número de células utilizando un hemocitoómetro o contador de células automatizado.
    5. Determine el número total de celdas que se necesitan para todas las inyecciones planificadas.
      NOTA: El número recomendado de celdas es de 2,5 x 106 células por inyección. Un total de 2 inyecciones se realizan típicamente en cada ratón para duplicados técnicos. Es necesario calcular un exceso del 10% del número de celda para tener en cuenta la pérdida durante la transferencia a la jeringa.
    6. Transfiera el volumen que contiene el número de celda calculado a un nuevo tubo cónico de 50 ml y células de pellets por centrifugación a 400 x g a RT durante 5 min.
    7. Aspirar el sobrenadante, dejando un pequeño volumen (alrededor de 50-u201270 l) para aflojar el pellet.
  3. Preparación de jeringas
    1. Calcule un volumen sobrante de 20 l/inyección para tener en cuenta la pérdida durante la transferencia a la jeringa. Resuspender el pellet celular con 220 l de BMEM por inyección en hielo. El volumen inyectado de la suspensión celular será de 200 l por lesión.
    2. Mezcle bien la suspensión celular sobre hielo para obtener una suspensión celular homogénea y evitar la creación de burbujas.
    3. Usando una pipeta de 1 ml y una jeringa de 1 ml, pipetee simultáneamente la mezcla de células BMEM en la abertura de la jeringa por fuerza de succión mientras tira del émbolo de la jeringa.
    4. Luer bloquee una aguja estéril de 26G x 5/8 pulgadas a la jeringa y mantenga las jeringas preparadas sobre hielo antes de la inyección.
  4. Inyección subcutánea en el ratón
    1. Anestfetizar los ratones con 5% de mezcla de isoflurano/oxígeno a un caudal de 1 L/min utilizando un vaporizador de isoflurano. Asegurar la sedación adecuada de los animales (por ejemplo, falta de respuesta a los pellizcos de los dedos de los dedos). Mantener la anestesia mediante la administración continua de 1,5% de isoflurano/oxígeno suministrado a través del cono nasal.
    2. Coloque ratones en el estómago, exponiendo la región posterior donde se producirá el injerto y desinfecte la región de inyección con un 70% de etanol.
    3. Enrolle suavemente la jeringa preparada para resuspender las células asentadas. Deslice burbujas hasta el extremo de la aguja de la jeringa y expulse un pequeño volumen de la suspensión celular para asegurar la eliminación de todas las burbujas.
      NOTA: Se pueden realizar dos inyecciones para cada ratón: a la izquierda y a la derecha de la parte posterior del ratón.
    4. Pinche y cree una estructura 'similar a una tienda' con el pulgar y el dedo índice e inserte la aguja por vía subcutánea justo debajo de la piel. Asegúrese de que la aguja sólo es la piel profunda mediante la liberación de la piel pellizcada para evitar la inyección en el tejido muscular.
    5. Sosteniendo la aguja en un ángulo de 45o inyectar cuidadosamente 200 s de la suspensión celular para crear una pequeña masa esférica (Figura 1C).
    6. Registre el peso del ratón con una báscula, etiquete el ratón y vuelva a la jaula.
    7. Supervise los ratones después de la sedación para asegurarse de que vuelvan a la actividad normal.
  5. Monitorización del crecimiento de lesiones
    1. Usando una pinza, mida la longitud y la anchura de cada enchufe (Figura 1D).
    2. Mediciones de documentos cada dos días hasta la recolección de lesiones.

5. Recolección y procesamiento de tejidos

  1. Eutanasiar los ratones 9 días después de la implantación en una cámara deCO2 y comprobar los signos vitales para confirmar la muerte. Realizar la luxación cervical en los ratones como un método secundario para eutanasiar el ratón.
  2. Cosecha la lesión/enchufe de xenoinjerto del flanco del ratón mediante disección utilizando fórceps quirúrgicos y tijeras.
    NOTA: Para evitar la rotura de los vasos llenos de sangre dentro del tapón, es importante evitar tocar el tapón de la lesión con herramientas de disección y dejar el tejido circundante excesivo, como la piel unida al tapón.
  3. Sumerja la lesión resecada en PBS para lavarla.
  4. Configure un escenario de cámara con una cámara. Alinee los enchufes en una placa de corte con una regla. Tome una imagen de todos los tapones para registrar la vascularización bruta de las lesiones (Figura 1E).
  5. Arreglar enchufes sumergiendo en 10% formalina durante la noche en RT.
  6. Lave los tapones en PBS al día siguiente y muévalos al 70% de etanol.
  7. Tapones de lesiones de proceso para incrustación de parafina (núcleo patólogo).

6. Seccionamiento de lesiones

  1. Utilice un microtoma para cortar secciones de 5 m de las lesiones murinas recogidas en diapositivas cargadas positivamente.
    NOTA: Para el análisis posterior, las secciones en el centro del enchufe (alrededor de 50-u201270 m en el tejido) son de importancia.
  2. Derretir la parafina a 60oC durante 1 h antes de la tinción.
  3. Desfilinizar y rehidratar el tejido secuencialmente bajo una campana de flujo de humo químico. Por lo tanto, incubar el tobogán en xileno durante 10 min, 100% etanol (EtOH) durante 5 min, 90% EtOH durante 3 min, y 80% EtOH durante 3 min.
  4. Enjuague el tobogán en agua desionizada durante 5 min.

7. Hematoxilina y Eosina (H&E)

  1. Incubar secciones en Hematoxilina durante 2 min.
  2. Coloque los portaobjetos en un frasco de tinción y enjuague en un fregadero con una corriente constante de agua del grifo hasta que el agua esté limpia.
  3. Deshidrate los portaobjetos incubando el tejido secuencialmente en 70% EtOH durante 1 min, 80% EtOH durante 1 min, 90% EtOH durante 1 min, 100% EtOH durante 1 min, y fresco 100% EtOH durante 1 min.
  4. Secciones de manchas en Eosin Y durante 30 s.
  5. Enjuagar en 100% EtOH hasta que la solución esté transparente.
  6. Incubar el tobogán en xilenos durante 2 min. Deje que los portaobjetos se sequen durante 5o u201210 min bajo la campana de humos.
  7. Dispensar una gota de medio de montaje permanente y no acuoso sobre secciones de xenoinjertos y colocar el cubreobjetos en la parte superior.
  8. Deje que las diapositivas se sequen durante la noche antes de tomar imágenes.

8. Inmunohistoquímica

  1. Preparar el tampón de recuperación de antígenos (Tris-EDTA) pesando 0,6 g de tris-base y 1 ml de 0,5 M EDTA a 500 ml de agua desionizada. Ajuste el pH a 9.0 usando 1 M HCl. Añadir 250 l de Tween-20.
  2. Incubar portaobjetos de tejido desfilinizados (como se obtuvo en el paso 6.2-u20126.3) en un vaso de precipitados con tampón de recuperación de antígenos, agitando en un bloque de calentamiento, durante 20 minutos a 95 oC.
  3. Retire el vaso de precipitados del bloque de calefacción, deje que la solución se enfríe a 35 oC y luego lave en PBS durante 3 minutos.
  4. Bloquear secciones de tejido en 5% suero de caballo normal en PBS durante 30 min en RT.
  5. Preparar una solución de trabajo biotinilo con Ulex europaeus agglutinina-I (UEA-I) diluyendo 20 g/ml de UEA-I biotinilado en un 5% de suero de caballo normal en PBS.
  6. Pipet 50-u2012100 l de solución de trabajo UEA-I por sección e incubar durante 1 h en RT en una cámara humidificadora.
  7. Lave los portaobjetos dos veces en PBS durante 3 min.
  8. Secciones deslizantes de enfriamiento en peróxido de hidrógeno al 3% durante 5 minutos en RT.
  9. Lave los portaobjetos dos veces en PBS durante 3 min.
  10. Preparar 5 g/ml de rábano picante de Streptavidin conjugado con peroxidasa en un 5% de suero de caballo normal en PBS.
  11. Pipet 50-u2012100 l en cada corredera de tejido e incubar durante 1 h en RT en una cámara humidificadora.
  12. Lave los portaobjetos dos veces en PBS durante 3 min.
  13. Preparar la solución de 3,3'Diaminobenzidina (DAB) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y añadir 50-u2012100 l por sección.
  14. Incubar secciones durante 10o u201215 min, comprobando y monitoreando el desarrollo de la mancha cada 2o 20125 min.
  15. Lave los portaobjetos tres veces en PBS durante 3 min.
  16. Añadir una gota de Hematoxilina e incubar durante 3 min.
  17. Coloque los portaobjetos en un frasco de tinción y enjuague en un fregadero con una corriente constante de agua del grifo hasta que el agua esté limpia.
  18. Incubar secuencialmente el tobogán en 80% EtOH durante 1 min, 90% EtOH durante 1 min, 100% EtOH durante 1 min, y xileno durante 2 min.
  19. Deje que los portaobjetos se sequen durante 5o u201210 min bajo la campana de humos.
  20. Dispensar una gota de medio de montaje permanente y no acuoso sobre secciones de xenoinjertos y colocar el cubreobjetos en la parte superior.
  21. Deje que las diapositivas se sequen durante la noche antes de tomar imágenes.

9. Análisis de los canales vasculares de origen humano

NOTA: La vascularización de las lesiones VM se cuantifica midiendo el área vascular y la densidad vascular. Sólo los canales vasculares positivos de UEA-I, derivados del ser humano, se consideran para la cuantificación.

  1. Tome de cuatro a cinco imágenes por sección de lesión con un microscopio de campo brillante con un aumento de 20 veces (campos de alta potencia [HPF]). Tome imágenes HPF en un patrón de plano x dentro de la sección de lesiones para evitar la superposición (Figura 1F-H). Incluya una barra de escala en las imágenes tomadas.
  2. Abra las imágenes HPF en La imagen J (Archivo > Abrir). Calibre los píxeles de la barra de escala de la siguiente manera. Utilice la herramienta de línea recta y vaya sobre la barra de escala. Para convertir los píxeles medidos en mm, haga clic en Analizar > Establecer escala.
  3. Haga clic en Analizar > Definir medidas y seleccione Area y Add to overlay.
  4. Mida el área de campo total en un HPF utilizando Analizar > Medir. Guarde esta medición para la cuantificación en el paso 9.8.
  5. Usando la herramienta de selección a mano alzada, esboce manualmente LOS canales vasculares UEA-I+.
    NOTA: Un canal vascular se define como cualquier área que está forrada con UEA-I+ - EC que puede contener células sanguíneas.
  6. Haga clic en Analizar > Medir para cuantificar el área vascular UEA-I+ delineada (mm2/HPF).
  7. Repita esta medición para los cinco HPF tomados dentro de un enchufe.
  8. Promedio del área vascular total de los cinco HPF. El área vascular obtenida por HPF se divide posteriormente por el área de campo de HPF (en mm2, paso 9.5) y se expresa como un porcentaje (%).
  9. Para la cuantificación de la densidad vascular, cuente el número de canales vasculares UEA-I+ de cada HPF tomado. La densidad vascular es el número medio de canales vasculares UEA-I+ contados por área de HPF (vasos/mm2).

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Representative Results

Este protocolo describe el proceso de generación de un modelo de xenoinjerto murino de VM basado en la inyección subcutánea de EC derivada del paciente en la parte posterior de ratones desnudos inmunodeficientes. Las colonias celulares endoteliales se pueden cosechar dentro de las 4 semanas posteriores al aislamiento celular inicial del tejido VM o de la sangre lesional(Figura 1A, B). Al día siguiente de la inyección, el tapón de la lesión de xenoinjerto cubre una superficie de aproximadamente 80-u2012100 mm2. En nuestras manos, los tapones de lesiones con EC TIE2/PIK3CA-mutante se vascularizan visiblemente y se perfunde dentro de los 7-u20129 días a partir de la inyección 14,15 (Figura 1C-E). Sin embargo, el grado de crecimiento de la lesión es variable y se refleja en la heterogeneidad del paciente y de la muestra.

Los tapones de lesiones recapitulan estrechamente las características histopatológicas del tejido humano VM: canales vasculares agrandados forrados por una fina capa de células endoteliales(Figura 1F-u2012H). Estas estructuras vasculares suelen contener eritrocitos, confirmando anastomosas funcionales con la vasculatura del ratón huésped (Figura 1F-u2012H). La tinción inmunohistoquímica utilizando la lectina específica humana UEA-I puede confirmar que las células que recubren las lesiones vasculares se derivan de células implantadas en humanos en lugar de vasculatura de ratón (Figura 1H). En la Figura 2se presenta un esquema que resume los pasos del aislamiento VM-EC a la disección del enchufe de lesiones.

Figure 1
Figura 1: Resultados representativos.
(A) Imagen representativa del cultivo celular mixto primario tres semanas después del aislamiento del tejido VM antes de la selección de la CE. Colonia típica de células endoteliales (EC) y fibroblastos contaminantes (FB). (B) Imagen de un cultivo celular endotelial purificado (CD31 de selección de cuentas) a partir del tejido derivado del paciente VM. Barra de escala a 200 m. (C) La lesión formará una estructura esférica. La vascularización es visible debido al color azulado a través de la piel de los ratones desnudos. (D) Las líneas discontinuas muestran cómo se recodifica el tamaño de la lesión midiendo la longitud (L) y la anchura (W) utilizando una pinza. (E) Foto de la explant de lesiones de xenoinjerto visiblemente vascularizada en el día 9. Barra de escala a 1 cm. (F) Imagen representativa de una sección de tapón de lesión. El patrón de plano x en el que se toman cinco imágenes de campo de alta potencia para la cuantificación se indican mediante cuadros discontinuos blancos. Barra de escala: 1000 m. (G-u2012H) Imágenes representativas de las secciones del enchufe de lesiones de VM. (G) Tinción de hematoxilina y eosina y (H) inmunohistoquímica de lectina específica para humanos UEA-I. Barra de escala a 100 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Esquema del flujo de trabajo para generar un xenoinjerto derivado del paciente de la máquina virtual.
(A) Las células endoteliales aisladas de la lesión VM del paciente se vajillan tejido sólido o sangre lesional y, cuando se alcanza el 80% de confluencia, se seleccionan por perlas inmunomagnéticas anticlamadas de CD31 y se expanden. (B) Para la inyección subcutánea de EC, el día 0, la piel en la parte posterior del ratón se pellizca utilizando el dedo índice y el pulgar para crear una estructura similar a una tienda de campaña. Las lesiones se miden en el día 1 y luego cada dos días (flechas rojas) usando una pinza hasta el día experimental 9. Las lesiones se diseccionan y se procesan para el análisis histológico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Aquí, describimos un método para generar un modelo de xenoinjerto derivado del paciente de VM. Este modelo murino presenta un excelente sistema que permite a los investigadores obtener una comprensión más profunda de la agrandación patológica del lumen y será fundamental en el desarrollo de terapias más eficaces y dirigidas para el tratamiento de la VM. Esto se puede adaptar fácilmente para investigar otros tipos de anomalías vasculares como la malformación venosa linfática capilar16. Hay varios pasos que son cruciales para la generación exitosa de lesiones vasculares reproducibles. En primer lugar, las células endoteliales derivadas del paciente deben ser puras (sin la presencia de otros tipos de células) y crecer exponencialmente en el momento de la inyección. El fibroblasto contaminante u otro mesenquimal no EC puede ser fácilmente reconocido por morfología alargada. En raras ocasiones, es posible que incluso después de la purificación utilizando perlas magnéticas conjugadas con anticuerpos anti-CD31, un pequeño número de no EC permanezcan en el cultivo. Estos cultivos requieren una mayor purificación con marcadores de superficie celular específicos endoteliales. Como enfoque alternativo, es posible la expansión clonal de células monocelales de las células endoteliales. Esto reaseguraría la homogeneidad de mutante-EC, ya que todas las células dentro de un cultivo derivarían de una sola célula. Sin embargo, este enfoque no se recomienda para EC derivadas de máquinas virtuales, ya que las células tienden a superar sus capacidades de proliferación y convertirse en un fenotipo senescente después de los pasajes 9-u201210. Es fundamental utilizar células entre los pasajes 3-u20128 para experimentos de xenoinjerto y no pasar células el día antes de la inyección.

El modelo de xenoinjerto se puede modificar para investigar otras anomalías vasculares portadoras de diferentes mutaciones activadoras. Además, dado que las muestras de tejido del paciente son de difícil acceso para algunos laboratorios, el modelo de xenoinjerto se puede adaptar mediante el uso de EC, como las células endoteliales de sangre del cordón umbilical humano (HUVEC), genéticamente diseñadas para expresar la mutación/s que se sabe que causan el crecimiento vascular disfuncional15,,17.

El número de células recomendadas para la inyección en el xenoinjerto es de 2,5 x 106 células/200 l de BMEM. Sin embargo, si el número de célula es insuficiente, es posible reducir el número de inyecciones por animal a uno o reducir el volumen de inyección a un mínimo de 100 l. Sin embargo, para este último, es importante mantener la relación de densidad celular, por ejemplo, 1,25 x 106 células/100 l de BMEM. Cuando se trabaja con BMEM, todos los pasos deben realizarse sobre hielo para evitar la solidificación de la suspensión celular antes de la inyección. Durante la inyección, es importante y que la aguja se inserta en un ángulo de 45o directamente debajo de la piel y lejos del tejido muscular, ya que la inyección en el músculo impide la reproducibilidad de la lesión y dificulta la disección de la lesión. Se pueden realizar un total de dos inyecciones en cada ratón: una a la derecha y otra en el lado izquierdo de cada animal. La segunda inyección en el mismo ratón puede servir como una réplica técnica. No se recomiendan más inyecciones en la espalda ya que las lesiones crecen con el tiempo y podrían interferir entre sí. Para el análisis estadístico en estudios preclínicos que comparan tapones de xenoinjerto de ratones tratados con ratones no tratados (solo vehículo), recomendamos el uso de un mínimo de 5 animales (10 tapones de xenoinjerto) por grupo de estudio. Si está disponible, la segunda inyección podría utilizarse alternativamente como un «control interno» utilizando CE no mutante. Hemos utilizado EC primaria no mutante, como HUVEC, como un control y hemos demostrado que estas células formaron un número insignificante de canales pequeños14,,15. Además, en estos tapones de lesiones de control HUVEC, hemos notado la infiltración de canales vasculares derivados de murino en el enchufe después del día 9. Si el diseño experimental requiere tiempos de incubación más largos, estos canales de infiltración pueden excluirse fácilmente del análisis tinndo para un marcador específico para el ser humano, como un anticuerpo CD31 específico para el ser humano o Ulex europaeus agglutinin I (UEA-I) que no reacciona con el ratón.

Para asegurarse de que la lesión no se convierta en una carga para la salud y el bienestar de los animales, es importante observar el tamaño de la lesión, registrar el peso del ratón diariamente y prestar atención a cualquier complicación lateral como sangrado y hematomas. Si el volumen de la lesión supera los 500 mm3,el experimento debe terminarse.

Cuando las lesiones vasculares se agrandan y se perfunden, se debe prestar una atención extrema durante la disección para evitar la rotura de la lesión. Es importante evitar tocar el tapón de la lesión con herramientas de disección y dejar el tejido circundante excesivo (como la piel) unido al tapón. Esto evita el colapso de las estructuras vasculares dentro del tapón de xenoinjerto que interferiría con el análisis preciso.

Por último, para mantener la coherencia, es importante que el análisis histológico inicial comience en el centro del tapón (alrededor de 50-u201270 m en el tejido) en lugar de las regiones fronterizas donde la vasculatura anastomosante del ratón podría estar presente. Se recomienda encarecidamente manchar las secciones tisulares con un marcador CE específico para el ser humano, como UEA-I o un anticuerpo alternativo específico para el ser humano que no reaccione con el ratón, con el fin de confirmar que las estructuras vasculares están formadas por EC de origen humano en lugar de invadir la EC de ratón.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Acknowledgments

Los autores quieren agradecer a Nora Lakes por su corrección. La investigación reportada en este manuscrito fue apoyada por el Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre, bajo el Premio R01 HL117952 (E.B.), parte de los Institutos Nacionales de Salud. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Athymic nude mice, (Foxn1-nu); 5-6 weeks, males Envigo 069(nu)/070(nu/+) Subcutaneous injection
Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I) Vector Laboratories B-1065 Histological anlaysis
Bottle top filter (500 ml; 0.2 µM) Thermo Fisher 974106 Cell culture
Bovine Serum Albumin (BSA) BSA A7906-50MG Cell culture; Histological analysis
Calcium cloride dihydrate (CaCl2.2H2O) Sigma C7902-500G Cell culture
Caliper Electron Microscopy Sciences 50996491 Lesion plug measurment
CD31-conjugated magnetic beads (Dynabeads) Life Technologies 11155D EC separation
Cell strainer (100 μM) Greiner 542000 Cell culture
Collagenase A Roche 10103578001 Cell culture
Conical Tube; polypropylene (15 mL) Greiner 07 000 241 Cell culture
Conical Tube; polypropylene (50 mL) Greiner 07 000 239 Cell culture
Coplin staining jar Ted Pella 21029 Histological anlaysis
Coverglass (50 X 22 mm) Fisher Scientific 12545E Histological anlaysis
DAB: 3,3'Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB) Vector Laboratories SK-4105 Histological anlaysis
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) Corning 10-027-CV Cell culture
DynaMag-2 Life Technologies 12321D EC separation
Ear punch VWR 10806-286 Subcutaneous injection
EDTA (0.5M, pH 8.0) Life Technologies 15575-020 Histological anlaysis
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (basal medium and supplements) Lonza CC-3162 Cell culture
Eosin Y (alcohol-based) Thermo Scientific 71211 Histological anlaysis
Ethanol Decon Labs 2716 Histological anlaysis
Fetal Bovine Serum (FBS) , HyClone GE Healthcare SH30910.03 Cell culture
Filter tip 1,250 μL MidSci AV1250-H Multiple steps
Filter tip 20 μL VWR 10017-064 Multiple steps
Filter tip 200 μL VWR 10017-068 Multiple steps
Formalin buffered solution (10%) Sigma F04586 Lesion plug dissection
Hemacytometer (INCYTO; Disposable) SKC FILMS DHCN015 Cell culture
Hematoxylin Vector Hematoxylin H-3401 Histological anlaysis
Human plasma fibronectin purified protein (1mg/mL) Sigma FC010-10MG Cell culture
Hydrogen Peroxide solution (30% w/w) Sigma H1009 Histological anlaysis
ImageJ Software Analysis
Isoflurane, USP Akorn Animal Health 59399-106-01 Subcutaneous injection
magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) Sigma M1880-500G Cell culture
Basement Membrane Matrix (Phenol Red-Free; LDEV-free) Corning 356237 Subcutaneous injection
Microcentrifuge tube (1.5 mL) VWR 87003-294 EC separation
Microscope Slide Superfrost (75mm X 25mm) Fisher Scientific 1255015-CS Histological anlaysis
Needles, 26G x 5/8 inch Sub-Q sterile needles Becton Dickinson (BD) BD305115 Subcutaneous injection
Normal horse serum Vector Laboratories S-2000 Histological anlaysis
Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine (100X) Corning 30-009-CI Cell culture
Permanent mounting medium (VectaMount) Vector Laboratories H-5000 Histological anlaysis
Pestle Size C, Plain Thomas Scientific 3431F55 EC isolation
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific BP3994 Cell culture
Scale VWR 65500-202 Subcutaneous injection
Serological pipettes (10 ml) VWR 89130-898 Cell culture
Serological pipettes (5ml) VWR 89130-896 Cell culture
Sodium carbonate (Na2CO3) Sigma 223530 Cell culture
Streptavidin, Horseradish Peroxidase, Concentrate, for IHC Vector Laboratories SA-5004 Cell culture
Syringe (60ml) BD Biosciences 309653 Cel culture
SYRINGE FILTER (0.2 µM) Corning 431219 Cell culture
Syringes (1 mL with Luer Lock) Becton Dickinson (BD) BD-309628 Subcutaneous injection
Tissue culture-treated plate (100 X 20 mm) Greiner 664160 Cell culture
Tissue culture-treated plate (145X20 mm) Greiner 639160 Cell culture
Tissue culture-treated plates (60 X 15) mm Eppendorf 30701119 Cell culture
Tris-base (Trizma base) Sigma T6066 Histological anlaysis
Trypan Blue Solution (0.4 %) Life Technologies 15250061 Cell culture
Trypsin EDTA, 1X (0.05% Trypsin/0.53mM EDTA) Corning 25-052-Cl Cell culture
Tween-20 Biorad 170-6531 Histological anlaysis
Wheaton bottle VWR 16159-798 Cell culture
Xylenes Fisher Scientific X3P-1GAL Histological anlaysis

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References

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Biología del desarrollo Número 160 Malformación venosa xenoinjerto células endoteliales TIE2 PIK3CA lesión vascular
Un modelo de xenoinjerto derivado del paciente para la malformación venosa
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Schrenk, S., Goines, J., Boscolo, E. … More

Schrenk, S., Goines, J., Boscolo, E. A Patient-Derived Xenograft Model for Venous Malformation. J. Vis. Exp. (160), e61501, doi:10.3791/61501 (2020).

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